用於檢測禽畜肉加熱終點溫度的試劑盒及其檢測方法
2023-11-08 14:37:37 4
專利名稱：用於檢測禽畜肉加熱終點溫度的試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種用於檢測加熱禽畜肉終點溫度的試劑盒及其檢測方法，屬於食品衛生檢驗領域。
背景技術：
由於國際上各種食源性致病菌導致的惡性中毒事件接連發生，大多數中毒事件是由於生產中未按嚴格的衛生要求進行操作，如加熱溫度過低、時間過短造成的。研究表明，偶蹄動物即使感染了口蹄疫病毒等疫病，如果經一定的高溫加熱後，病原物即可被殺滅。研究還表明，如果對家禽肉或野生禽肉肉進行高溫加熱，即可殺滅禽流感病原體。因此，禽畜肉及其製品的熱加工問題便引起了國際社會的關注。
美國USDA的FSIS規定，用牛催化酶實驗、凝乳酶實驗和酸性磷酸酶活性試驗等測定肉類產品是否經過適當的熱處理。其中，牛催化酶實驗用來檢測牛肉和豬肉產品是否被加熱到65℃(USDA-FSIS，1986Vb)；酸性磷酸酯酶的活性試驗檢測罐裝火腿、野餐肉類(USDA-FSIS，1986Va)；通過檢測過氧化氫酶來區分牛肉的生熟(Eye，1982)。
Hunt等(1995)利用肉類提取物的反射光顏色的不同來檢測其生熟度。Ellekj_r和Isaksson(1992)Ellekjaer(1992)提出利用NIR光譜儀對牛肉產品的加熱終點溫度進行檢測。K.Thyholt等(1998)報導了利用近紅外和可見光在400-2500nm的反射光譜檢測加熱過的牛肉產品的加熱終點溫度。Hsieh等通過篩選單克隆抗體，對禽畜肉中的加熱終點溫度進行檢測。酶聯免疫檢測方法靈敏且高通量，但是單克隆抗體的篩選過程比較費時費力。
因此，在目前食品衛生檢驗領域中需要一種對禽畜肉加熱終點溫度進行快速、高效的檢測方法或產品。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種可以避免以上現有技術缺點的禽畜肉加熱終點溫度的檢測試劑盒及其檢測方法。採用該試劑盒對禽畜肉加熱終點溫度進行測定，測定速度快、準確度高，因此可以得到切實的推廣應用。
本發明的技術方案的原理是通過以下反應而實現的1)將樣品與主要由底物緩衝液、氧化型輔酶和2，4-二硝基苯肼組成的試劑混合，使之發生如下反應
丙酮酸+2，4-二硝基苯肼→丙酮酸二硝基苯腙反應中，乳酸脫氫酶催化乳酸生成丙酮酸，然後丙酮酸與試劑中的2，4-二硝基苯肼反應生成丙酮酸二硝基苯腙。丙酮酸二硝基苯腙在鹼性溶液中呈棕紅色，其顏色深淺與丙酮酸濃度呈正比。由於禽畜肉中的乳酸脫氫酶在高溫下被失活，因此通過檢測丙酮酸二硝基苯腙即可檢測乳酸脫氫酶的含量或活性，並與已被加熱到規定溫度的禽畜肉的標準酶活值進行比較，最終可判斷樣品是否達到適當的加熱溫度。
2)加入鹼性溶液氫氧化鈉後，室溫放置5分鐘，檢測最終反應物在主波長440nm吸光度上升的幅度，了解丙酮酸的變化檢測出禽畜肉產品曾經加熱到的最高溫度。
通常步驟2)將最終反應物置於酶標儀下，檢測主波長440nm吸光度值，通過與線性回歸處理過的標準曲線進行比較，測算出禽畜肉加熱終點溫度。
以上樣品與試劑混合比例為按體積比1/500到1/1500，以上過程的測定溫度控制在常規的30℃到40℃範圍，反應時間控制在常溫10-30分鐘。
實現本發明方法的禽畜肉加熱終點溫度檢測試劑盒可以是四劑試劑1氧化型輔酶 5-15mmol/L2，4-二硝基苯肼0.5-2mmol/L；試劑2丙酮酸溶液 0.1-1.0mmol/L；試劑3強鹼 0.4-5mmol/L；試劑4(包含底物緩衝液)乳酸鋰 0.1-0.5mol/L pH為6.6-11.0二乙醇胺 0.1-0.3mol/L也可以是五劑試劑1氧化型輔酶 5-15mmol/L；試劑22，4-二硝基苯肼0.5-2mmol/L；試劑3丙酮酸溶液 0.1-1.0mmol/L試劑4強鹼 0.4-5mmol/L；試劑5(包含底物緩衝液)乳酸鋰 0.1-0.5mol/L pH為6.6-11.0二乙醇胺 0.1-0.3mol/L其中氧化型輔酶是NAD或NADP，或是NAD或NADP的衍生物。強鹼是氫氧化鈉或氫氧化鉀。可以包括穩定劑，穩定劑是乙二醇、甘油、丙二醇、聚糖、聚醇中的一種或者幾種組合。
本發明還包括本試劑盒用於檢測禽畜肉加熱終點溫度的方法，其使用步驟如下(1)用試劑盒中的丙酮酸、底物緩衝液、蒸餾水、2，4-二硝基苯肼配製乳酸脫氫酶酶活標準曲線；
(2)分別將待測樣品、標準樣品、空白樣品CK與各試劑的總體積比例為1/500到1/1500置於玻璃管中，測定溫度控制在30℃到40℃範圍，反應時間控制在常溫10-30分鐘，反應後用試劑盒中的氫氧化鈉終止反應，室溫放置5分鐘，將最終反應物置於酶標儀下，檢測並計算各管吸光度值與空白對照管吸光度值Bck的差值B，其中最高酶活的標準樣品對應的吸光度的差值為Bmax；(3)以B/Bmax與其對應於步驟1的標準曲線的酶活繪製散點圖；(4)對散點圖進行線性回歸處理，得到回歸方程，並根據回歸方程計算出待測樣品的乳酸脫氫酶酶活；(5)比較待測樣品的乳酸脫氫酶酶活與加熱禽畜肉的標準酶活值，當待測樣品酶活高於標準酶活值，判斷禽畜肉加熱終點溫度未達到規定的溫度；當待測樣品酶活低於標準酶活值，判斷禽畜肉加熱終點溫度達到規定的溫度。
其中規定的加熱溫度終點達到70℃的豬肉和牛肉的標準酶活值分別為3157±62U/L和132±6.2U/L。
本發明還包括所述的試劑盒在檢測禽畜肉加熱終點溫度方面的用途以及所述的方法在檢測禽畜肉加熱終點溫度方面的用途。
詳細檢測過程如下檢驗方法1)標準曲線的繪製表1標準曲線繪製方法
2)樣品檢驗方法蛋白粗提物的製備樣品(來源於待檢樣品幾何中心的樣品)去除脂肪和結綈組織，加3倍體積預冷的PBS，冰浴中進行勻漿，呈肉糜狀，然後4℃6000r/min離心10分鐘，取上清，濾紙過濾。再4℃13000r/min離心10分鐘，取其上清為牛肉樣品的蛋白粗提物。
測定時按照表2的方法操作，表2酶活測定方法
將上述溶液在96孔板中混勻，37℃水浴10-30分鐘，加入一定量氫氧化鈉溶液，室溫放置5分鐘後，波長440nm測定，檢測並計算各管吸光度值與空白對照管吸光度值Bck的差值B，其中最高酶活的標準樣品對應的吸光度的差值為Bmax；以B/Bmax與其對應於標準曲線的酶活繪製散點圖；對散點圖進行線性回歸處理，得到回歸方程，並根據回歸方程計算出待測樣品的乳酸脫氫酶酶活。
3)結果判斷方法比較待測樣品的乳酸脫氫酶酶活與加熱禽畜肉的標準酶活值，當待測樣品酶活高於標準酶活值，判斷禽畜肉加熱終點溫度未達到規定的溫度；當待測樣品酶活低於標準酶活值，判斷禽畜肉加熱終點溫度達到規定的溫度。
應當理解的是，由於不同禽畜肉的規定的加熱溫度不同，其標準酶活值也不同。但是對於某種禽畜肉而言，如果確定某種溫度是符合要求的溫度，並且由於測量標準酶活方法屬於本技術領域的常規方法，因此該溫度下禽畜肉的標準酶活值可以也應是已知的。
另外，由於相同禽畜肉在不同的加工方式(如燻、烤、煮、醃、炸等)下其標準酶活值也不同。但是對於某種已知加工方式的禽畜肉而言，如果確定某種溫度是符合要求的溫度，因此該溫度下禽畜肉的標準酶活值可以也應是已知的。
以豬肉和牛肉為例，豬和牛酶活性檢測方法，加熱終點溫度達70℃要求後，用常規方法測量其肌肉組織中的乳酸脫氫酶(LDH)活性分別為3157±62U/L和132±6.2U/L，如果待測樣品的LDH活性高於上述值，則判斷該樣品的加熱終點溫度未達到規定的70℃。樣品LDH活性等於或低於上述值為陰性時，則樣品加熱終點溫度達到70℃。
應當理解的是，由於在測量過程中存在系統差異，或是在所上所述的不同加工條件下(或不同溫度標準條件)、或是不同技術人員等客觀因素的影響，某一禽畜肉測量的標準酶活值可能會不同(如上述的豬肉、牛肉)。但是使用同一試劑盒測定的標準酶活值和待測樣品的酶活值的關係顯然是固定不變的，因此其判斷方法或原則也是固定不變的。也就是說，在使用同一試劑盒測定的標準酶活值和待測樣品的酶活值的基礎上，當比較待測樣品的乳酸脫氫酶酶活與加熱禽畜肉的標準酶活值時，只要待測樣品酶活高於標準酶活值，則判斷禽畜肉加熱終點溫度未達到規定的溫度；或只要待測樣品酶活低於標準酶活值，則判斷禽畜肉加熱終點溫度達到規定的溫度。另外，本發明的禽畜肉還可以是馬肉、羊肉、鹿肉、驢肉、狗肉、兔肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿肉、鵪鶉肉、火雞肉、鴕鳥肉等，或野生禽肉，如野雞或山雞肉、斑鳩肉、鷓鴣肉、水鳥肉等等。與豬、牛肉相比，由於這些禽畜肉的檢測目標都是乳酸脫氫酶，並且檢測原理、檢測方法相同，根據以上所述，本領域技術人員在理解本發明原理的基礎上使用本發明的檢測試劑盒顯然可以獲得任一種禽畜肉達到規定溫度處理後的標準酶活值。
本發明的有益效果是由於完全利用酶學方法，酶解反應具有特異性高的特點，酶解反應的特異性使測試結果準確。酶學檢測方法簡便、易於操作。
圖1是本發明的酶活性與B/Bmax線性回歸標準曲線。
具體實施例方式
實施例1某豬肉，曾經加熱到65℃，用加熱終點溫度檢測試劑盒進行檢測。本實施例中用到的加熱終點溫度檢測試劑盒包括二乙醇胺 0.2mol/L乳酸鋰 0.3mol/L pH為8.8氧化型NAD11.3mmol/L2，4-二硝基苯肼 1.0mmol/L甘油 20％丙酮酸溶液 0.5mmol/L氫氧化鈉 0.4mmol/L檢驗方法如下1)標準曲線的繪製表3標準曲線繪製方法
2)樣品檢驗方法蛋白粗提物的製備豬肉樣品去除脂肪和結綈組織，加3倍體積預冷的PBS，冰浴中進行勻漿，呈肉糜狀，然後4℃6000r/min離心10分鐘，取上清，濾紙過濾。再心4℃13000r/min離10分鐘，取其上清為豬肉樣品的蛋白粗提物。
用底物緩衝液將蛋白粗提物稀釋10倍，該稀釋液為上清稀釋液，其檢測方法按照表4的方法檢測。
表4酶活測定方法
將上述溶液在96孔板中混勻，37℃水浴30分鐘，加入0.5mL 5mol/L NaOH，室溫放置5分鐘後，波長440nm測定，讀取各管吸光度以測定孔與對照孔吸光度之差值，查標準曲線求酶活單位。其測量結果如下表5酶標儀測量結果
結果分析見表6。
表6數據的分析
3)標準曲線的線性回歸處理及處理待測值a)以B/Bmax為Y值，對應的酶活為X值做散點圖。
見圖1，圖中B/Bmax為Y值，對應的酶活為X值。
其中可使用任何工具或軟體製作散點圖，如excell軟體。
b)由該圖計算進行線性回歸處理，得到其方程式為y＝0.1041x+0.5281，其中x是酶活，y＝B/Bmaxc)由上述公式推算豬肉的酶活是
由此可算出該上清稀釋液中乳酸脫氫酶含量為410.0075U/L，那麼蛋白粗提物中乳酸脫氫酶含量為4100.1U/L，大於3157±62U/L的範圍，可以判斷該豬肉樣品未曾加熱到70℃。
實施例2某牛肉，曾經加熱到70℃，用加熱終點溫度檢測試劑盒進行檢測。本實施例中用到的加熱終點溫度檢測試劑盒包括二乙醇胺 0.2mol/L乳酸鋰 0.5mol/L pH為8.8氧化型NAD15mmol/L2，4-二硝基苯肼 2.0mmol/L乙二醇 40％丙酮酸溶液 1.0mmol/L氫氧化鈉 5.0mmol/L
檢驗方法如下1)標準曲線的繪製表7標準曲線繪製方法
2)樣品檢驗方法蛋白粗提物的製備牛肉樣品去除脂肪和結綈組織，加3倍體積預冷的PBS，冰浴中進行勻漿，呈肉糜狀，然後4℃6000r/min離心10分鐘，取上清，濾紙過濾。再4℃13000r/min離心10分鐘，取其上清為牛肉樣品的蛋白粗提物。
表8酶活測定方法
將上述溶液在96孔板中混勻，37℃水浴15分鐘，加入5mL 0.4mol/L NaOH，室溫放置5分鐘後，波長440nm測定，讀取各管吸光度以測定管與對照管吸光度之差值，查標準曲線求酶活單位。
其測量結果如下表9酶標儀測量結果
結果分析見表10。
表10數據的分析
根據實施例1中所述的線性回歸處理方法，由此可算出該牛肉樣品乳酸脫氫酶含量為133.2U/L，處於132±6.2U/L範圍內，從而可以判斷該牛肉樣品曾經加熱到70℃。
實施例3某牛肉，曾經加熱到65℃，用加熱終點溫度檢測試劑盒進行檢測。本實施例中用到的加熱終點溫度檢測試劑盒包括二乙醇胺 0.1mol/L乳酸鋰 0.1mol/L pH為6.6氧化型NAD 5.0mmol/L2，4-二硝基苯肼0.5mmol/l丙二醇 20％丙酮酸溶液 0.1mmol/l氫氧化鈉 0.4mmol/l檢驗方法如下1)標準曲線的繪製表11標準曲線繪製方法
2)樣品檢驗方法蛋白粗提物的製備牛肉樣品去除脂肪和結綈組織，加3倍體積預冷的PBS，冰浴中進行勻漿，呈肉糜狀，然後4℃6000r/min離心10分鐘，取上清，濾紙過濾。再4℃13000r/min離心10分鐘，取其上清為牛肉樣品的蛋白粗提物。
表12酶活測定方法
將上述溶液在96孔板中混勻，37℃水浴10分鐘，加入5mL 0.4mol/L NaOH，室溫放置5分鐘後，波長440nm測定，讀取各管吸光度以測定管與對照管吸光度之差值，查標準曲線求酶活單位。其測量結果如下表13酶標儀測量結果
結果分析見表14。
表14數據的分析
同樣根據實施例1中的線性回歸處理方法，由此可算出該牛肉樣品乳酸脫氫酶含量為2777.4U/L，超出132±6.2U/L範圍，從而可以判斷該牛肉樣品未曾加熱到70℃。
實施例4某豬肉，曾經加熱到75℃，用加熱終點溫度檢測試劑盒進行檢測。本實施例中用到的加熱終點溫度檢測試劑盒包括二乙醇胺0.3mol/L乳酸鋰 0.1mol/LpH為6.6氧化型NAD 5.0mmol/L2，4-二硝基苯肼 0.5mmol/L聚糖20％丙酮酸溶液 0.1mmol/L氫氧化鈉0.4mmol/L檢驗方法如下1)標準曲線的繪製表15標準曲線繪製方法
2)樣品檢驗方法蛋白粗提物的製備豬肉樣品去除脂肪和結綈組織，加3倍體積預冷的PBS，冰浴中進行勻漿，呈肉糜狀，然後4℃6000r/min離心10分鐘，取上清，濾紙過濾。再4℃13000r/min離心10分鐘，取其上清為豬肉樣品的蛋白粗提物。
用底物緩衝液將蛋白粗提物稀釋10倍，該稀釋液為上清稀釋液，其檢測方法按照表6的方法檢測。
表16酶活測定方法
將上述溶液在96孔板中混勻，30℃水浴10分鐘，加入5mL 0.4mol/L NaOH，室溫放置5分鐘後，波長440nm測定，讀取各管吸光度以測定管與對照管吸光度之差值，查標準曲線求酶活單位。其測量結果如下表17酶標儀測量結果
結果分析見表18表18數據的分析
根據實施例1的方法，由此可算出該上清稀釋液中乳酸脫氫酶含量為313.5U/L，那麼蛋白粗提物中乳酸脫氫酶含量為3135U/L，處於3157±62U/L範圍內，從而可以判斷該豬肉樣品曾經加熱到70℃。
實施例5某牛肉，曾經加熱到65℃，用加熱終點溫度檢測試劑盒進行檢測。本實施例中用到的加熱終點溫度檢測試劑盒包括二乙醇胺 0.2mol/L乳酸鋰 0.1mol/LpH為6.6氧化型NADP 5.0mmol/L2，4-二硝基苯肼 0.5mmol/L聚醇 20％丙酮酸溶液 0.1mmol/L氫氧化鈉 0.4mmol/L檢驗方法如下1)標準曲線的繪製表19標準曲線繪製方法
2)樣品檢驗方法蛋白粗提物的製備牛肉樣品去除脂肪和結綈組織，加3倍體積預冷的PBS，冰浴中進行勻漿，呈肉糜狀，然後4℃6000r/min離心10分鐘，取上清，濾紙過濾。再4℃13000r/min離心10分鐘，取其上清為牛肉樣品的蛋白粗提物。
表20酶活測定方法
將上述溶液在96孔板中混勻，40℃水浴10分鐘，加入5mL 0.4mol/L NaOH，室溫放置5分鐘後，波長440nm測定，讀取各管吸光度以測定管與對照管吸光度之差值，查標準曲線求酶活單位。
其測量結果如下表21酶標儀測量結果
結果分析見表22。
表22數據的分析
根據實施例1中所述的線性回歸處理方法，由此可算出該牛肉樣品乳酸脫氫酶含量為2777.4U/L，超出132±6.2U/L範圍，從而可以判斷該牛肉樣品未曾加熱到70℃。
權利要求
1.一種用於檢測禽畜肉加熱終點溫度的試劑盒，其特徵在於，包括試劑1氧化型輔酶5-15mmol/L2，4-二硝基苯肼 0.5-2mmol/L；試劑2丙酮酸溶液0.1-1.0mmol/L；試劑3強鹼 0.4-5mmol/L；試劑4(包含底物緩衝液)乳酸鋰0.1-0.5mol/L pH為6.6-11.0二乙醇胺 0.1-0.3mol/L。
2.權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，其中包括試劑1氧化型輔酶5-15mmol/L；試劑22，4-二硝基苯肼 0.5-2mmol/L；試劑3丙酮酸溶液0.1-1.0mmol/L試劑4強鹼 0.4-5mmol/L；試劑5(包含底物緩衝液)乳酸鋰0.1-0.5mol/L pH為6.6-11.0二乙醇胺 0.1-0.3mol/L。
3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於，其中氧化型輔酶是NAD或NADP，或是NAD或NADP的衍生物。
4.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於，其中強鹼是氫氧化鈉或氫氧化鉀。
5.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於，可以包括穩定劑，穩定劑是乙二醇、甘油、丙二醇、聚糖、聚醇中的一種或者幾種組合。
6.權利要求1至5中任一項所述的試劑盒用於檢測禽畜肉加熱終點溫度的方法。
7.權利要求1至5中任一項所述的試劑盒用於檢測禽畜肉加熱終點溫度的方法，其特徵在於，使用步驟如下(1)用試劑盒中的丙酮酸、底物緩衝液、蒸餾水、2，4-二硝基苯肼配製乳酸脫氫酶酶活標準曲線；(2)分別將待測樣品、標準樣品、空白樣品CK與各試劑的總體積比例為1/500到1/1500置於玻璃管中，測定溫度控制在30℃到40℃範圍，反應時間控制在常溫10-30分鐘，反應後用試劑盒中的氫氧化鈉終止反應，室溫放置5分鐘，將最終反應物置於酶標儀下，檢測並計算各管吸光度值與空白對照管吸光度值Bck的差值B，其中最高酶活的標準樣品對應的吸光度的差值為Bmax；(3)以B/Bmax與其對應於步驟1的標準曲線的酶活繪製散點圖；(4)對散點圖進行線性回歸處理，得到回歸方程，並根據回歸方程計算出待測樣品的乳酸脫氫酶酶活；(5)比較待測樣品的乳酸脫氫酶酶活與加熱禽畜肉的標準酶活值，當待測樣品酶活高於標準酶活值，判斷禽畜肉加熱終點溫度未達到規定的溫度；當待測樣品酶活低於標準酶活值，判斷禽畜肉加熱終點溫度達到規定的溫度。
8.權利要求6或7所述的方法，其特徵在於，其中畜肉是豬肉、牛肉、羊肉、馬肉、鹿肉、驢肉、狗肉、兔肉，禽肉是雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿肉、鵪鶉肉、火雞肉、鴕鳥肉或野生禽鳥肉。
9.權利要求6或7所述的方法，其特徵在於，其中規定的加熱溫度終點達到70℃的豬肉和牛肉的標準酶活值分別為3157±62U/L和132±6.2U/L。
10.權利要求1至5中任一項所述的試劑盒在檢測禽畜肉加熱終點溫度方面的用途。
11.權利要求6至9中任一項所述的方法在檢測禽畜肉加熱終點溫度方面的用途。
全文摘要
本發明涉及禽畜肉加熱終點溫度酶活檢測方法及加熱終點溫度檢測試劑盒，屬於食品衛生檢驗領域。該試劑盒包括底物緩衝液、氧化型輔酶、2，4－二硝基苯肼、氫氧化鈉和丙酮酸鈉。通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生酶偶聯反應，再將最終反應物置於酶標儀下，檢測主波長吸光度變化的情況，從而測算出禽畜肉的加熱終點溫度。本發明靈敏度高、精確度好、高通量，便於推廣應用。
文檔編號G01N25/00GK1912578SQ20061001504
公開日2007年2月14日 申請日期2006年7月31日 優先權日2006年7月31日
發明者鄭文杰, 賀豔, 劉烜, 趙衛東 申請人:天津出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心