一種新的人腫瘤抑制基因kiaa0157及其應用的製作方法
2023-12-09 05:02:41 2
專利名稱：一種新的人腫瘤抑制基因kiaa0157及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的人腫瘤抑制基因，還涉及組成該基因的DNA及該DNA編碼的
蛋白質和在腫瘤診斷及治療中的應用。
發明背景 腫瘤發生是環境致癌因素與宿主基因相互作用，逐漸導致並不斷累積一系列基因 的異常，造成細胞增殖與死亡的動態平衡失調的結果。從正常細胞發展到危及生命的侵襲 性惡性腫瘤，大多需要經過癌前病變階段。惡性腫瘤的發生是一個多階段逐步演變的過程， 大致可分為激發、促進、進展和轉移等幾個階段。在癌變多階段性演變過程中，常積累了一 系列基因的突變，可涉及不同染色體上多種基因的變化，包括癌基因、抑癌基因、損傷修復 相關基因、細胞周期調控基因等。研究表明，腫瘤的發生、發展過程中涉及由於基因缺失或 突變引起的腫瘤基因的激活和腫瘤抑制基因的滅活，其中抑癌基因的失活是在大多數腫瘤 細胞中經常發生的事件.目前，對包括RB1、P53、WT1等的多個抑癌基因的認識已很深入，這 些研究不僅揭示了腫瘤發生發展的分子機制，還為腫瘤的早期診斷\分子分型\治療藥物 研發等提供了靶點.因此，這方面的研究一直是學術界的熱點之一，新的抑癌基因也正不 斷的得到發現和應用。 如下文所要描述的，在THAP11蛋白相互作用蛋白質的研究中，本發明者發現某些 基因的編碼產物可以與THAP11蛋白質相互作用，並在分離後系統鑑定了該基因。KIAA0157 定位於10q26. 13(NM_032182.) ， mRNA全長3008bp， cDNA1248bp，編碼416個胺基酸(序列
2) ，分子量為47KD的蛋白質。小鼠、大鼠與人的KIAA0157同源性高達90%以上，說明它在 進化過程中高度保守，可能發揮著重要的生物學功能。利用生物信息學分析顯示，KIAA0157 蛋白內部215-266位胺基酸處存在著一個coiled coil結構域，此結構域通常存在於單體 蛋白質中，且高度保守，通常介導蛋白與蛋白之間的相互作用。在對抗凋亡蛋白BPE(BRCA 複合體亞基4)的相互作用蛋白篩選過程中，KIAA0157被篩選到。但目前對其功能，至今尚 未見任何研究報導。
發明內容
本發明從人骨髓文庫中克隆到KIAA0157全長cDNA，並利用GFP-KIAA0157融合蛋 白技術檢測了 KIAA0157的細胞定位，結果表明KIAA0157為全細胞分布(圖2)。利用cDNA 微陣列晶片檢測顯示KIAA0157表達在多種組織，並在多種腫瘤組織中明顯下調表達(圖
3) ;此外，利用Real-time PCR檢測了 12例肝癌病人中KIAA0157的表達情況，表明在10例 病人中KIAA0157在肝癌組織中表達水平明細高於癌旁組織(圖4)。高表達KIAA0157可抑 制包括肝癌細胞\肺癌細胞\神經母細胞瘤細胞的生長(圖5)，並導致細胞發生G0/G1期 阻滯(圖6)。因此本發明專利者得出結論，該基因可能是一種新的腫瘤抑制基因。 因此，本發明提供了一種構成人基因的DNA，具有序列1所述核苷酸序列或有一個 或多個鹼基缺失、取代或增加的核苷酸序列。 本發明提供了一種蛋白質，它具有序列2所示胺基酸序列或相對於所述胺基酸序
本發明提供了一種探針，它包含與組成前述核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA。
本發明提供了一種蛋白抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。用本領域熟知的方 法很容易製得針對本發明的腫瘤抑制基因編碼的蛋白(多肽)或其片斷和類似物的多克隆 和單克隆抗體。 一旦純化，這些抗體可用作與本發明腫瘤抑制基因有關的疾病的實驗室試 劑和診斷性試劑。所得抗體可用於製備抗體柱、免疫沉澱和用Western印跡鑑定抗原。以毫 克規模製備針對本發明KIAA0157基因所編碼蛋白的單克隆抗體的通用方法如下用家兔、 馬、小鼠和豚鼠作為受免疫動物，用本領域已知的免疫動物的一種方案接種抗原蛋白，然後 從收集的血清中分離IgG等(圖l)。本發明的單克隆抗體也可用常規方法製得用抗原蛋 白接種小鼠進行免疫，從表現出足夠抗體滴度的小鼠體內取出脾臟。分離脾細胞，使所選B 細胞與B細胞米源的骨髓瘤細胞融合形成分泌抗體的雜交瘤細胞。用親和層析柱、離子交 換或凝膠過濾等方法從培養基中純化獲得雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。
本發明提供了一種重組病毒載體，它包括組成前述一種核苷酸序列組成的DNA。
本發明提供了一種DNA片段，該片段可用作引物，並由前述一種核苷酸序列的部 分序列組成。 本發明提供了一種人用診斷製劑，它包括前述探針及前述蛋白質的抗體。可用於 肝癌、肺癌、結腸直腸癌、乳腺癌、白血病、腎癌、神經系統腫瘤等惡性腫瘤中基因表達的檢查。 本發明還提供了含有前述蛋白的抗腫瘤藥物製劑。 因此，構成本發明基因的DNA，它們的轉錄物mRNA及其翻譯的蛋白質可用作多種
腫瘤的治療、診斷和預防用藥。 結合附圖更好地說明本發明 圖l KIAA0157全細胞分布。KIAA0157-GFP轉染NIH3T3細胞，螢光顯微鏡下觀察 螢光信號分布情況。結果顯示KIAA0157為全細胞分布。 圖2 KIAA0157抗體的製備。KIAA0157 (151-311aa)-GST載體轉化 E. coliBL21 (DE3)菌株，純化蛋白(A，B) 。 (C)KIAA0157抗血清檢測KIAA0157在HEK293中 的表達。血清滴度為l : 500即可檢測到目的蛋白的表達。 圖3利用腫瘤組織晶片檢測KIAA0157的表達。通過雜交方法檢測KIAA0157在19
種癌症及相應癌旁組織及9種腫瘤細胞株的表達情況。 圖4Real-time PCR檢測KIAA0157在肝癌組織及癌旁組織中的表達。結果顯示， 在所檢測的12例病人中有10例病人的KIAA0157在肝癌組織中的表達明顯低於癌旁組織。
圖5KIAA0157抑制細胞增殖。PcDNA3. 1-KIAA0157或PcDNA3. 1空載體轉染不同腫 瘤細胞後，12小時後接種6孔板，培養2周，檢測細胞集落數。結果顯示，在三種腫瘤細胞 中，KIAA0157過表達可抑制細胞增殖。 圖6KIAA0157表達引起SKNSH細胞G0/G1期阻滯。KIAA0157-GFP或GFP空載體分 別轉染SKNSH細胞，36小時後利用流式細胞術檢測GFP表達及細胞周期。
實施例1人KIAA0157 cDNA的獲得 以THAP11基因為誘餌，利用本領域通用的酵母雙雜交技術研究其相互作用蛋白， 獲得一段DNA序列，採用該DNA序列作BLAST檢索，本發明發現與推測的人類基因KIAA0157具有較高的同源性。提出人骨髓細胞總RNA，按反轉錄試劑盒(Promega公司)說明書進行反 轉錄。取lii g定量後的RNA，加水補至10. 5iil，70。C、10min，加入2ii1的10Xbuffer、2iU 的MgCl2、2ii 1的dNTP、lii 1的oligo dT、lii 1的rRNasin、 1. 5 ii 1的AMV (15U)，反應體系共 20 ii 1 ;42。C、lh ;94。C、5min ;4。C 、5min。RNA即反轉錄為cDNA。以5，-CGGAATTCAATGTCCTACAG AGAGCAGGTT-3 ， ；5 ， -GGGGATCCTTAAATCTGGGAGG TCTGAGTG-3'為引物PCR擴增目的片段。PCR 條件為 Cycle 1 (lx)
94°C 5min
Cycle 2(30x)
94°C lmin
55°C 30s
72 °C lmin
Cycle 3(lx)
72°C lOmin PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，結果產生特異的DNA條帶，將該DNA片段與 PMD-18-T載體(TAKARA生物公司)連接，連接產物轉化E. coli JM109,菌落PCR鑑定為陽 性克隆後，再經酶切鑑定後測序。測序後的序列為序列l所示。由於DNA序列確認它的真 實性，因此，用下述方法可產生特異性雜交探針使攜帶質粒的大腸桿菌菌株生長，純化質 粒DNA，用適當的限制性酶對其進行消化，電泳分離DNA片段。 生物信息學分析顯示，KIAA0157蛋白質有一個coil-coil結構域，通常介導蛋白 質相互作用。同源比對顯示，人與小鼠KIAA0157蛋白的同源性為93.5%，與大鼠KIAA0157 蛋白的同源性為94. 2 % 。 KIAA0157蛋白在人、小鼠和大鼠中具有如此高的同源性說明 KIAA0157基因在長期的進化過程中高度保守，提示這個基因可能具有重要的生物學功能。
實施例2KIAA0157亞細胞定位 為觀察KIAAO157的亞細胞定位，我們將KIAAO157 cDNA構建到pEGFP載體的 EcoRI/Kpnl位點，組成KIAA0157-GFP融合基因表達載體。將該表達載體轉染NIH3T3細胞， 雷射掃描共聚焦顯微鏡檢測顯示螢光信號分布為全細胞(
圖1)。
實施例3KIAA0157蛋白的原核表達、純化以及多克隆抗血清的製備
以KIAA0157-Flag質粒為模板，以5' -CGGAATTCCCAAGGAACAAGAAAGAAGATT-3'; 5' -CCGCTCGAGTTAAATCTGGGAGG TCTGAGT-3'為弓|物，利用PCR技術擴增KIAAO 157的 C端161個胺基酸。PCR產物與PGEX-4T-2載體經EcoRI 、 Xhol 1雙酶切後連接，轉化 E.coliBL21(DE3)感受態菌株，挑取單克隆，經酶切鑑定後，序列分析正確。將轉化有 GST-KIAA0157質粒的E. coliBL21 (DE3)接種LB培養基，37。C培養至OD :0. 6 1. 0，加ImM 的IPTG、3(TC誘導4h，離心收集細菌，SDS-PAGE檢測EDAG蛋白表達情況。經B-PER GST Spin Purification Kit純化獲得較純的GST-KIAA0157融合蛋白。用純化的GST-KIAA0157 融合蛋白免疫New Zealand大耳白，經過幾次加強免疫後，取兔血清，Western blot檢測 KIAA0157抗血清的效果，見圖2，抗血清在1 : 500稀釋時，可以檢測到轉染KIAA0157-Myc 質粒的HEK29細胞中的目標蛋白。 實施例4KIAA0157在多種癌及相應癌旁組織的表達有明顯差異
以5'-CGGAATTCAATGTCCTACAGAGAGCAGGTT-3 ，；5 ，-GGGGATCCTTAAATCTGGGAGGTCTGA GTG-3'為引物，採用PCR技術擴增cDNA片斷作為探針模板，a -32p標記後與CancerProf i 1 ing ArrayII雜交，檢測它在19種癌及相應癌旁組織以及9種腫瘤細胞系的表達情況。所檢測 的154對cDNA來自於154個病人的癌及相應癌旁組織。雜交結果顯示，KIAA0157在多種 組織中均有表達，且在不同的腫瘤組織中表達情況差異很大(圖3)。在甲狀腺(8/10)、肝 (3/3)、皮膚(6/10)、乳房(2/10)、直腸(3/10)、睪丸(5/10)等癌組織中，KIAA0157表達顯 著低於相應的癌旁組織；而在胃組織(7/10)、卵巢組織(6/10)、前列腺組織(3/4)當中則 相反，KIAA0157表達水平明顯增多。以上結果表明KIAA0157表達沒有組織特異性，它的功 能發揮可能與其組織分布不同有關。此外，在膜的右下方，排列了 9種腫瘤細胞系的cDNA， KIAA0157表達於所有9種腫瘤細胞系中，其中HL60、 A549、ML0T4、 SW480和Raji細胞系中 表達水平很高，而在其它腫瘤細胞系的雜交信號相對較弱。 我們進一步檢測了肝癌病人中KIAA0157的表達水平。通過常規方法提 取來自12例肝癌病人的肝癌及癌旁組織總RNA。經反轉錄獲得第一鏈cDNA。以 5 ' -AGGAAATACTAGCCAGCAAGAG-3 ， ； 5 ' -AAGATTCAACAACTCGCTCACT-3'為引物，利用SYBRgreen 試劑，進行Real-time PCR。 PCR條件
Cycle 1 Step 1 : Cycle 2 Step 1 : St印2 : Cycle 3 Step 1 : Cycle 4 Step 1 : Cycle 5 Step 1 :
(IX)
(40X)
(IX)
(IX)
(8IX)
95. 0°C
95. 0°C 65. 0°C
95. 0°C
55. 0°C
for 01:00.
for 00:10. for 00:30.
for 01:00.
for 01:00.
55. 0°C -95. 0°C for 00:10.
使用IQ 5 Multicolor Real-time PCR Detection System對報告螢光染料所發 射的螢光進行實時監測。螢光發射量反映循環數並由序列檢測儀的軟體讀出，給出對PCR 擴增有意義的循環數閾值，循環數的值與基因組DNA對數呈線性關係。結果顯示(圖4)，12 例肝癌病人中有10例病人的肝癌組織中KIAA0157表達明顯低於癌旁組織，表明KIAA0157 在肝癌發生中表達下調。 實施例5KIAA0157過表達抑制細胞集落形成 為了研究KIAA0157是否對細胞增殖有影響，我們構建了 KIAA0157-myc/hisB+真 核表達載體，並採用集落形成實驗檢測了 KIAA0157在SKNSH細胞中過表達後其增殖的變化 情況。如圖5所示，轉染KIAA0157-myC/hisB+的SKNSH細胞相對於轉空載體的細胞，其集 落形成的能力被明顯抑制。在肝癌細胞H印G2細胞及乳腺癌細胞MCF-7細胞中也得到相同 的結果。 實施例6KIAA0157表達引起SKNSH細胞G0/G1期阻滯 為了解KIAA0157對SKNSH細胞周期的影響，我們在SKNSH細胞轉染了帶GFP標籤
6的KIAA0157的真核表達載體，流式細胞儀檢測細胞周期各時相的分布。與轉染GFP空載體 相比，轉染KIAA0157真核表達載體後SKNSH細胞出現明顯的G0/G1期阻滯(圖6)。
序列表 〈110〉中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所 〈120〉 一種新的人腫瘤抑制基因KIAA0157及其應用 〈160>2 〈210>1 〈211>1248 〈212>DNA 〈213〉人禾中(Homo S即iens.)
〈400〉 1atggcggcgtccatttcgggctacaccttcagtgctgtgtgtttccacagcgccaacagc60■cgcggacctttactgggagaggteagacgtttagcatc120agtgactcaccacagaatttttgaaatccataaccatcag180ccttgttcaaaactttttagtttttatgacgg卿gtttg240gacaggattcgtcattgggtccggcgcaat3003CgC3gC3gCagatgtcctaC3g3g3gC3ggttcttcacaagcagctcacccgcatcctc360ggcgtgcccgacctcgtctttcttctcttcagcttcatctccactgccaacaattccact420cacgctttagaatatgtgctcttcagaccaateatcagaggatatcactc480gctattcccatectagccagc^gagtecaaagtgtcttc540acttctcagagttatgccaactgacttttttgac^ggat600ggagtgatgaggcgatttatcaggtttataatgcacttca660c郷cagtgtgtgc卿tgtgagcgagttgttgaatcttgtcaggcag^720teag^gacaaatcactcag■■gg^ca780ttgcagc鄉ccgtctgaaagcttggacccagcgttcagt840cctcggatgccgtcctctgggtttgcagctg^ggcag^gtacacttgg■gcctcggatcctcctcccccttactctgattttcacccaaac^tc^gaaagtectttg960agccactctcgcatgg^aggagtgtctttatgcctcgacctcaagctgtgggctcttcc1020aattatgcttccaccagtgcCgg3Ctg33gtatcctggaagtggggctgaccttcctcct1080 cccc朋3gag C3gctggag3 cagtggtgag gattcagacg acagtgatte tg朋朋tttg 1140 attgacccte cagagccttc teategtgaa tectcacatt caaaggattc tcgacccatg 1200 gcacatcccg acgaggaccc caggaacact cagacctccc agatttea 1248 〈210>2 〈211>416 〈212>PRT 〈213〉人禾中(Homo S即iens.) 〈400>2 Met Ala Ala Ser lie Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ala Val Cys Phe His 16 Ser Ala Asn Ser Asn Ala Asp His Glu Gly Phe Leu Leu Gly Glu Val 32
ArgGinGluGluThrPheSerlieSer AspSerGinlieSerAsnThr48GluPheLeuGinVallieGlulie His Asn His Gin Pro Cys Ser Lys64LeuPheSerPheTyrAspTyr Ala Ser Lys Val Asn Glu Glu Ser Leu80AspArglieLeuLysAspArgArgLys Lys Vallie Gly Trp Tyr Arg96PheArgArgAsnThrGinGinGinMetSerTyrArgGluGinValLeu112HisLysGinLeuThrArglieLeuGlyValProAspLeuValPheLeu128LeuPheSerPhelieSerThrAlaAsnAsnSerThrHisAlaLeuGlu144TyrValLeuPheArgProAsnArgArgTyrAsnGinArglieSerLeu160AlalieProAsnLeuGlyAsnThrSerGinGinGluTyrLysValSer176SerValProAsnThrSerGinSerTyrAlaLysVallieLysGluHis192GlyThrAspPhePheAspLysAspGlyValMetLysAsplieArgAla208lieTyrGinValTyrAsnAlaLeuGinGluLysValGinAlaValCys224AlaAspValGluLysSerGluArgValValGluSerCysGinAlaGlu240ValAsnLysLeuArgArgGinlieThrGinArgLysAsnGluLysGlu256GinGluArgArgLeuGinGinAlaValLeuSerArgGinMetProSer272GluSerLeuAspProAlaPheSerProArgMetProSerSerGlyPhe288AlaAlaGluGlyArgSerThrLeuGlyAspAlaGluAlaSerAspPro304ProProProTyrSerAspPheHisProAsnAsnGinGluSerThrLeu320SerHisSerArgMetGluArgSerValPheMetProArgProGinAla336ValGlySerSerAsnTyrAlaSerThrSerAlaGlyLeuLysTyrPro352GlySerGlyAlaAspLeuProProProGinArgAlaAlaGlyAspSer368GlyGluAspSerAspAspSerAspTyrGluAsnLeulieAspProThr384GluProSerAsnSerGluTyrSerHisSerLysAspSerArgProMet400AlaHisProAspGluAspProArgAsnThrGinThrSerGinlie41權利要求
一種構成人基因的DNA，具有序列1所示核苷酸序列或相對於所述核苷酸序列有一個或多個鹼基缺失、取代或增加的核苷酸序列。
2. —種蛋白質，它具有序列2所示胺基酸序列或相對於所述胺基酸序列有一個或多個 胺基酸缺失、替代或增加的胺基酸序列。
3. —種探針，它包含於權利要求1所述的核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA。
4. 一種重組病毒載體，它包括由權利要求1所述的核苷酸序列組成的DNA。
5. —種用作引物的DNA片段，由權利要求1所述的核苷酸序列的部分序列組成。
6. —種人用診斷製劑，它包括權利要求3所述探針。
7. 權利要求6所述的診斷製劑在肝癌、肺癌、結腸直腸癌、乳腺癌、白血病、腎癌、神經 系統腫瘤等惡性腫瘤中基因表達檢查的應用。
8. —種抗腫瘤藥物製劑，它含有權利要求2之一所述的蛋白質。
9. 一種能與權利要求2所述蛋白質特異性結合的多克隆和單克隆抗體。
10. —種診斷性藥物製劑，它含有權利要求9所述的抗體用來檢測腫瘤基因的表達。
全文摘要
本發明提供了一種新的人腫瘤抑制基因及其編碼蛋白。該基因和編碼蛋白可抑制腫瘤細胞生長，並在多種腫瘤組織中表達下調，與腫瘤的發生有密切關係。該基因及其編碼蛋白質和它們的衍生物可以被多種腫瘤的診斷、治療和藥物篩選。
文檔編號A61P35/00GK101712958SQ20081016719
公開日2010年5月26日 申請日期2008年10月8日 優先權日2008年10月8日
發明者李長燕, 楊曉明, 胡德慶, 詹軼群, 許望翔 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所