高分子量脂聯素的測定方法

2023-12-08 22:25:01 2

專利名稱：高分子量脂聯素的測定方法
高分子量脂聯素的測定方法技術區結構域本發明涉及將生物樣品中所含多聚體脂聯素內的高分子量(HMW)部分分級分離 並進行免疫學測定的方法。
背景技術：
脂聯素，是脂肪組織特異性產生、分泌的，具有抗糖尿病作用、抗動脈硬化作用的 激素，血中相對富含。近幾年，伴隨著肥胖、尤其是由內臟脂肪蓄積引起的低脂聯素血症被 認為與糖尿病、動脈硬化性疾病、高血壓的發病緊密相關。脂聯素已被報導為在構造上屬於Clq(C0mplement lq)家族，具有作為Clq家族特 徵的膠原樣結構域，因而形成以三聚體作為基礎的多聚體而存在。最近，由本發明人等已解 明人血中存在的多聚體脂聯素的形態(包含白蛋白結合型的三聚體、六聚體及HMW部分)， 並且還報導了以促進糖攝取、脂肪酸燃燒的AMPK(adenosine monophosphate activated protein kinase)的磷酸化作為指標的多聚體脂聯素的活化作用中，HMW型表現最高的活性 (非專利文獻1)。加之還公開了通過向含人來源多聚體脂聯素的生物樣品作用某種的蛋白 酶來選擇性地消化測定對象以外的部分，免疫學性測定殘留的脂聯素，從而直接將HMW脂 聯素濃度、並間接將三聚體、六聚體部分各自分別測定的方法(專利文獻1、非專利文獻2)。並且，還報導了利用本分級分離測定系的糖尿病及冠狀動脈疾病組的多聚體脂聯 素臨床研究中，作為胰島素抵抗性、代謝症候群的預知指標，在總濃度中HMW脂聯素所佔比 (HMWR)具有高於總濃度以上的靈敏度、特異性這樣的見解(非專利文獻3)。因此，期待不 只是對總濃度，還對各部分進行分級分離測定的臨床有用性。另一方面，代謝症候群關聯疾病(糖尿病、高血壓、高脂血症)的治療藥中存在增 加脂聯素的作用，引人關注。例如，作為胰島素抵抗性改善藥的噻唑烷衍生物被報導增加 HMW脂聯素(非專利文獻4)。除此之外最近還報導有，被分類於降壓劑的血管緊張素受體 拮抗劑的某藥、高脂血症治療藥的部分的藥中也存在增加脂聯素的作用(非專利文獻5)， 期待對代謝症候群疾病組中高頻度被確認的胰島素抵抗性的改善。如上所述，在代謝症候群關聯疾病的藥物開發中，存在增加脂聯素的作用屬於有 用的附加價值。並且，不僅在藥物開發，保健食品領域中也備受矚目，在全力探索這種具有 脂聯素增強作用的功能性食品。藥品、功能性食品的功效效果，通常先用小鼠、大鼠等實驗動物進行，而對於增加 脂聯素的作用，利用實驗動物的血中脂聯素濃度的變化作為指標是有用的(如專利文獻2、 3)。小鼠、大鼠的脂聯素濃度已作為測定試劑盒在市場上銷售，可以獲得，不過，僅僅測定總 量，無法分級分離多聚體脂聯素，尤其需要可對高活性型HMW脂聯素進行分級測定的方法。本發明人等發現了通過對人活體樣品中存在的多聚體脂聯素作用特定的蛋白酶， 從而將多聚體脂聯素分級分離測定的方法(專利文獻1，非專利文獻2)，並發現將此時所 利用的蛋白酶應用到對小鼠來源多聚體脂聯素的分級分離測定中的嘗試時，發現尤其是對 HMW部分無法進行正確的測定這一有意思的情況。
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而Pajvani等使用重組表達的小鼠來源脂聯素，報告了胰蛋白酶的消化特異性， 但示出了雖然低分子量部分(LMW)消化，但是中分子量部分(MMW)、HMW部分不被消化的情 況，對於HMW脂聯素的分級測定並不合適(非專利文獻6)。
背景技術：
文獻專利文獻1 國際公開W02005/038457公報專利文獻2 日本特開2005-232150號公報專利文獻3 日本特開2006-56836號公報非專利文獻 1 :Hada Y，et al. Biochem Biophys Res Commun. 356 487-493, 2007.非專利文獻 2 =Ebinuma H, et al. Clinica Chimica Acta. 372 :47_53，2006·非專利文獻3 =Hara K, et al. Diabetes Care. 29 1357-1362，2006.非專利文獻 4 =Tsuchida A, et al. Diabetes. 54 :3358_3370，2005.# 禾U t ■ 5 =Nakano S, et al. Am J Physiol Endocrinol Metab. 292 1213-1222，2007.非專利文獻6 =Pajvani UB, et al. J Biol Chem. 278 :9073_85，2003.

發明內容
本發明的目的在於，提供一種將多聚體脂聯素中的高活性型HMW脂聯素分級測定 的方法。本發明人等，為解決上述課題進行銳意研究的結果，發現了通過使各種蛋白酶中 的糜蛋白酶作用於含多聚體脂聯素的樣品，在小鼠、大鼠等中也能選擇性地消化HMW部分 以外的脂聯素，以及利用糜蛋白酶的消化處理之後，將殘留的HMW脂聯素進行免疫學性測 定，就可以分級測定HMW脂聯素。S卩，本發明提供一種樣品中HMW脂聯素的分級測定方法，其特徵在於，是使用蛋白 酶將多聚體脂聯素分級分離並進行免疫學性測定的方法，使糜蛋白酶作用於含多聚體脂聯 素的樣品。根據本發明，不僅是人，還可以將小鼠、大鼠等的多聚體脂聯素中的HMW脂聯素分 級分離進行測定，所以更能正確地評價所開發的藥、功能性食品等的脂聯素增強作用。


圖1為表示糜蛋白酶對小鼠來源多聚體脂聯素的消化特異性的圖。圖2為表示糜蛋白酶對大鼠來源多聚體脂聯素的消化特異性的圖。圖3為表示胰蛋白酶對小鼠、大鼠以及人來源多聚體脂聯素的消化特異性的圖。A 是小鼠血清，B是大鼠血清，C是人血清。圖4為表示蛋白酶K對人和小鼠來源多聚體脂聯素的消化特異性的圖。A是人血 清，B是小鼠血清。圖5為表示糜蛋白酶對人來源多聚體脂聯素的消化特異性的圖。圖6為表示利用凝膠過濾分離檢測法的小鼠高量分子量脂聯素的測定結果的圖。圖7為表示ELISA測定和凝膠過濾分離檢測法之間的相關性的圖。圖8為表示糜蛋白酶處理法和蛋白酶K處理法中的人來源高分子量脂聯素測定結果的相關性的圖。
具體實施例方式作為本發明中能使用的樣品，只要含有哺乳類來源多聚體脂聯素都可以成為對 象，可舉出從哺乳類獲得的血液、尿等的體液，組織萃取液、組織來源的細胞的培養上清液 等。在此，作為哺乳類可舉出小鼠、大鼠等的嚙齒類以及人等。其中，作為用於對所開發的藥 品、功能性食品等的脂聯素增強作用作更正確評價的樣品，優選小鼠或大鼠的血液(血清、 血漿)，特別優選小鼠的血液。另外，作為用於診斷糖尿病等的樣品優選人的血液(血清、血 漿)。對將HMW脂聯素分級分離並免疫測定的方法進行說明。使糜蛋白酶作用於含多 聚體脂聯素的樣品，消化HMW部分以外的脂聯素，利用糜蛋白酶的消化處理之後，將殘留的 HMW脂聯素用抗脂聯素抗體進行免疫學性測定。本發明使用的糜蛋白酶的純化物可作為市 售物購得，也可以使用提純到本發明可實現程度的物質。並且，即使由基因重組技術獲得也 沒有問題。而且，只要具有糜蛋白酶活性也可以實施化學修飾。生物樣品的利用糜蛋白酶的處理優選在磷酸、Tris, Good』 s緩衝液等緩衝液中， 4 60°C，優選4 45°C下進行5分鐘 24小時。糜蛋白酶的使用濃度將考慮反應溫度 及反應時間等決定，但大概在0. 1 1000u/mL的範圍使用，進而優選在1 100u/mL的範 圍使用。糜蛋白酶處理的糜蛋白酶使用濃度、反應溫度和反應時間因樣品動物種而不同，所 以優選通過預備試驗預先確認只不消化樣品中HMW脂聯素的條件。在此所說的糜蛋白酶活 性(u)表示，在pH7. 8的條件下、於25°C，N-苯甲醯-L-酪氨醯乙酯(BTEE)在每1分鐘水 解Iymole的量。利用糜蛋白酶進行預處理的樣品中的多聚體脂聯素由糜蛋白酶所消化，HMW脂聯 素殘留，所以對該樣品中的脂聯素濃度進行使用抗脂聯素抗體的免疫測定就可以僅將HMW 脂聯素分級測定。因此，經糜蛋白酶處理樣品的免疫學性測定可使用利用抗脂聯素抗體的 通常的方法進行。作為以糜蛋白酶處理樣品、測定殘留HMW脂聯素的抗體，可使用能識別脂聯素的 抗體。抗脂聯素抗體可以使用單克隆抗體和多克隆抗體的任一個，可通過公知方法對合適 的動物進行免疫而獲得，也可以作為市售品購入並使用於本發明。例如，抗小鼠脂聯素抗體 可舉出「Anti-mouse脂聯素單克隆抗體」和「Anti-mouse脂聯素多克隆抗體，Goat" (R&D Systems 公司),"Anti-mouse 脂聯素，mAd(MAD104) 」 (AdipoGen 公司)、「Anti-mouse 脂 聯素單克隆抗體」(CHEMIC0N公司)等，抗大鼠脂聯素抗體可舉出「Anti-rat脂聯素多克 隆抗體，GoatJ (R&D Systems公司Anti-rat脂聯素單克隆抗體」、「Anti-rat脂聯素 多克隆抗體，Rabbit」(CHEMIC0N公司)等。作為抗人脂聯素抗體可舉出Goat α human Acrp30antibody (COSMO BIO 公司，GT 公司)，rabbit α hu adiponectin-PoAb (COSMO BIO 公司，chemicon公司)、hu Acrp30_MoAb (藤澤藥品工業公司，BD公司)、Mouse α hu脂聯 M MoAb (COSMO BIO 公司，chemicon 公司)、抗人 ACRP30 單克隆抗體(AX773，AX741, Ne, Na，和光純藥工業公司)等。這些的抗體可以各自單獨使用或適當組合使用。另外，也可 以使用市售的測定脂聯素總量的試劑盒。除此之外，還可以利用對生物樣品，將還原劑、酸 或其鹽、表面活性劑以及糜蛋白酶以外的蛋白酶中的至少一個或二個以上的組合作用於
5脂聯素，使多聚體脂聯素轉換為規定的形態並進行免疫學性測定的本發明人等開發的方法 (W02005/038458)。作為本發明的免疫學性測定方法可使用將對脂聯素特異性結合的抗體結合到不 溶性載體，由其捕捉脂聯素，對樣品中存在的脂聯素的有無進行確認(定性)或定量的方 法。其中可舉出被稱為LTIA (膠乳免疫比濁)法、ELISA (酶聯免疫吸附測定)法、CLEIA (化 學發光酶免疫分析方法)、RIA(放射免疫分析)等方法。其中，LTIA法是通過將擔載了與 脂聯素特異性結合的抗體的不溶性載體、和預先使糜蛋白酶作用而殘留的HMW脂聯素進行 混合，由此引發介由脂聯素的不溶性載體的交聯(凝集)，再將由此所產生的濁度進行光學 測定，從而對脂聯素的有無進行確認(定性)或定量的方法，優選用於簡便、迅速且正確地 測定HMW脂聯素。作為本發明使用的不溶性載體，使用通常的免疫學性測定試劑中使用的能工業化 大量生產的有機系不溶性載體。在LTIA中優選使用抗體吸附性出色且能長期間穩定地保 持生物學活性的聚苯乙烯系膠乳顆粒，在ELISA中優選使用聚苯乙烯等的96孔微孔板。在上述不溶性載體表面擔載抗體的方法已知的有各種各樣，可在本發明中適宜利 用。例如，作為擔載(致敏)方法可舉出不溶性載體表面物理性吸附抗體的方法、在具有官 能團的不溶性載體表面通過屬於已知方法的物理結合法和化學結合法有效地將抗體致敏 的方法。關於擔載了抗體的抗體不溶性載體和脂聯素的反應，只要是能進行抗原抗體反應 的條件則對其反應條件不特別限定。作為反應液，只要能進行與脂聯素的抗原抗體反應 的溶液，任何溶液都可以。例如，用於控制PH的磷酸緩衝液、甘氨酸緩衝液、Tris緩衝液、 Good’s緩衝液等的緩衝成分，用於避免非特異性反應的表面活性劑、氯化鈉等，作為穩定劑 的牛血清白蛋白、蔗糖、高分子多糖類等，除了控制反應性的上述物質以外還可以適宜添加 糊精等的水溶性多糖類、還原劑、酸中和劑、蛋白酶鈍化劑等的添加劑。作為上述LTIA、ELISA中的檢測方法，可例舉以下的方法。對LTIA中的不溶性載 體的凝集程度進行測定的方法不特別限定，例如，對凝集進行定性或半定量性的測定時，可 通過比較已知濃度樣品的濁度程度與測定樣品的濁度程度，目測凝集程度進行判斷。如果 定量性測定該凝集時，從簡便性及精度的觀點出發，優選光學性測定。作為凝集的光學性測 定法，可以利用公知方法。更具體為，例如可利用所謂的比濁法(將凝集塊的形成作為濁度 增加進行捕捉)、利用粒度分布的測定法(將凝集塊的形成作為粒度分布或平均粒徑的變 化進行捕捉)，積分球濁度法(用積分球測定由凝集塊的形成而引起的前方散射光的變化， 比較與透射光強度的比)等各種的方式。對ELISA中的酶標記抗體的酶活性來源的、底物 和酶反應生成物的測定方法不特別限定。例如，可以用96孔酶標儀在酶反應生成物固有的 波長，例如作為底物使用鄰苯二胺鹽酸鹽和過氧化氫檢測HRP標記抗體的酶活性等時，在 492nm的吸光度上讀取。而且，對生物樣品不進行糜蛋白酶處理時，由於可測定脂聯素的總量，所以能簡單 地求出通過糜蛋白酶處理而算出的HMW脂聯素的比率。實施例接著舉出實施例對本發明進行詳細說明，但本發明並不受這些的任何限定。實施例1對小鼠血清中的多聚體脂聯素的消化特異性
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小鼠血清10μ L 中，以 α -糜蛋白酶(TypeI-S ；No. C7762，Sigma-Aldrich 公司)成 為10u/mL的方式，添加溶解於50mM Tris鹽酸緩衝液(ρΗ8. 0)的酶溶液100 μ L，在37°C下 加溫20分鐘。向該反應液添加400 μ L的BSA-PBST (含牛血清白蛋白及0. 05% Tween 20 的 20mM磷酸緩衝液，ρΗ7. 2)之後，用 Superdex 200 (GE HEALTHCAREBIO-SCIENCES 公司) 實施了全部重量凝膠過濾層析。洗提液用PBS(20mM磷酸緩衝液，ρΗ7. 2)，分取每lmL。作為 對照，準備了在上述條件中不含糜蛋白酶以外，同樣的條件下實施了凝膠過濾層析的餾分。各餾分中脂聯素的檢測如下進行。用PBS將Anti-mouse脂聯素單克隆抗體(R&D Systems公司)稀釋為2. 5 μ g/mL之後，向ELISA用板的每孔添加50 μ L，一晚致敏。用 PBST (含 0. 05% 的 Tween20 的 PBS 液，pH7. 4)洗板後，添加 100 μ L 的 BSA-PBST 進行了封 閉(blocking)。然後，添加了用BSA-PBST進行2倍稀釋的各餾分50 μ L，室溫反應1小 時。用PBST洗板後，添加了用BSA-PBST稀釋為1. 0 μ g/mL的Goat anti-mouse脂聯素多 克隆抗體(R&D Systems公司)50 μ L，室溫反應1小時。用PBST洗板後，添加用BSA-PBST 稀釋為1/2000倍的Rabbit anti-goat Ig' s HRP標記抗體液(DAK0公司)50 μ L，室溫 反應1小時。用PBST洗板後，添加底物液(含2mg/mL鄰苯二胺鹽酸鹽、0.02%的過氧 化氫，250mM檸檬酸緩衝液，pH5. 0) 50 μ L，室溫反應10分鐘，添加停止液(1. 5N硫酸，ImM EDTA-2Na)50l·! L，停止反應之後，測定了 492nm的吸收。測定結果如圖1所示。在沒實施糜蛋白酶消化處理時，小鼠血清中多聚體脂聯素被分離成了 3個峰。另 一方面，小鼠血清經糜蛋白酶處理時，含白蛋白結合型(Alb-) LMW的MMW脂聯素洗脫峰(第 2個)、LMW脂聯素洗脫峰(第3個)消失，而HMW脂聯素的洗脫峰(第1個)仍殘留。其 結果，通過使糜蛋白酶作用於含小鼠來源多聚體脂聯素的樣品，能夠僅使HMW脂聯素不被 消化而殘留，所以通過測定該處理液中的脂聯素，可算出HMW脂聯素的濃度。實施例2對大鼠血清中多聚體脂聯素的消化特異性向大鼠血清50 μ L，以使 α -糜蛋白酶(TypeI-S ;No. C7762，Sigma-Aldrich 公司) 成為100u/mL的方式，添加溶解於50mM Tris鹽酸緩衝液(pH8. 0)的酶液100 μ L，37°C下加 溫20分鐘。對該反應液添加400 μ L的BSA-PBST之後，全量用Superdex 200 (GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES公司)，實施了凝膠過濾層析。洗提液用PBS，分取每lmL。作為對照，準備了 在上述條件中不含糜蛋白酶以外，同樣的條件下實施了凝膠過濾層析的餾分。各餾分中脂聯素的檢測如下進行。用PBS將Goat anti-rat脂聯素多克隆抗體 (R&D Systems公司)稀釋為0. 5 μ g/mL之後，向ELISA用板的每孔添加50 μ L，一晚致敏。用 PBST洗板後，添加100 μ L的BSA-PBST進行了封閉。然後，添加了用BSA-PBST進行2倍稀 釋的各餾分50 μ L，室溫反應1小時。用PBST洗板後，添加了用BSA-PBST稀釋為1. 0 μ g/mL 的Rabbit anti-mouse球形的脂聯素多克隆抗體(W02005-038457) 50 μ L，室溫反應1小時。 用 PBST 洗板後，添加了用 BSA-PBST 稀釋為 1/2000 倍的 Goat anti-rabbit Ig' s HRP 標 記抗體液(BI0S0UCE公司)50 μ L，室溫反應1小時。用PBST洗板後，添加底物液(含2mg/ mL鄰苯二胺鹽酸鹽、0. 02%的過氧化氫，250mM檸檬酸緩衝液，pH5. 0)50 μ L，室溫反應10分 鍾，添加停止液(1. 5Ν硫酸，lmMEDTA-2Na) 50 μ L，停止反應之後，測定了 492nm的吸收。測 定結果如圖2所示。在沒實施糜蛋白酶消化處理時，大鼠血清中多聚體脂聯素被分離成了 2個峰，且 表示HMW脂聯素的洗脫峰(第1個)非常少。而大鼠血清經糜蛋白酶處理時，含白蛋白結合型(Alb-) LMW的MMW脂聯素洗脫峰(第2個)消失，而HMW脂聯素洗脫峰(第1個)仍 殘留。自其結果可知，使糜蛋白酶作用於含大鼠來源多聚體脂聯素的樣品，能夠僅使HMW脂 聯素不被消化而殘留，所以通過測定該處理液中的脂聯素，可算出HMW脂聯素的濃度。參考例1使用胰蛋白酶的多聚體脂聯素的消化特異性向小鼠血清、大鼠血洗脫峰血清各自10 μ L，以使胰蛋白酶(No. Τ1426， Sigma-Aldrich公司)成為0 50u/mL的方式，添加了溶解於50mM Tris鹽酸緩衝液 (ρΗ8· 0)的酶液100 μ L，37°C下加溫20分鐘。向該反應液，添加400 μ L的BSA-PBST0對 其一部分用非改性類聚丙烯醯胺電泳(native-PAGE)進行分離後，通過半乾轉印儀轉印到 PVDF膜之後，進行了免疫染色。工序為，用BSA-PBST封閉轉印膜後，用PBST洗淨，將Goat anti-mouse脂聯素多克隆抗體(R&D systems公司)0. 1 μ g/mL室溫反應1小時。PBST充 分洗淨後，利用Vector ABCkit(Goat)和DAB底物試劑盒(funakoshi公司)進行顯色。各 血清的免疫染色結果如圖3 (A 小鼠，B 大鼠，C 人)所示。胰蛋白酶活性為Ou/mL時，從泳動距離短的一側大概分成了 HMW部分、六聚體 (MMW)部分、含白蛋白結合三聚體(Alb-LMW)的三聚體部分(LMW)(大鼠血清主要為MMW部 分，HMW, LMW部分很少，未觀察到明確的染色帶)。以10 50u/mL的胰蛋白酶活性進行消 化後觀察到雖然LMW部分被消化，但MMW、HMW部分未能消化。從該結果可判斷出，胰蛋白酶 無法利用於對動物血清中HMW脂聯素的分級消化測定。參考例2使用蛋白酶K的多聚體脂聯素的消化特異性按照參考例1的方法，並將蛋白酶改為7. 5u/mL的蛋白酶K，進行了人或小鼠血清 的消化，免疫染色了該反應液的一部分(圖4，A 人，B 小鼠)。觀察到雖然在人血清中僅有HMW部分不被消化殘留，但在小鼠血清中包括HMW部 分的所有部分均被消化。從該結果可判斷出，蛋白酶K無法利用於小鼠血清HMW脂聯素的 分級消化測定。實施例3對人血清中多聚體脂聯素的消化特異性向人血清 10 μ L,以糜蛋白酶(TypeII ；No. C4129，Sigma-Aldrich 公司)成為 0 100u/mL的方式，添加了溶解於50mM Tris鹽酸緩衝液(pH8. 0)的酶液100 μ L，37°C下加溫 20分鐘或60分鐘。對該反應液，添加400 μ L的BSA-PBST。對其一部分用非改性聚丙烯醯 胺電泳(native-PAGE)進行分離後，通過半乾轉印儀轉印到PVDF膜之後，進行了免疫染色。 工序為，用BSA-PBST封閉轉印膜後，用PBST洗淨，將Goat anti-human脂聯素多克隆抗體 (R&D systems公司)0. 1 μ g/mL室溫反應1小時。用PBST充分洗淨後，利用Vector ABC kit (Goat)及DAB底物試劑盒(funakoshi公司)進行顯色。各血清的免疫染色結果如圖5 所示。糜蛋白酶消化時間為20分鐘時，在25u/mL的濃度上MMW以下的部分稍有殘留，而 在50 100u/mL的濃度上，僅殘留HMW。另一方面，消化時間為60分鐘時，10u/mL濃度上 幾乎未進行消化，而在25 50u/mL的濃度上，僅殘留HMW。另外，100u/mL上，包括HMW的 所有部分均被消化。參考例3小鼠血清來源多聚體脂聯素(Ms-mAd)的純化向抗小鼠球狀的脂聯素抗體結合樹脂(W02005-038457)添加小鼠血清180mL，以 含0. 5M NaCl的IOOmM Tris鹽酸緩衝液(ρΗ8· 5)充分洗淨之後，再以含0. 5Μ NaCl的IOOmM
8醋酸緩衝液(PH5.0)洗淨。然後，以IOOmM甘氨酸鹽酸緩衝液(pH2. 5)洗脫小鼠脂聯素部 分，向洗脫部分添加1/10量的2M Tris鹽酸緩衝液(pH8. 0)進行中和。進而將中和了的洗 脫部分添加於Protein A樹脂，將未向Protein A樹脂的吸附部分作為純化Ms-mAd回收， 用PBS透析後，利用「小鼠/大鼠脂聯素ELISA試劑盒」(大冢製藥社)測定了脂聯素含量。參考例4抗小鼠脂聯素的大鼠單克隆抗體的製備將參考例3中得到的純化Ms-mAd 50 μ g與等量的弗氏完全佐劑混合，對大鼠 (F344/Jcl)隔2周進行了 2次免疫之後，從經免疫的大鼠摘取脾臟和淋巴結細胞，通過使 用聚乙二醇的常規法，與sp2/o骨髓瘤細胞進行細胞融合。抗小鼠脂聯素單克隆抗體產生 融合細胞的選擇，是通過ELISA法選擇了與重組小鼠脂聯素(rMs-Ad) (BioVender公司)反 應性高的孔，接著以有限稀釋法進行選擇的常規法進行的。抗小鼠脂聯素單克隆抗體，是將 選擇的融合細胞注入經姥鮫烷處理的裸鼠腹腔內並作為腹水回收。從腹水純化特異抗體 (IgG)是如下進行，即，回收50%飽和硫酸銨沉澱，以20mM Tris鹽酸緩衝液(pH8. 0)透析 後，附加於DEAE離子交換樹脂(Tosoh公司)，利用由NaCL濃度遷移(0 200mM)引起的梯 度洗脫，得到了純化IgG(MoAb83201R)。參考例5抗小鼠脂聯素的兔多克隆抗體的製備及生物素標記將參考例3中調製的純化Ms-mAd 120 μ g，與等量的弗氏完全佐劑混合，對兔 子隔2周進行了 5次免疫，製造了抗血清。抗血清中的特異抗體(IgG)的純化是用蜜 瓜凝膠(Melon GeD (PIAS公司)通過常規法進行的。並且，向純化IgG混入EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (PIAS 公司)，實施了生物素標記(Biotinylated PoAb)。實施例4小鼠脂聯素總量及HMW的ELISA測定和凝膠過濾分離檢測法的比較1-1)樣品的預處理HMW測定用對小鼠血清(η = 10)101^，添加含糜蛋白酶3511/11^的蛋白酶溶解液 (50mM Tris鹽酸緩衝液，pH8. 0) 100 μ L，37°C下加溫20分鐘。並且，添加700 μ L的樣品處 理液(IOOmM硼酸緩衝液，pHll. 0)，將其作為HMW測定用的處理樣品液。總量測定用對小鼠血清10 μ L，添加不含糜蛋白酶的蛋白酶溶解液100 μ L，進 而，添加700μ L的樣品處理液後，作為總量測定用的處理樣品液。1-2) ELISA 測定在ELISA用板中，將參考例4中製造的抗小鼠脂聯素單克隆抗體(83201R)以PBS 稀釋為5 μ g/mL之後，進行了致敏。然後，以BSA-PBST封閉後，向板添加了將各處理樣品液 用BSA-PBST進一步稀釋成101倍的稀釋樣品液50 μ L，室溫反應1小時。用PBST洗板後， 添加了參考例5中製造的生物素標記抗小鼠脂聯素多克隆(Biotinylated PoAb)50yL，室 溫反應1小時。用PBST洗板，進而添加以BSA-PBST稀釋了 2000倍的HRP-Avidin，室溫反 應30分鐘。用PBST洗板，以OPD顯色液(含2mg/mL鄰苯二胺鹽酸鹽、0. 02%過氧化氫的 250mM檸檬酸緩衝液，pH5. 0)進行顯色，添加停止液(1.5N硫酸，ImM EDTA_2Na)停止反應 之後，測定了 492nm的吸收。作為標準物使用了重組小鼠脂聯素(rMs_Ad)，進行了樣品中的 脂聯素濃度的計算。2)凝膠過濾分離檢測法與上述1-1)相同，對小鼠血清(η = 10)各50 μ L，在與實施例1同樣的條件下實 施凝膠過濾層析，準備了餾分。各餾分中的脂聯素的檢測是用BSA-PBST稀釋21倍之後，按照上述1-2)的ELISA測定實施的(圖6)。3)相對於總量的HMW所佔比例值(HMWR)的比較從1-2)中求出的HMW及總量濃度算出了 HMWR。另一方面，在2)中檢測到的3個 脂聯素洗脫峰中，最初的峰相當於HMW，所以將其餾分濃度的總和除以脂聯素全餾分的總和 濃度而算出了 HMWR。比較各HMWR的結果，兩法的檢測存在極強的相關性且HMWR值也大致 相同(圖7)。從該結果可知，通過用本發明的糜蛋白酶處理樣品，能進行非常簡單且正確的 小鼠HMW脂聯素測定。實施例5人血清中HMW脂聯素分級測定中的糜蛋白酶利用向人血清(η = 14) 10 μ L，添加含50u/mL的糜蛋白酶的蛋白酶溶解液(50mM Tris 鹽酸緩衝液，ρΗ8· 0) 100 μ L，37°C下加溫20分鐘。進而添加700 μ L的樣品處理液(IOOmM 硼酸緩衝液，pHll.O)，將其作為人HMW測定用的處理樣品液。作為對象，以蛋白酶K7.5u/ mL代替糜蛋白酶，實施了同樣的樣品處理。各處理樣品中的脂聯素濃度是將處理樣品液以 BSA-PBST進一步稀釋10倍後，用與實施例3相同的方法測定的。測定結果如圖8所示。表示被利用於分級測定人血清中HMW脂聯素的蛋白酶K處理後殘留的脂聯素量的 吸光度，和糜蛋白酶處理後測定的吸光度幾乎完全一致，所以表明了糜蛋白酶也能利用於 人血清中HMW脂聯素的分級測定。
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權利要求
一種樣品中高分子量脂聯素的測定方法，其特徵在於，是使用蛋白酶將多聚體脂聯素分級分離而進行免疫學測定的方法，使糜蛋白酶作用於含多聚體脂聯素的樣品。
2.如權利要求1所述的測定方法，其中，樣品為人、小鼠或大鼠的血清或血漿。
全文摘要
本發明提供一種將多聚體脂聯素中的高活性型HMW脂聯素分級測定的方法。即，一種樣品中高分子量脂聯素的測定方法，是使用蛋白酶將多聚體脂聯素分級並免疫學性測定的方法，其特徵在於，使糜蛋白酶作用於含多聚體脂聯素的樣品。
文檔編號A61P9/12GK101960307SQ200980106328
公開日2011年1月26日 申請日期2009年2月27日 優先權日2008年2月29日
發明者海老沼宏幸 申請人:積水醫療株式會社