靶向絲-蘇氨酸蛋白激酶極光激酶a的鎖核酸核酶與應用的製作方法

2023-11-08 14:35:47 4

專利名稱：靶向絲-蘇氨酸蛋白激酶極光激酶a的鎖核酸核酶與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及靶向絲-蘇氨酸蛋白激酶極光激酶A(簡稱Aurora A，說明書的下述內 容中，以「Aurora Α」表示絲-蘇氨酸蛋白激酶極光激酶Α)的核酶及其應用。
背景技術：
前列腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，迄今尚無特效治療手段，前列腺癌發生的分 子機制尚未完全明了，但近年來的研究發現，前列腺癌的發生發展與Aurora A的異常具有 密切相關性。Aurora A基因定位於人染色體20ql3，該區域在人類惡性腫瘤中經常出現擴 增，因此基因治療值得探索。本專利申請的發明人曾設計合成了針對Aurora A的脫氧核酶DNAzyme2〔 DNAzyme2 的核苷酸序列見 Cancer Gene Ther. 200815(8) :518〕，實驗表明，所述 DNAzyme2 能有效抑制前列腺癌細胞中Aurora A的表達，並抑制前列腺癌細胞生長〔見Cancer Gene Ther. 200815(8) :517_525〕。但為了提高前列腺癌的治癒率，造福於人類，有必要獲得更多 的針對AuroraA的核酶。

發明內容
本發明的目的是提供一種新型的靶向絲-蘇氨酸蛋白激酶極光激酶A的鎖核酸 核酶(簡稱「Aurora A-LNAzyme」，說明書的下述內容中，以「Aurora A-LNAzyme」表示靶向 絲-蘇氨酸蛋白激酶極光激酶A的鎖核酸核酶)，以便開發出療效更好的治療前列腺癌的藥 物。本發明所述Aurora A-LNAzyme，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO :1所示。所 述核苷酸序列中，位於中部的15個脫氧核苷酸ggctagctacaacga組成催化結構域，位於催 化結構域左側的8個核苷酸tHSacagg組成第一底物識別結構域，位於催化結構域右側的 8個核苷酸cctLgaaatL組成第二底物識別結構域，第一底物識別結構域和第二底物識別結 構域均含有兩個鎖核酸#。本發明所述Aurora A-LNAzyme，採用固相亞磷醯胺三酯法在DNA自動合成儀上合 成。實驗證明本發明所述Aurora A-LNAzyme抑制了 Aurora A在前列腺癌細胞中的 表達；明顯抑制無胸腺小鼠體內前列腺癌移植瘤的生長，抑瘤率可達61%。因此，本發明所 述AuroraA-LNAzyme可在製備治療前列腺癌的藥中應用。本發明具有以下有益效果1、本發明設計和合成了一種新型的靶向絲-蘇氨酸蛋白激酶極光激酶A的鎖核酸 核酶，為前列腺癌的治療提供了新藥品。2、實驗表明，本發明所述Aurora A-LNAzyme能抑制Aurora A在前列腺癌細胞中 的表達；能明顯抑制無胸腺小鼠體內前列腺癌移植瘤的生長，與DNAzyme2相比，對腫瘤生 長的抑制能力更強，血清半衰期更長，可望成為更優的高效、特異、穩定的前列腺癌抑制劑。


圖1是Aurora A的電泳圖和核酶對Aurora A體外切割的電泳圖，圖中，1為Aurora A的電泳圖(405bp) ；2為經對照核酶處理的Aurora A的電泳圖，未見切割條帶；3為經 AuroraA-LNAzyme處理的Aurora A的電泳圖，可見293bp和112bp兩條切割條帶。圖2是Aurora A在前列腺癌細胞PC3中所表達蛋白的電泳圖，圖中，1為Aurora A在未轉染核酶的前列腺癌細胞PC3中所表達蛋白的電泳圖；2為Aurora A在轉染對照核 酶的前列腺癌細胞PC3中所表達蛋白的電泳圖；3為Aurora A在轉染Aurora A-LNAzyme的 前列腺癌細胞PC3中所表達蛋白的電泳圖；β-actin為Western blot的內參照，圖中顯示 其在1、2、3中表達水平一致，說明Aurora A條帶具有定量的可比性。圖3是流式細胞儀檢測的細胞周期分布圖，圖中，1為對照核酶導入前列腺癌細胞 PC3的周期分布圖，實驗表明，處理12h，24h，48h，前列腺癌細胞PC3的周期分布相似，圖中 為處理48h時前列腺癌細胞PC3的周期分布；2為Aurora A-LNAzyme導入前列腺癌細胞PC3 處理12h的前列腺癌細胞PC3的周期分布圖，圖中顯示G2/M期細胞明顯增多；3為Aurora A-LNAzyme導入前列腺癌細胞PC3處理24h的前列腺癌細胞PC3的周期分布圖，圖中顯示 G2/M期細胞明顯增多；4為Aurora A-LNAzyme導入前列腺癌細胞PC3處理48h的前列腺癌 細胞PC3的周期分布圖，圖中顯示G2/M期細胞明顯增多，同時出現明顯的凋亡峰(SubGl，箭 頭所指)。
具體實施例方式實施例1 :Aurora A-LNAzyme設計與合成Aurora A-LNAzyme設計引入鎖核酸，對本專利申請發明人曾設計合成的脫氧核 酶DNAzyme2進行修飾，設計成了本發明所述的Aurora A-LNAzyme0本發明所述Aurora A-LNAzyme的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO 1所示，所述核苷酸序列中，組成第一底物 識別結構域、催化結構域和第二底物識別結構域的核苷酸及其排列如下第一底物識別結構域 催化結構域 第二底物識別結構域5' tLtLaacaggggctagctacaacga cctLgaaatL3'為了驗證本發明所述Aurora A-LNAzyme的效果，還設計了對照核酶(Control)， 對照核酶的核苷酸序列及其排列如下第一底物識別結構域 催化結構域 第二底物識別結構域5' tLtLaacaggggctaactacaacga cctLgaaatL3'對照核酶與Aurora A-LNAzyme的不同之處是催化結構域中的第6個核苷酸不同， 即Aurora A-LNAzyme催化結構域中的第6個核苷酸是「g」，而對照核酶催化結構域中的第 6個核苷酸是「a」。本發明所述Aurora A-LNAzyme和對照核酶均採用固相亞磷醯胺三酯法(參見《核 酸結構.功能與合成下冊》，王德寶，祁國榮主編，科學出版社，1987. 6)，在DNA自動合成儀 上合成。自90年代起，國內外有關核苷酸序列的合成均已專業化、商品化。因此，將所設計 的Aurora A-LNAzyme和對照核酶交由有關專業公司合成。本發明的Aurora A-LNAzyme和 對照核酶交由美國sigma公司合成。
實施例 2 :Aurora A-LNAzyme 體夕卜切割 Aurora A1、試劑和材料RT-PCR 試劑盒為 Qiagen LongRange 2-step RT-PCR Kit (德國 Qiagen 公司)；PC3、LNCaP和Du 145前列腺癌細胞購自美國ATCC ；質粒pcDNA3. 1 (+)購自美國 Invitrogen 公司；EcoRI酶，XhoI酶和T4DNA連接酶購自寶生物公司；Aurora A-LNAzyme 實施例1設計與合成，用生理鹽水配製成50 μ M/L的溶液備 用；對照核酶實施例1設計與合成，用生理鹽水配製成50 μ M/L的溶液備用；
T7/SP6體外轉錄試劑盒購自美國Roche公司；地高辛化學發光法檢測試劑盒購自美國Roche公司；甲醯胺購自美國Sigma公司；溴酚藍購自美國Sigma公司；EDTA 購自美國Sigma公司；聚丙烯醯胺購自美國Sigma公司。2、實驗方法(1)克隆 Aurora A cDNA 部分片段從基因文庫(進入號AF011468)中獲取Aurora A的編碼序列，用RT-PCR克隆 Aurora A保守片斷。分別提取三個前列腺癌細胞PC3、LNCaP和Dul45的總RNA，然後以相 同比例合併，以其作為模板，合成第一條cDNA鏈，再以所述cDNA為模板進行PCR擴增在 95°C預變性6分鐘後，進入循環擴增階段(94°C, Imin ；58°C, Imin ；70°C，90s)，循環34次。 引物序列設計如下上遊引物5 『-GCGAATTCC ATCATGGACCGATCTAA-3』，帶有EcoRI酶切位 點及二個保護鹼基；下遊引物5』-GCCTCGAGTTCAGGTGCCGATGGCAG-3』，帶有XhoI酶切位點及 二個保護鹼基。PCR擴增後得到長度為341bp的PCR產物(見SEQ ID NO :2)，其經凝膠電 泳純化回收後，經EcoRI和XhoI酶切，並由T4DNA連接酶催化，連接到質粒pcDNA3. 1 (+)的 EcoRI和XhoI酶切位點之間，形成重組質粒pcDNA3-Aurora A_l。(2) Aurora A的體夕卜切害Ij用XhoI酶切重組質粒pcDNA3_Aurora A_l，使之線型化。按T7/SP6體外轉錄試 劑盒說明書的要求，用T7/SP6體外轉錄試劑盒合成地高辛-UTP標記的Aurora Α,此地高 辛-UTP標記的Aurora A由405個核苷酸構成(見SEQ ID NO :3)，其中核酶切點位於SEQ ID N03的112位鹼基a和113位鹼基c之間。將地高辛-UTP標記的Aurora A和Aurora A-LNAzyme 以 1 100 的摩爾比加到 20 μ 1 反應緩衝液(50mmol/L Tris-Hcl, ρΗ7· 2，15mM Mgcl2,0.01% SDS)中，40°C孵育2小時後，加質量濃度96%的甲醯胺、質量濃度0. 的溴 酚藍和20mmol/L EDTA中止反應。上述反應的反應產物在質量濃度50%的甲醯胺中變性8 分鐘，置於冰上冷卻，然後在質量濃度8%的聚丙烯醯胺凝膠(含8mol/l尿素)，500V,電泳 1. 5h。電泳結束後，按地高辛化學發光法檢測試劑盒說明書的要求，用地高辛化學發光 法檢測切割條帶。採用上述方法用對照核酶體外切割Aurora Α,並用地高辛化學發光法檢測試劑盒
5檢測切割條帶。3、實驗結果地高辛化學發光法檢測切割條帶的結果見圖1，圖1顯示，本發明所述Aurora A-LNAzyme能酶切約80%的Aurora A，對照核酶不能切割Aurora A。實施例3 =Aurora A-LNAzyme轉染前列腺癌細胞PC31、試劑、材料和器材FuGENE6，購自美國 Roche 公司；Aurora A-LNAzyme 實施例1設計與合成，用生理鹽水配製成50 μ M/L的溶液備 用；對照核酶實施例1設計與合成，用生理鹽水配製成50 μ M/L的溶液備用；前列腺癌細胞PC3 購自美國ATCC ；Coulter流式細胞儀，購自Beckman公司；數據分析軟體ModFitLT 2.0，美國 Verity Software House 產品。2、實驗方法常規培養前列腺癌細胞PC3，當前列腺癌細胞PC370%融合以後，通過FuGENE6按 照說明書要求分別將濃度300nmol/L的Aurora A-LNAzyme液、濃度300nmol/L的對照核 酶液轉染到前列腺癌細胞PC3中，在轉染24小時和48小時後分別收集上述被轉染Aurora A-LNAzyme、對照核酶的前列腺癌細胞PC3，然後用常規Western印跡方法分別檢測未轉然 核酶的前列腺癌細胞PC3中的Aurora A蛋白，轉染了 Aurora A-LNAzyme和對照核酶的前 列腺癌細胞PC3中的AuroraA蛋白。為測定前列腺癌細胞PC3中Aurora A表達水平對細胞周期進程的影響，使用流式 細胞術測定細胞周期分布，測定操作通過FuGENE6按照說明書要求分別將濃度300nmol/ L的AuroraA-LNAzyme液、濃度300nmol/L的對照核酶液轉染到前列腺癌細胞PC3中，在轉 染(處理)12、24、48小時後分別收集被轉染Aurora A-LNAzyme的前列腺癌細胞PC3與被 轉染對照核酶的前列腺癌細胞PC3，然後分別用0. IM的PBS衝洗、用含0. 05mg/L碘化丙啶 的 Krishan 緩衝液(0. 1% sodium citrate,0. 2mg ml_lRNAase,0. 3% NP40)終止反應，在 4°C孵育30分鐘，繼後用Coulter流式細胞儀進行檢測分析，用ModFitLT 2. O軟體進行數 據分析。3、實驗結果Western印跡方法檢測結果見圖2，圖2顯示，轉染對照核酶的前列腺癌細胞PC3 中Aurora A蛋白的表達水平與未轉染對照核酶的前列腺癌細胞PC3中Aurora A蛋白的 表達水平相同；轉染Aurora A-LNAzyme的前列腺癌細胞PC3與未轉染Aurora A-LNAzyme 的前列腺癌細胞PC3相比，所含Aurora A蛋白明顯減少。上述檢測結果表明，本發明所述 Aurora A-LNAzyme抑制了 AuroraA在前列腺癌細胞中的表達。流式細胞術檢測結果見圖3，圖3顯示，在Aurora A-LNAzyme處理組的細胞中， 出現於G2-M期的細胞百分率在12小時增加到約18. 23%, 24小時為28. 02%,48小時為 39. 56%。在對照核酶處理組的細胞中,G2-M期的細胞百分率在12小時、24小時、48小時每 個時間點都接近於9. 27%。相較於對照核酶處理組的細胞，Aurora A-LNAzyme處理組的細 胞中有一部分處於細胞周期中的亞G1的細胞(18. 33%)，提示凋亡細胞明顯增加。上述檢
6測結果表明，本發明所述AuroraA-LNAzyme介導的Aurora A表達受抑，會引起前列腺癌細 胞PC3在G2-M期異常聚集直至最終凋亡。實施例4 =LNAzyme抑制小鼠前列腺癌移植瘤的生長1、材料和實驗動物前列腺癌細胞PC3 購自美國ATCC ；Aurora A-LNAzyme 實施例1設計與合成；對照核酶實施例1設計與合成；BALB/C裸鼠四川大學動物實驗中心提供。2、實驗方法BALB/C雌性裸鼠12隻，BALB/C雄性裸鼠12隻，平均年齡5周，平均體重20g。所 有裸鼠被分成三組，每組由四隻雌性BALB/C裸鼠和四隻雄性BALB/C裸鼠組成。第一組為 生理鹽水組，第二組為Aurora A-LNAzyme組，第三組為對照核酶組。將IXlO7前列腺癌細胞PC3經皮下注射移植到各組的每隻裸鼠。5周以後，腫瘤組 織的體積增加到約65mm3用於後續實驗。第一組中的各只裸鼠每天接受10 μ 1/只的生理鹽水注射。第二組中的各只裸鼠 每天通過瘤內多位點注射將Aurora A-LNAzyme液注入腫瘤組織，各只裸鼠每天的注射量 為8 μ g AuroraA-LNAzyme溶於10 μ 1生理鹽水形成的Aurora A-LNAzyme液。第三組中 的各只裸鼠每天通過瘤內多位點注射將對照核酶液注入腫瘤組織，各只裸鼠每天的注射量 為8μ g對照核酶溶於10μ 1生理鹽水形成的對照核酶液。注射14天後處死每組裸鼠。測 量各只裸鼠體重和腫瘤溼重及體積，數據以(平均數士標準差)表示。計算抑瘤率〔抑瘤 率=(生理鹽水組瘤重_核酶處理組瘤重)/生理鹽水組瘤重Χ100 %〕，通過方差分析來進 行統計學分析，P < 0. 05視為有顯著性差異。3、實驗結果實驗數據見表1。表114天時裸鼠體重，移植瘤體積及重量(η = 8) ^Aurora A-LNAzyme組與生理鹽水組和對照核酶組比較，P < 0. 05實驗數據表明，本發明所述Aurora A-LNAzyme明顯抑制了人前列腺癌在無胸腺小 鼠體內的移植瘤的生長，而對照核酶並沒有表現出抑制腫瘤生長的效果。實施例 5 :Aurora A-LNAzyme 與 DNAzyme2 的比較1、血清半衰期比較(I)Aurora A-LNAzyme 血清半衰期測定①試劑和儀器酚、氯仿、聚丙醯胺變性凝膠購自美國Sigma公司；FH2408自動定標器購自北京核儀器廠；
Aurora A-LNAzyme 實施例1設計與合成。②測定方法Aurora A-LNAzyme 的 32P 標記參照文獻[Sambrook J. Molecular Cloning a LaboratoryManual,2nd. New York CoId Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989]進行。降解反應如下取每分鐘脈衝數(counts per minute, cpm)為2X105 的標記 Aurora A-LNAzyme, 20 μ 1 人血清，0. 9nmol 未標記 Aurora A_LNAzyme,力口水至總體 積為100 μ 1。混勻，置37°C水浴。分別於反應後第lh、2h、4h、8h、16h各取20μ 1樣品，酚 和氯仿抽提後，20%聚丙醯胺變性凝膠電泳，-20°C壓片8h，在X線觀片燈上切下對應條帶 凝膠，FH2408自動定標器計數CPM值，按下式計算Aurora A-LNAzyme的降解率，降解率= 降解條帶CPM/ (未降解條帶CPM+降解條帶CPM) X 100%。③測定結果AuroraA-LNAzyme 在 16 小時的降解率為 12. 3%。(2)DNAzyme2血清半衰期測定DNAzyme2的血清半衰期測定同上述方法，測定結果為DNAZyme2血清半衰期為4 小時。2、抑瘤率的比較Aurora A-LNAzyme的抑瘤率為61 % (見實施例4)，DNAzyme2的抑瘤率為53% (見 CancerGene Ther. 200815(8) :523)。上述數據表明，與DNAzyme2相比，本發明所述Aurora A-LANzyme對腫瘤生長的抑 制能力更強，血清半衰期更長，因此Aurora A-LNAzyme可望成為更優的高效、特異、穩定的 前列腺癌抑制劑。
權利要求
一種靶向絲 蘇氨酸蛋白激酶極光激酶A的鎖核酸核酶，其特徵在於它的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO1所示，所述核苷酸序列中，位於中部的15個脫氧核苷酸ggctagctacaacga組成催化結構域，位於催化結構域左側的8個核苷酸tLtLaacagg組成第一底物識別結構域，位於催化結構域右側的8個核苷酸cctLgaaatL組成第二底物識別結構域，第一底物識別結構域和第二底物識別結構域均含有兩個鎖核酸tL。
2.權利要求1所述靶向絲-蘇氨酸蛋白激酶極光激酶A的鎖核酸核酶在製備治療前列 腺癌的藥中的應用。
全文摘要
一種靶向絲-蘇氨酸蛋白激酶極光激酶A的鎖核酸核酶，其核苷酸序列為序列表中SEQ IDNO1所示，所述核苷酸序列中，位於中部的15個脫氧核苷酸組成催化結構域，位於催化結構域左側的8個核苷酸組成第一底物識別結構域，位於催化結構域右側的8個核苷酸組成第二底物識別結構域，第一底物識別結構域和第二底物識別結構域均含有兩個鎖核酸tL。所述靶向絲-蘇氨酸蛋白激酶極光激酶A的鎖核酸核酶可在製備治療前列腺癌的藥中應用。
文檔編號A61P13/08GK101914536SQ201010221558
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月9日 優先權日2010年7月9日
發明者伍金林, 唐軍, 屈藝, 張 林, 張莉, 李熙鴻, 母得志, 王 華, 石晶, 趙鳳豔 申請人:四川大學