唾液預處理試劑盒及唾液預處理方法

2023-12-09 04:43:21

專利名稱：唾液預處理試劑盒及唾液預處理方法
技術領域：
本發明涉及通過利用抗原抗體反應的免疫層析法，用於鑑定和定量測定作為人唾液中存在的致齲細菌之一的變異鏈球菌(Streptococcimutans)的唾液預處理試劑盒，以及使用該唾液預處理試劑盒的唾液預處理方法。
背景技術：
已知人口腔內的變異鏈球菌的存在與齲齒的產生間有密切的關係，因此，如果可以簡便地檢查人口腔內變異鏈球菌的有無以及量，則可以了解患病風險和目前的患病狀況，為相當多的人帶來益處。
以住是實施在檢查中利用抗原抗體反應的檢查技術。例如，免疫酶技術，這是使用酶以發色濃度進行鑑定和定量測定的方法，為處理抗體和試樣需要特殊的洗滌器和複雜精確的操作，並且為進行酶反應還需要溫育器。另外，螢光抗體技術作為一種對與用螢光染料標記的抗體反應的抗原特異染色的方法不常使用，原因是需要螢光顯微鏡作為測定器。
因此，提出了多種簡便地利用抗原抗體反應的技術。例如，利用層析法的測定技術(例如參照美國專利5,591,645號、4,855,240號、4,435,504號和4,980,298號，和日本專利申請JP-A-61-145459和JP-A-6-160388號公報)。該技術簡便性優異，因為抗原的有無及量僅通過在含有要鑑定和定量測定的抗原的試驗溶液中混入這樣採集的體液，然後滲入檢查器具中即可測定。該技術一般稱為免疫層析技術，鑑定和定量測定的原理已有詳細揭示(例如參照，Se-Hwan Peak，Seung-Hwa Lee，Joung-Hawan Cho和Young-Sang Kim，「Development ofrapid One-Step immunochromatographic assay，Methods」，22卷，53-60頁(2000))。
看起來人口腔內的變異鏈球菌的鑑定和定量測定可以通過應用該技術實施，但由於存在下列問題該技術還沒有投入實際應用。即，免疫層析技術使用的試樣需要通過毛細管現象通過多孔膜。但是，由於變異鏈球菌這樣的口腔細菌檢查應用的主要試樣是唾液，因此唾液中存在的稱為粘蛋白的高粘性物質會阻塞多孔膜的孔。另外，由於粘蛋白具有將從口腔黏膜剝落的上皮附著細胞聚集的功能，所以多孔膜的孔被這些物質阻塞，從而阻礙了變異鏈球菌的通過。
除粘蛋白外，存在的另外一個問題是免疫層析技術把變異鏈球菌的鑑定和定量測定變得複雜。即，要測定的變異鏈球菌是自體直徑約1μm的細菌，但由於鏈球菌的性質，經常形成由10-20個或更多個細菌構成的鏈，這可能是妨礙在多孔膜中移動的因素之一。另外，變異鏈球菌從食物中的蔗糖形成具有粘著性的葡聚糖，並且經常嚴重聚集。變異鏈球菌的鏈形成和聚集造成多孔膜中的阻塞，另外減少了鏈球菌的表面積，對變異鏈球菌表面存在的抗原數的定量測定產生影響，這降低了測定的準確性。
在免疫層析技術中，一般通過使用兩個抗體進行分析對象的檢測。第一抗體保持在由試樣滴下那一側的玻璃纖維等形成的多孔膜中，並且抗體一般用乳膠顆粒、金膠體顆粒等進行標記(以下有時稱為標記抗體)。試樣中存在要測定的對象時，當試樣通過多孔膜時標記抗體識別要測定的分析對象並與其結合。分析對象與標記抗體的複合體通過毛細管現象向以例如帶狀固定有第二抗體(以下有時稱為捕捉抗體)的另一多孔膜流動，並且識別、捕捉分析對象與標記抗體的複合體，並作為可見信號(此時呈帶狀)被檢測出來。但是，免疫層析技術應用於作為試樣的唾液時，標記抗體與變異鏈球菌的複合體被捕捉在保持標記抗體的膜中，但不能通過毛細管現象向固定有捕捉抗體的多孔膜有效流動，引起測定的準確性下降的問題。

發明內容
本發明的目的是通過利用抗原抗體反應的免疫層析法解決與鑑定和定量測定作為人唾液中的致齲細菌之一的變異鏈球菌的常規技術相關的問題，以及提供唾液預處理試劑盒及唾液預處理方法，其中可以以簡便的操作消除由粘蛋白及變異鏈球菌的鏈形成引起的聚集，並且標記抗體與變異鏈球菌的複合體可以有效地從保持標記抗體的膜中流出。
本發明人為解決上述課題進行了認真的研究，結果發現，通過用特定的酸和鹼溶液進行處理可以得到下面的效果，從而完成了本發明。
(1)唾液中的粘蛋白和葡聚糖溶解，作用於變異鏈球菌的外膜，從而抑制聚集。
(2)而且，通過使用特定的表面活性劑，變異鏈球菌中的蛋白質被增溶，從而變異鏈球菌可有效地流過多孔膜。
(3)此外，通過使用特定的金屬鹽，即氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂或硫酸錳，標記抗體與變異鏈球菌的複合體可以有效地從保持標記抗體的膜中流出。
一方面，本發明涉及唾液預處理試劑盒，含有(A)氫氧化鈉水溶液，濃度為0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或檸檬酸的水溶液，濃度為0.01-3mol/L，和(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑，成分(C)與成分(A)和(B)的至少一個混合，或與成分(A)和(B)分別提供，並且選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質以5-25重量％的量包含在成分(A)、(B)和(C)的至少一個中。該方面中優選(D)三(羥甲基)氨基甲烷與成分(A)、(B)和(C)的至少一個混合。
另一方面，本發明還涉及唾液預處理試劑盒，含有(A)氫氧化鈉水溶液，濃度為0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或檸檬酸的水溶液，濃度為0.01-3mol/L，(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑，和(D)含有三(羥甲基)氨基甲烷的水溶液，成分(C)與成分(A)、(B)和(D)的至少一個混合，或與成分(A)、(B)和(D)分別提供，並且選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質以5-25重量％的量包含在成分(A)、(B)、(C)和(D)的至少一個中。
具體實施例方式
在本發明的唾液預處理試劑盒中，優選作為成分(C)的非離子表面活性劑是選自聚乙二醇單辛基苯基醚、正辛基-β-D-葡糖苷、正庚基-β-D-硫葡糖苷、正辛基-β-D-硫葡糖苷、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(nonylphenoxypolyethoxyethanol)和聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯的一種、或兩種以上的混合物，以及作為成分(C)的兩性表面活性劑為選自CHAPS(3-((3-膽醯胺丙基)-二甲基銨基)-1-丙烷磺酸鹽)和CHAPSO(3-((3-膽醯胺丙基)-二甲基銨基)-1-羥基丙烷磺酸鹽)的一種、或兩種以上的混合物。
一方面，通過利用本發明的唾液預處理試劑盒的免疫層析法鑑定和定量測定變異鏈球菌的唾液預處理方法包括下面的步驟將選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質以5-25重量％的量與選自下述(A)、(B)和(C)的至少一個混合(A)氫氧化鈉水溶液，濃度為0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或檸檬酸的水溶液，濃度為0.01-3mol/L，和(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑；和通過以任意順序滴下成分(A)、(B)和(C)將它們混合(以下稱為第一方法)。
另一方面，通過免疫層析法鑑定和定量測定變異鏈球菌的唾液預處理方法也包括下面的步驟將選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質以5-25重量％的量與選自下述(A)和(B)的至少一個混合(A)氫氧化鈉水溶液，濃度為0.01-10mol/L和(B)酒石酸和/或檸檬酸的水溶液，濃度為0.01-3mol/L；將(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑混入(A)和(B)的至少一個中；和通過以任意順序滴下成分(A)和(B)將它們混合(以下稱為第二方法)。
另一方面，通過免疫層析法鑑定和定量測定變異鏈球菌的唾液預處理方法包括下面的步驟將選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質以5-25重量％的量與選自下述(A)、(B)、(C)和(D)的至少一個混合(A)氫氧化鈉水溶液，濃度為0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或檸檬酸的水溶液，濃度為0.01-3mol/L，(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑，和(D)三(羥甲基)氨基甲烷；和通過以成分(A)與成分(B)在成分(D)的存在下接觸的順序滴下成分(A)、(B)、(C)和(D)，將它們混合(以下稱為第三方法)。
在第一方法中，優選將(D)三(羥甲基)氨基甲烷混入成分(A)、(B)和(C)的至少一個中，並且通過以成分(A)與成分(B)在成分(D)的存在下接觸的順序滴下成分(A)、(B)、和(C)，將它們混合。在第二方法中，優選將(D)三(羥甲基)氨基甲烷混入成分(A)和(B)的至少一個中，並通過以任意順序滴下成分(A)和(B)將它們混合。在第三方法中，優選通過以成分(A)與成分(B)在成分(D)的存在下接觸的順序滴下成分(A)、(B)和(D)(其中至少一個與成分(C)混合)，將它們混合。
作為成分(A)用於本發明的唾液預處理試劑盒和唾液預處理方法中的濃度為0.01-10mol/L的氫氧化鈉水溶液具有對唾液中的粘蛋白和存在於變異鏈球菌的外膜上的葡聚糖起作用，抑制變異鏈球菌聚集的功能，從而使作為抗原的變異鏈球菌在多孔膜中的移動變得容易。作為鹼溶液的氫氧化鈉的使用是必要的，但碳酸鈉、磷酸氫二鈉等不適合，使用氫氧化鈉以外的鹼溶液不能進行變異鏈球菌的檢查。推測這是由於氫氧化鈉以外的鹼溶液可能損害變異鏈球菌的抗原的結構。水溶液中氫氧化鈉的濃度為0.01-10mol/L是必要的，低於0.01mol/L的濃度不能得到充分的效果，而超過10mol/L時破壞變異鏈球菌的抗原，從而降低檢測精度。
作為成分(B)用於本發明的唾液預處理試劑盒和唾液預處理方法中的濃度為0.01-3mol/L的酒石酸和/或檸檬酸的水溶液具有抑制變異鏈球菌的鏈形成的功能，從而使作為抗原的變異鏈球菌在多孔膜中的移動變得容易。酒石酸和/或檸檬酸作為酸使用是必要的，但其它酸，如鹽酸、硫酸、硝酸、醋酸、乳酸和馬來酸是不適合的，並且即使其它酸與氫氧化鈉組合使用，也不能得到目標檢查精度。推測這是由於酒石酸和檸檬酸以外的酸可能損害變異鏈球菌的抗原的結構。水溶液中酒石酸和/或檸檬酸的濃度為0.01-3mol/L是必要的，低於0.01mol/L的濃度不能得到充分的效果，而超過3mol/L也不適合，原因是酒石酸和/或檸檬酸的溶解度到達了產生沉澱的極限。
作為成分(C)用於本發明的唾液預處理試劑盒和唾液預處理方法中非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑具有將變異鏈球菌表面的蛋白質增溶的功能，從而使變異鏈球菌有效通過多孔膜變得容易。離子表面活性劑經常用在免疫層析法中，用來促進試樣溶液或抗原溶液在檢查器內平滑移動。但是，實驗結果證明在本發明的用於鑑定和定量測定變異鏈球菌的唾液預處理試劑盒和唾液預處理方法中使用的表面活性劑必須為非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑，但是通過十二烷基硫酸鈉和十二烷基苯磺酸鈉等陰離子表面活性劑不能進行通過抗體檢測抗原。
本發明中使用的這樣的表面性活劑可以是任何非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑而沒有特別的限制，並且一般用作膜蛋白增溶劑的那些都可以使用。變異鏈球菌的檢測靈敏度隨使用的非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑的種類而變化，從檢測靈敏度的角度考慮，優選使用選自聚乙二醇單辛基苯基醚、正辛基-β-D-葡糖苷、正庚基-β-D-硫葡糖苷和正辛基-β-D-硫葡糖苷的一種、或兩種以上的混合物作為非離子表面活性劑，選自CHAPS(3-((3-膽醯胺丙基)-二甲基銨基)-1-丙烷磺酸鹽)和CHAPSO(3-((3-膽醯胺丙基)-二甲基銨基)-1-羥基丙烷磺酸鹽)的一種、或兩種以上的混合物作為兩性表面活性劑。
在本發明的唾液預處理試劑盒和唾液預處理方法中，非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑(C)以唾液處理後濃度為0.05-90重量％這樣的方式使用是優選的。濃度低於0.05重量％時，由於存在抗原抗體反應的檢測靈敏度降低的傾向因而不優選，當超過90重量％時，由於抗原抗體反應的檢測靈敏度容易降低也不優選。
在本發明的唾液預處理試劑盒和唾液預處理方法中，非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑(C)可以與(A)濃度為0.01-10mol/L的氫氧化鈉水溶液和(B)濃度為0.01-3mol/L的酒石酸和/或檸檬酸的水溶液分別提供，此時其可以是水溶液的形式。也可以以與(A)濃度為0.01-10mol/L的氫氧化鈉水溶液和(B)濃度為0.01-3mol/L的酒石酸和/或檸檬酸的水溶液之一或兩者的混合物的形式提供，此時酸和鹼分解性必須予以注意。
在本發明的唾液預處理試劑盒和唾液預處理方法中，在(A)濃度為0.01-10mol/L的氫氧化鈉水溶液、(B)濃度為0.01-3mol/L的酒石酸和/或檸檬酸的水溶液和(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑的至少一個中，以5-25重量％的量含有選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質，以使標記抗體與變異鏈球菌的複合體從保持標記抗體的膜中有效流出。選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質具有通過鹽析使唾液中存在的各種蛋白質聚集並抵消標記抗體與保持該抗體的膜間的相互作用的功能，從而通過該功能提供促進標記抗體與變異鏈球菌的複合體從保持標記抗體的膜中有效流出的效果。
選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質以5-25重量％的量包含在(A)濃度為0.01-10mol/L的氫氧化鈉水溶液、(B)濃度為0.01-3mol/L的酒石酸和/或檸檬酸的水溶液和(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑的至少一個中是必要的。該量低於5重量％時，不能得到充分的效果，並且標記抗體與變異鏈球菌的複合體不能有效地從保持標記抗體的膜中流出。另一方面，超過25重量％時，檢測靈敏度降低。
在本發明的唾液預處理試劑盒和唾液預處理方法中，由於(A)濃度為0.01-10mol/L的氫氧化鈉水溶液與(B)濃度為0.01-3mol/L的酒石酸和/或檸檬酸的水溶液之間發生中和反應，因此優選使用緩衝劑，並且為在中和反應中得到有效的緩衝作用，優選使用三(羥甲基)氨基甲烷作為緩衝劑。但是此時，已經確認通過其它緩衝劑如碳酸氫鈉與碳酸鈉的組合、以及檸檬酸與檸檬酸鈉的組合不能得到充分的緩衝作用。三(羥甲基)氨基甲烷可以與成分(A)、(B)和(C)中的一個混合，或者可以單獨提供，此時優選以水溶液的形式。在本發明的唾液預處理試劑盒中，(A)濃度為0.01-10mol/L的氫氧化鈉水溶液與(B)濃度為0.01-3mol/L的酒石酸和/或檸檬酸的水溶液因引起中和反應而必須單獨提供。
在本發明的第一方法中，通過免疫層析法對變異鏈球菌進行鑑定和定量測定時，選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質以5-25重量％的量與(A)、(B)和(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑的至少一個混合，然後通過以任意的順序滴下(A)濃度為0.01-10mol/L的氫氧化鈉水溶液、(B)濃度為0.01-3mol/L的酒石酸和/或檸檬酸的水溶液和(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑而將它們混合。為簡化本發明的第二方法的操作，將(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑與(A)濃度為0.01-10mol/L的氫氧化鈉水溶液及(B)濃度為0.01-3mol/L的酒石酸和/或檸檬酸的水溶液的至少一個預先混合，然後通過以任意順序滴下(A)濃度為0.01-10mol/L的氫氧化鈉水溶液和(B)濃度為0.01-3mol/L的酒石酸和/或檸檬酸的水溶液而將它們混合。
在本發明的唾液預處理方法中，由於(A)濃度為0.01-10mol/L的氫氧化鈉水溶液與(B)濃度為0.01-3mol/L的酒石酸和/或檸檬酸的水溶液之間發生中和反應，因此優選使用緩衝劑，並且為在中和反應中得到有效的緩衝作用，優選使用(D)三(羥甲基)氨基甲烷作為緩衝劑。儘管用成分(A)、(B)和(C)的處理因各成分的功能相互獨立而可以任意順序進行，但在唾液預處理試劑盒中含有(D)三(羥甲基)氨基甲烷時，為在成分(A)與成分(B)的中和反應中得到緩衝作用，成分(A)與成分(B)相互接觸在(D)三(羥甲基)氨基甲烷存在下進行是必要的。
除第一和第二方法外，在本發明的第三方法中，通過免疫層析法鑑定和定量測定變異鏈球菌時，選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質以5-25重量％的量與(A)濃度為0.01-10mol/L的氫氧化鈉水溶液、(B)濃度為0.01-3mol/L的酒石酸和/或檸檬酸的水溶液、(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑和(D)三(羥甲基)氨基甲烷的至少一個混合，然後通過以成分(A)與成分(B)在成分(D)存在下接觸的順序滴下成分(A)、(B)、(C)和(D)，將它們混合。此時優選通過以成分(A)與成分(B)在成分(D)存在下接觸的順序滴下成分(A)、(B)和(D)(其中至少一個與成分(C)混合)，將它們混合。
在本發明的唾液預處理方法中，處理優選以這樣的方式進行處理後的唾液的pH在5-9的範圍內，因為抗原抗體反應在該pH範圍內進行。儘管該範圍隨使用的抗體而變化，但當pH在該範圍以外時，由於抗體與抗原相互離開、並且它們具有非特異的親合力，故存在測定結果的可靠性下降的傾向。
可以通過使用常規的免疫層析技術的抗原抗體反應，對通過本發明的唾液預處理試劑盒及唾液預處理方法處理的唾液試樣進行變異鏈球菌的鑑定和定量測定。抗體可以通過通常使用的方法得到。例如，可以通過由Kohler和Milstein(Kohler G，C.Milstein，Continuous culturesof fused cells secreting antibody of predefined specificity，Nature，256卷，495-497頁(1976))的細胞融合建立雜交瘤得到，或可以使用那些從用抗原免疫的動物血清中簡單純化的那些。
實施例以下將參照實施例詳細說明本發明，但本發明不限於這些實施例。如果沒有特別指明，操作在室溫下進行，pH為在20-25℃下的pH。
(1)試劑和試驗裝置的準備1.抗體的製作通過使用BHI培養基(Brain Heart Infusion培養基，DIFCOLaboratories制)在37℃過夜，分別培養變異鏈球菌(ATCC 25175菌株)和遠緣鏈球菌(Streptococci sobrinus)(ATCC 33478菌株)。通過離心從培養液收集細菌細胞後，用PBS(10mmol磷酸鹽緩衝的鹽水)將其洗滌兩次，用甲醛水溶液終止生長。直接用細菌的分解液將小鼠免疫，然後通過使用Kohler和Milstein的細胞融合建立雜交瘤，得到下面所示的抗體各兩種。
SM1抗體抗變異鏈球菌抗體SM2抗體抗變異鏈球菌抗體SS1抗體抗遠緣鏈球菌抗體SS2抗體抗遠緣鏈球菌抗體2.抗體的金膠體標記用粒徑40nm的金膠體標記SM2抗體及SS2抗體。金膠體使用市售品(British Biocell International制)，並用含有1％牛血清清蛋白(BSA，商品名，Sigma-Aldrich Corp.制)、1％非離子表面活性劑(Tween-20，商品名，Sigma-Aldrich Corp.制)的PBS稀釋到抗體濃度為0.1μg/mL。用金膠體標記的抗體溶液分別稱為SM2標記抗體和SS2標記抗體。
3.抗體固定化的多孔膜條的製作使用用塑料薄膜(SXHF，商品名，Millipore Corp.Japan制)襯裡的硝化纖維素膜作為多孔膜。將該膜切成5mm×40mm的長方形。用含有1％牛血清清蛋白的50mmol磷酸鹽緩衝液將SM1抗體或SS1抗體稀釋成1mg/mL的濃度，並用微量移液管將抗體稀釋溶液在這樣切出的硝化纖維素膜的中央部沿與膜的縱向垂直的方向塗布，塗布量達到約1μL/cm。固定化的抗體有時分別稱為SM1捕捉抗體和SS1捕捉抗體。在該膜的一端用夾子固定15mm見方的濾紙作為吸水體，使互相緊密接觸。在與吸水體相對的膜的另一端用夾子固定5mm×20mm的聚丙烯基質(Quick Release Conjugate Pad，商品名，Millipore Corp.Japan制)作為保持標記抗體的多孔膜(以下稱為標記抗體保持體)，在它上面滴下30μL的SM2標記抗體溶液或SS2標記抗體溶液。將裝置在37℃乾燥2小時，然後在使用前保存在乾燥器中。
(2)變異鏈球菌的定量測定通過使用前述試劑和裝置的免疫層析法對唾液中的變異鏈球菌的定量測定結果與通過由菌落數計算的常規方法算出的唾液中的變異鏈球菌數進行比較。
1.通過免疫層析法進行的試驗方法變異鏈球菌與在抗體固定化的多孔膜條上固定化的抗體的反應性通過下面的原理檢測。唾液通過抗體固定化的多孔膜條的標記抗體保持體時，標記抗體與唾液中的變異鏈球菌結合，變為紅色。變異鏈球菌與標記抗體的複合體在抗體固定化的多孔膜條中移動，然後它被抗體固定化的多孔膜條上的以例如帶狀固定化的抗體(捕捉抗體)捕捉，從而作為帶狀痕跡被確認。
2.通過常規方法從菌落數計算變異鏈球菌數變異鏈球菌、遠緣鏈球菌和夾雜菌在MSB培養基上形成菌落。為準確測定它們的菌落數，測定在MSB培養基上形成的菌落數後，收集一部分菌落並破碎後，並用具有對變異鏈球菌或遠緣鏈球菌特異的序列的合成DNA引物進行PCR(聚合酶鏈反應)。用瓊脂凝膠對由此擴增的基因斷片進行電泳，以確認菌株。
實施例1使用這樣的抗體固定化的多孔膜條在其中央部將SM1抗體固定化，在另一端的標記抗體保持體中含有SM2標記抗體。通過下面的方式進行檢查。
讓被試驗者咀嚼收集唾液用的樹膠5分鐘，將唾液收集在試管中。這樣收集的一部分唾液用PBS稀釋並塗布在MSB培養基上。在37℃進行厭氧培養2或3天後，測定菌落數。測定後，收集一部分菌落。將細菌細胞破碎後，用具有對變異鏈球菌或遠緣鏈球菌特異的序列的合成DNA引物進行PCR(聚合酶鏈反應)，並用瓊脂凝膠對由此擴增的基因斷片進行電泳，以判別菌株。從作為判別結果的、確認為變異鏈球菌的菌落數計算細菌細胞數(CFU/mL)。
通過在含有1.0mol/L氫氧化鈉(成分(A))的含有1.0mol/L三(羥甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加23.3重量％氯化鈉準備溶液(AD溶液)。通過在含有0.5mol/L檸檬酸(成分(B))的含有1.0mol/L三(羥甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加5重量％作為非離子表面活性劑(成分(C))的聚乙二醇單辛基苯基醚(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制)準備溶液(BCD溶液)。
在250μL唾液中加入50μL AD溶液，然後攪拌。然後在其中加入100μL BCD溶液，然後攪拌。從這樣處理的唾液中取100μL，滴到標記抗體保持體一側的條上。這樣處理的溶液的pH為7.2。溶液中成分(C)的濃度為1.25重量％。滴下15分鐘後，確認了與捕捉抗體的反應，並且標記抗體保持體中殘留的SM2標記抗體與變異鏈球菌的複合體的量通過目視進行了觀察。
對5個被試驗者a～e進行前述試驗。這樣得到的結果如下表1所示。與抗體的反應性分四級評價，即，紅色帶可清楚確認(++)，紅色帶可確認(+)，紅色帶稍微可以確認(±)，以及不能確認帶(-)。標記抗體保持體中殘留的SM2標記抗體與變異鏈球菌的複合體的量(以下簡稱為殘留抗體量)通過目視進行了觀察，並分三級評價，即作為紅色在標記抗體保持體中確認大量殘留抗體(+)，稍微確認殘留抗體(±)，和無殘留抗體確認(-)。表中使用的單位CFU/mL是指每1mL唾液的細菌菌落數。
表1

實施例2使用除使用SS1捕捉抗體代替SM1捕捉抗體，SS2標記抗體代替SM2標記抗體外與實施例1同樣的抗體固定化的多孔膜條，以下面的方式進行試驗。
通過在含有1.0mol/L氫氧化鈉(成分(A))的溶液中添加25.0重量％氯化鈉準備溶液(A溶液)。通過在含有1.0mol/L三(羥甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加0.5mol/L檸檬酸(成分(B))準備溶液(BD溶液)。準備含有5重量％聚乙二醇單辛基苯基醚(Wako PureChemical Industries，Ltd.制)作為非離子表面活性劑(成分(C))的水溶液(C溶液)。
在250μL唾液中加入80μL BD溶液，然後攪拌。然後在其中加入50μL C溶液，然後攪拌。最後在其中加入40μL A溶液，然後攪拌。從這樣處理的唾液中取100μL，滴到標記抗體保持體一側的條上。這樣處理的溶液的pH為6.6。溶液中成分(C)的濃度為0.60重量％。滴下15分鐘後，確認了與捕捉抗體的反應，並且標記抗體保持體中殘留的SS2標記抗體與變異鏈球菌的複合體的量通過目視進行了觀察。
對5個被試驗者a～e進行前述試驗，並進行與實施例1同樣的評價。這樣得到的結果如下表2所示。
表2

實施例3使用與實施例1同樣的使用SM1捕捉抗體和SM2標記抗體的抗體固定化的多孔膜條，以下面的方式進行試驗。
通過在含有5重量％聚乙二醇單辛基苯基醚(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制)作為非離子表面活性劑(成分(C))的水溶液中添加1.0mol/L氫氧化鈉(成分(A))準備溶液(AC溶液)。通過在含有0.5mul/L檸檬酸(成分(B))的含有1.0mol/L三(羥甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加12.0重量％氯化鈉準備溶液(BD溶液)。
在250μL唾液中加入75μL AC溶液，然後攪拌。然後在其中加入75μL BD溶液，然後攪拌。從這樣處理的唾液中取100μL，滴到標記抗體保持體一側的條上。這樣處理的溶液的pH為7.5。溶液中成分(C)的濃度為0.94重量％。滴下15分鐘後，確認了與捕捉抗體的反應，並且標記抗體保持體中殘留的SM2標記抗體與變異鏈球菌的複合體的量通過目視進行了觀察。
對3個被試驗者a～c進行前述試驗，並進行與實施例1同樣的評價。這樣得到的結果如下表3所示。
表3

實施例4使用與實施例2同樣的使用SS1捕捉抗體和SS2標記抗體的抗體固定化的多孔膜條，以下面的方式進行試驗。
準備含有4.0mol/L氫氧化鈉(成分(A))的水溶液(A溶液)。準備含有1.0mol/L檸檬酸(成分(B))的溶液(B溶液)。準備含有5重量％聚乙二醇單辛基苯基醚(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制)作為非離子表面活性劑(成分(C))的水溶液(C溶液)。通過在含有1.0mol/L三(羥甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加12.0重量％氯化鈉準備溶液(D溶液)。
在250μL唾液中加入40μL C溶液，然後攪拌。然後在其中加入40μL B溶液，然後攪拌。進一步在其中加入40μL D溶液，然後攪拌。最後在其中加入40μLA溶液，然後攪拌。從這樣處理的唾液中取100μL，滴到標記抗體保持體一側的條上。這樣處理的溶液的pH為8.0。溶液中成分(C)的濃度為0.49重量％。滴下15分鐘後，確認了與捕捉抗體的反應，並且標記抗體保持體中殘留的SS2標記抗體與變異鏈球菌的複合體的量通過目視進行了觀察。
對3個被試驗者a～c進行前述試驗，並進行與實施例1同樣的評價。這樣得到的結果如下表4所示。
表4

實施例5使用與實施例1同樣的使用SM1捕捉抗體和SM2標記抗體的抗體固定化的多孔膜條，以下面的方式進行試驗。
通過在含有1.0mol/L氫氧化鈉(成分(A))的含有5重量％聚乙二醇單辛基苯基醚(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制)作為非離子表面活性劑(成分(C))的水溶液中添加12重量％氯化鈉準備溶液(AC溶液)。準備含有0.5mol/L檸檬酸(成分(B))的水溶液(B溶液)。通過在含有1.0mol/L三(羥甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加12.0重量％氯化鈉準備溶液(D溶液)。
在250μL唾液中加入75μL AC溶液，然後攪拌。然後在其中加入75μL B溶液，然後攪拌。最後在其中加入50μL D溶液，然後攪拌。從這樣處理的唾液中取100μL，滴到標記抗體保持體一側的條上。這樣處理的溶液的pH為7.2。溶液中成分(C)的濃度為0.83重量％。滴下15分鐘後，確認了與捕捉抗體的反應，並且標記抗體保持體中殘留的SM2標記抗體與變異鏈球菌的複合體的量通過目視進行了觀察。
對3個被試驗者a～c進行前述試驗，並進行與實施例1同樣的評價。這樣得到的結果如下表5所示。
表5

實施例6使用與實施例1同樣的使用SM1捕捉抗體和SM2標記抗體的抗體固定化的多孔膜條，以下面的方式進行試驗。
通過在含有3.0mol/L氫氧化鈉(成分(A))的含有1.0mol/L三(羥甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加12.0重量％氯化鈉準備溶液(AD溶液)。通過在含有1.0mol/L三(羥甲基)氨基甲烷(成分(D))的溶液中添加1.0mol/L酒石酸和0.5mol/L檸檬酸(成分(B))準備溶液(BD溶液)。通過在含有5重量％聚乙二醇單辛基苯基醚(Wako PureChemical Industries，Ltd.制)作為非離子表面活性劑(成分(C))的水溶液中添加2mol/L氯化鈉準備溶液(C溶液)。
在250μL唾液中加入40μL BD溶液，然後攪拌。然後在其中加入40μL A溶液，然後攪拌。最後在其中加入40μL C溶液，然後攪拌。從這樣處理的唾液中取100μL，滴到標記抗體保持體一側的條上。這樣處理的溶液的pH為6.9。溶液中成分(C)的濃度為0.54重量％。滴下15分鐘後，確認了與捕捉抗體的反應，並且標記抗體保持體中殘留的SM2標記抗體與變異鏈球菌的複合體的量通過目視進行了觀察。
對3個被試驗者a～c進行前述試驗，並進行與實施例1同樣的評價。這樣得到的結果如下表6所示。
表6

實施例7使用與實施例1同樣的使用SM1捕捉抗體和SM2標記抗體的抗體固定化的多孔膜條，以下面的方式進行試驗。
通過在含有1.0mol/L氫氧化鈉(成分(A))的水溶液中添加25.0重量％氯化鈉準備溶液(A溶液)。通過在含有0.5mol/L檸檬酸(成分(B))的水溶液中添加5.0重量％聚乙二醇單辛基苯基醚(Wako PureChemical Industries，Ltd.制)作為非離子表面活性劑(成分(C))準備溶液(BC溶液)。準備含有2mol/L三(羥甲烷)氨基甲烷(成分(D))的緩衝液(D溶液)。
在250μL唾液中加入40μL D溶液，然後攪拌。然後在其中加入40μL A溶液，然後攪拌。最後在其中加入70μL BC溶液，然後攪拌。從這樣處理的唾液中取100μL，滴到標記抗體保持體一側的條上。這樣處理的溶液的pH為6.9。溶液中成分(C)的濃度為0.88重量％。滴下15分鐘後，確認了與捕捉抗體的反應，並且標記抗體保持體中殘留的SM2標記抗體與變異鏈球菌的複合體的量通過目視進行了觀察。
對5個被試驗者a～e進行前述試驗，並進行與實施例1同樣的評價。這樣得到的結果如下表7所示。
表7

比較例1除使用不含氯化鈉的AD溶液外，對5個被試驗者a～e進行與實施例1同樣的試驗，並進行與實施例1同樣的評價。這樣得到的結果如下表8所示。
表8

比較例2除使用不含氯化鈉的D溶液外，對3個被試驗者a～c進行與實施例4同樣的試驗，並進行與實施例1同樣的評價。這樣得到的結果如下表9所示。
表9

從以上的結果可以確認使用本發明的唾液預處理試劑盒的唾液預處理方法可以消除由唾液中的粘蛋白及變異鏈球菌的鏈形成引起的聚集，並且由於在標記抗體保持體中殘留的標記抗體與變異鏈球菌的複合體的量少，所以確認了防止標記抗體與變異鏈球菌的複合體殘留在保持標記抗體的膜中這種現象的效果。
如上所詳述，通過利用抗原抗體反應的免疫層析法鑑定和定量測定作為人唾液中存在的一種致齲細菌的變異鏈球菌時，本發明的唾液預處理試劑盒和唾液預處理方法通過簡便的操作可以消除由唾液中的粘蛋白及變異鏈球菌的鏈形成引起的聚集，並且可以使標記抗體與變異鏈球菌的複合體從保持標記抗體的多孔膜有效流出，從而可以進行高精度的鑑定和定量測定。因此，它提供對牙科領域有貢獻的非常大的價值。
權利要求
1.一種唾液預處理試劑盒，含有(A)氫氧化鈉水溶液，濃度為0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或檸檬酸的水溶液，濃度為0.01-3mol/L，和(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑，成分(C)與成分(A)和(B)的至少一個混合，或可以與成分(A)和(B)分別提供，以及在成分(A)、(B)和(C)的至少一個中含有選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質，含量為5-25重量％。
2.如權利要求1所述的唾液預處理試劑盒，其中(D)三(羥甲基)氨基甲烷與成分(A)、(B)和(C)的至少一個混合。
3.一種唾液預處理試劑盒，含有(A)氫氧化鈉水溶液，濃度為0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或檸檬酸的水溶液，濃度為0.01-3mol/L，(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑，和(D)含有三(羥甲基)氨基甲烷的水溶液，成分(C)與成分(A)、(B)和(D)的至少一個混合，或可以與成分(A)、(B)和(D)分別提供，以及在成分(A)、(B)、(C)和(D)的至少一個中含有選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質，含量為5-25重量％。
4.如權利要求1-3的任一項所述的唾液預處理試劑盒，其中作為成分(C)的非離子表面活性劑為選自聚乙二醇單辛基苯基醚、正辛基-β-D-葡糖苷、正庚基-β-D-硫葡糖苷、正辛基-β-D-硫葡糖苷、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇和聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯的一種、或兩種以上的混合物。
5.如權利要求1-4的任一項所述的唾液預處理試劑盒，其中作為成分(C)的兩性表面活性劑為選自CHAPS(3-(3-膽醯胺丙基)-二甲基銨基)-1-丙烷磺酸鹽)和CHAPSO(3-(3-膽醯胺丙基)-二甲基銨基)-1-羥基丙烷磺酸鹽)的一種、或兩種以上的混合物。
6.一種唾液預處理方法，用於通過免疫層析法鑑定和定量測定變異鏈球菌，包括下列步驟將選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質以5-25重量％的量與選自下述(A)、(B)和(C)的至少一個混合，(A)氫氧化鈉水溶液，濃度為0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或檸檬酸的水溶液，濃度為0.01-3mol/L，和(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑；和通過以任意順序滴下成分(A)、(B)和(C)將它們混合。
7.如權利要求6所述的唾液預處理方法，其中(D)三(羥甲基)氨基甲烷與成分(A)、(B)和(C)的至少一個混合，並且通過以成分(A)與成分(B)在成分(D)的存在下接觸的順序滴下成分(A)、(B)和(C)，將它們混合。
8.一種唾液預處理方法，用於通過免疫層析法鑑定和定量測定變異鏈球菌，包括下列步驟將選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質以5-25重量％的量與選自下述(A)和(B)的至少一個混合，(A)氫氧化鈉水溶液，濃度為0.01-10mol/L和(B)酒石酸和/或檸檬酸的水溶液，濃度為0.01-3mol/L；將(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑混入成分(A)和(B)的至少一個中；和通過以任意順序滴下成分(A)和(B)將它們混合。
9.如權利要求8所述的唾液預處理方法，其中(D)三(羥甲基)氨基甲烷與成分(A)和(B)的至少一個混合，並且通過以任意順序滴下成分(A)和(B)，將它們混合。
10.一種唾液預處理方法，用於通過免疫層析法鑑定和定量測定變異鏈球菌，包括下列步驟將選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質以5-25重量％的量與選自下述(A)、(B)、(C)和(D)的至少一個混合，(A)氫氧化鈉水溶液，濃度為0.01-10mol/L，(B)酒石酸和/或檸檬酸的水溶液，濃度為0.01-3mol/L，(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑，和(D)三(羥甲基)氨基甲烷；和通過以成分(A)與成分(B)在成分(D)的存在下接觸的順序滴下成分(A)、(B)、(C)和(D)，將它們混合。
11.如權利要求10所述的唾液預處理方法，其中通過以成分(A)與成分(B)在成分(D)的存在下接觸的順序滴下至少其中之一已與成分(C)混合的成分(A)、(B)和(D)，將它們混合。
全文摘要
在通過利用抗原抗體反應鑑定和定量測定變異鏈球菌時的唾液預處理試劑盒和唾液預處理方法，它通過簡便的操作可以消除由唾液中的粘蛋白及變異鏈球菌的鏈形成引起的聚集，並且可以使標記抗體與變異鏈球菌的複合體從保持標記抗體的多孔膜有效流出，所述的唾液預處理試劑盒含有(A)氫氧化鈉水溶液，濃度為0.01－10mol/L，(B)酒石酸和/或檸檬酸的水溶液，濃度為0.01－3mol/L，和(C)非離子表面活性劑和/或兩性表面活性劑，其中成分(C)與成分(A)和(B)的至少一個混合，或可以分別提供，以及在成分(A)、(B)和(C)的至少一個中含有選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂和硫酸錳的至少一種物質，含量為5－25重量％。
文檔編號G01N33/543GK1492230SQ0315914
公開日2004年4月28日 申請日期2003年9月9日 優先權日2002年9月9日
發明者立野敦史 申請人:株式會社Gc