誘導花生不定芽的方法
2023-12-08 16:00:31 2
專利名稱：誘導花生不定芽的方法
技術領域：
本發明涉及一種組織培養誘導花生叢生芽的方法，特別是涉及一種高效誘導花生不定 芽的方法，屬於生物技術領域。
背景技術：
花生是一種重要的油料作物和經濟作物，在我國種植面積較大。提高花生的產量、質 量，離不開優良品種，花生組織培養是利用生物技術進行花生育種的一個重要環節。目前，有些作物建立起了高效的植株再生體系，篩選出高誘導率基因型(如水稻的 日本晴，中華11)，但大多數作物的植株再生率仍很低(1%-30%)，成為限制基因工程技術應 用的瓶頸。目前花生叢生芽誘導率報導的平均不超過50%，且穩定性和重複性差。花生高效 再生體系的建立是花生基因轉化的基礎。植株再生受基因型影響很大，同時也和外植體類 型及培養基配方有關。細胞分裂素在組織培養誘導芽再生中比較有效，BA和TDZ在多種作
發明內容
本發明要解決的技術問題提供一種誘導率高、穩定性高、重複性好的組織培養誘導花 生不定芽的方法。本發明的技術方案
一種誘導花生不定芽的方法，包括如下步驟
(1)種子預培養選取成熟的豫花1號花生種子，先用70%乙醇浸潤20-30S，然後用 0. 1%的HgCl2溶液消毒8-lOmin，用無菌水衝洗5飛次，然後在無菌水中浸泡2 3h，將花生 種皮去掉，再去掉一片子葉，將剩下帶有胚芽的另一半子葉接種於不添加激素的MS培養基 中培養，培養溫度25 26°C，光照時間12-14h/d，光照強度1000-2000 Ix,培養4天；
(2)外植體製備將培養後的花生子葉掰掉，夾緊胚軸，用無菌刀片將花生幼葉從基部 切下，將幼葉橫切，平均分成三份，或從近葉柄1/3處一分為二，得到外植體；
(3)誘導和分化將外植體接種在誘導培養基中培養，培養溫度為25 26°C、光照時間 12-14h/d，光照強度1000-2000 lx，培養7-8天後外植體邊緣出現綠色芽點，轉到繼代培養 基中，再培養18-22天獲得誘導芽。所述誘導培養基為MS+BA 3 mg/L +NAA 0. 4 - 0. 8 mg/L +TDZ 0. 1 - 0. 3 mg/ L +AgNO3 3. 5 mg/L ο所述繼代培養基為MS +BA 5 mg/L +NAA lmg/L +AgNO3 3. 5 mg/L。本發明的有益效果
(1)本發明通過嚴格篩選，選出基因型豫花1號作為外植體，經過種子預培養、外植體 製備和誘導、分化等環節，得到花生不定芽，比目前文獻報導的花生叢生芽的誘導率高，經 多次接種試驗證明，誘導率結果穩定，重複性較好。(2)本發明優化了芽誘導培養基配方，使外植體萌發不定芽的時間大大提前，萌發 時間從原來的14天左右，提前到7-8天。(3)本發明方法可獲得穩定的高誘導率，豫花1號在三種不同的培養基上培養(MS +BA 3 mg/L +NAA 0. 4 mg/L +TDZ 0. 3 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L ；MS +BA 3 mg/L +NAA 0. 8mg/L +TDZ 0. 1 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L ；MS +BA 3 mg/L +NAAO. 8 mg/L +TDZ 0. 3 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L)，芽誘導率穩定在 90% 以上，分別為 91. 6 92. 5%,97. 5 98. 5%,99. 5 100%。而同樣條件下開農49、開農30、豫花15號在MS +BA 3 mg/L +ΝΑΑ0. 8 mg/ L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO3 3.5 mg/L培養基上培養，其不定芽誘導率分別為51. 2 52. 6%、 31. 8^33. 5%,36. 8^38. 5%。可看出，豫花1號作為外植體時的不定芽誘導率比其他品種優勢 明顯。
圖 1 豫花 1 號外植體在 MS +BA 3 mg/L +NAAO· 8 mg/L +TDZ 0. 3 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L培養基上誘導不定芽情況。圖中外植體切口邊緣的綠色突起為誘導產生的不定芽。圖 2:開農 49 (對照)外植體在 MS +BA 3 mg/L +NAAO· 8 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO3 3.5 mg/L培養基上誘導不定芽情況。圖中外植體切口邊緣的綠色突起為誘導產生 的不定芽，黃、白色為愈傷組織。從圖1、2可以看出，在相同的培養基和培養條件下，豫花1號外植體的芽點多而且 長勢旺；開農49 (對照)外植體芽點較稀少，而且外植體邊緣產生白色的疏鬆愈傷組織，說 明豫花1號和開農49基因型間的芽誘導率存在顯著差異。圖3 豫花15號(對照)在三種不同的培養基上的外植體誘導不定芽對照圖圖中 外植體切口邊緣的綠色突起為誘導產生的不定芽，黃、白色為愈傷組織。圖中(1)培養基為MS +BA 3 mg/L +NAAO· 8 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO3 3.5 mg/ L ； (2)培養基為 MS +BA 3 mg/L +NAA 0.8 mg/L +TDZ 0.1 mg/L +AgNO3 3.5 mg/ L ；(3) 培養基為 MS +BA 3 mg/L +NAA 0. 4 mg/L +TDZ 0. 3 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L。從圖3可看出，同一基因型(豫花15號)在不同培養基上，不定芽的誘導反應不同。 圖中(2)和(3)較(1)誘導出較多愈傷組織，但不定芽誘導率均較低，誘導率不足40%。
具體實施例方式
以下結合實施例詳細說明本發明，其中出現的百分比濃度如無特別說明，均指質量百 分比濃度。實施例1 誘導花生不定芽的方法，包括如下步驟
1、種子預培養選取顆粒飽滿、較大、表面無裂痕、沒有出胚芽的豫花1號成熟種子，用 鑷子加入無菌三角瓶中，先用70%乙醇浸潤30s，再用0. 1%的HgCl2溶液消毒8min，用無菌 水衝洗5飛次，然後在無菌水中浸泡2 3h，待花生種皮舒展之後，在超淨工作檯上用鑷子將 花生種皮去掉，再去掉一片子葉，將剩下帶有胚芽的另一半子葉接種於裝有MStl (MS培養基 不添加任何激素)培養基的無菌罐頭瓶中，置光照培養室中，在25°C、光照強度為20001x，光 照14h/d條件下培養4天；
2、製備外植體用鑷子將花生的子葉掰掉，之後夾緊胚軸，再用無菌刀片將花生幼葉從 基部切下，將幼葉近葉柄部1/3處一分為二 ；
3、誘導和分化將外植體分別接種在誘導培養基中，芽誘導培養基為MS+BA 3 mg/L +NAA 0.8 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO3 3.5 mg/L，置光照培養室 25°C、光照強度為 20001x， 光照14h/d條件下培養，經過7-8天，部分外植體切口邊緣可見綠色芽點出現；14天左右， 所有外植體邊緣均出現大量綠色芽點。兩周後，轉到繼代培養基中，使芽點進一步分化，繼代培養基為MS +BA 5 mg/L +NAA lmg/L +AgNO3 3.5 mg/L，再培養18天得到誘導花生不定芽。經統計，誘導率達到
100% ο實施例2 誘導花生不定芽的方法
種子預培養選取顆粒飽滿、較大、表面無裂痕、沒有出胚芽的豫花1號成熟種子，用鑷 子加入無菌三角瓶中，先用70%乙醇浸潤20s，再用0. l%HgCl2溶液消毒lOmin，用無菌水衝 洗5飛次，然後在無菌水中浸泡2 3h，待花生種皮舒展之後，在超淨工作檯上用鑷子將花生 種皮去掉，再去掉一片子葉，將剩下帶有胚芽的另一半子葉接種於裝有MStl (MS培養基不添 加任何激素)培養基的無菌罐頭瓶中。置光照培養室中，在26°C、光照強度為1500 lx，光照 12h/d條件下培養4天。製備外植體用鑷子將花生的子葉掰掉，之後夾緊胚軸，再用無菌刀片將花生幼葉 從基部切下，將幼葉橫切平均一分為三。誘導和分化將外植體分別接種在誘導培養基上MS +BA 3 mg/L +NAA 0. 8 mg/L +TDZ 0. 1 mg/L +AgNO3 3.5 mg/L，置光照培養室26°C、光照強度為1500 lx，光照12h/d條 件下培養，經過7-8天，部分外植體切口邊緣可見綠色芽點出現；14天左右，幾乎外植體邊 緣均出現大量綠色芽點。兩周後，轉到繼代培養基上，繼代培養基為MS +BA 5 mg/L +NAA lmg/L +AgNO3 3.5 mg/L，使芽點進一步分化，再培養22天得到誘導花生不定芽。經統計， 誘導率為97. 5%。實施例3 同實施例1基本相同，不同之處在於 培養室條件26°C、光照強度1000 lx，光照13h/d ；
芽誘導培養基:MS +BA 3 mg/L +NAA 0.4 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO3 3.5 mg/L，誘 導率為91. 6%ο說明書摘要
本發明涉及一種高效誘導花生不定芽的方法，包括選取成熟的豫花1號花生種子，先 用70%乙醇浸潤，然後用0. 1%的HgCl2溶液消毒，用無菌水衝洗，然後在無菌水中浸泡，將剩 下帶有胚芽的另一半子葉接種於不添加激素的MS培養基中培養，培養4天；將培養後的幼 葉橫切，平均分成三份，得到外植體；誘導和分化，將外植體接種在誘導培養基中培養7-8 天后外植體邊緣出現綠色芽點，轉到繼代培養基中，再培養18-22天獲得誘導芽。本發明選 出基因型豫花1號作為外植體得到花生不定芽，優化了芽誘導培養基配方，經多次接種試 驗證明，芽誘導率穩定在90%以上，重複性好。
權利要求
一種誘導花生不定芽的方法，其特徵在於該方法包括如下步驟(1)種子預培養 選取成熟的豫花1號花生種子，先用70%乙醇浸潤20 30s，然後用0.1%的HgCl2溶液消毒8 10min，用無菌水衝洗5~6次，然後在無菌水中浸泡2~3h，將花生種皮去掉，再去掉一片子葉，將剩下帶有胚芽的另一半子葉接種於不添加激素的MS培養基中培養，培養溫度25~26℃，光照時間12 14h/d，光照強度1000 2000 lx，培養4天；(2)外植體製備 將培養後的花生子葉掰掉，夾緊胚軸，用無菌刀片將花生幼葉從基部切下，將幼葉橫切，平均分成三份，或從近葉柄1/3處一分為二，得到外植體；(3)誘導和分化 將外植體接種在誘導培養基中培養，培養溫度為25~26℃、光照時間12 14h/d，光照強度1000 2000 lx，培養7 8天後外植體邊緣出現綠色芽點，轉到繼代培養基中，再培養18 22天獲得誘導芽。
2.根據權利要求1所述的誘導花生不定芽的方法，其特徵在於所述誘導培養基為MS +BA 3 mg/L +NAA 0. 4 - 0. 8 mg/L +TDZ 0. 1 - 0. 3 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L。
3.根據權利要求1或2所述的誘導花生不定芽的方法，其特徵在於所述繼代培養基 為 MS +BA 5 mg/L +NAA lmg/L +AgNO3 3. 5 mg/L。全文摘要
本發明涉及一種高效誘導花生不定芽的方法，包括選取成熟的豫花1號花生種子，先用70%乙醇浸潤，然後用0.1%的HgCl2溶液消毒，用無菌水衝洗，然後在無菌水中浸泡，將剩下帶有胚芽的另一半子葉接種於不添加激素的MS培養基中培養，培養4天；將培養後的幼葉橫切，平均分成三份，得到外植體；誘導和分化，將外植體接種在誘導培養基中培養7-8天後外植體邊緣出現綠色芽點，轉到繼代培養基中，再培養18-22天獲得誘導芽。本發明選出基因型豫花1號作為外植體得到花生不定芽，優化了芽誘導培養基配方，經多次接種試驗證明，芽誘導率穩定在90%以上，重複性好。
文檔編號A01H4/00GK101960988SQ20101029825
公開日2011年2月2日 申請日期2010年9月30日 優先權日2010年9月30日
發明者張新友, 湯豐收, 苗利娟, 董文召, 高偉, 黃冰豔 申請人:河南省農業科學院