一種可降解多環芳烴的菌株及其應用的製作方法
2023-12-04 07:07:41
本發明涉及一種可降解多環芳烴的菌株及其應用，屬於生物工程
技術領域：
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背景技術：
：多環芳烴是一類持久性有機汙染物。土壤環境中多環芳烴汙染主要來自於石油及其衍生產品的生產使用和木材、有機高分子化合物、紙張等含碳氫化合物的物質的不完全燃燒。由於多環芳烴及其衍生物具有致癌性、致突變性和致畸性，目前多環芳烴汙染修復問題已引起人們的極大關注。目前，對於這些多環芳烴類的汙染物，某些特定種類的微生物可催化多環芳烴進行氧化還原、脫羧、水解和脫水等各種化學反應，使之最終礦化。較之其他多環芳烴汙染的修復處理，採用微生物降解能夠更有效、低耗能地降解這些難降解的汙染物，且微生物降解也是現今多環芳烴汙染修復的主要途徑。為此國內外進行了大量多環芳烴降解微生物的篩選工作。到目前為止，已分離出多個具有多環芳烴降解能力的菌株。然而，就目前已報導的這些多環芳烴降解微生物中，大多只能降解萘(2環)、芴(3環)等低環多環芳烴，而當多環芳烴的苯環個數達到或超過4個時，其生物毒性明顯升高，生物可降解性顯著降低。雖然，現有技術中也有篩選到的菌株能夠降解高環多環芳烴的效果，如中國專利(授權公告號：CN102943052B)公開了一株耐重金屬的多環芳烴降解菌，其也能夠降解多環芳烴萘、菲、熒蒽、芘、苯並蒽和苯並芘的能力。但是，目前篩選到這一些的具有降解多環芳烴尤其是能夠降解高環多環芳烴的菌株仍然相對較少，使其應用受到了一定的限制。因此，如何篩選得到更多的菌株，使能夠高效降解高環多環芳烴的微生物菌株顯得尤為重要，使更廣泛的採用生物降解多環芳烴汙染的應用。技術實現要素：本發明針對上述現有技術中所存在的問題，本發明提供一種可降解多環芳烴的菌株及其應用，解決的問題是如何實現一種能夠降解高環多環芳烴的新菌株。本發明的目的之一是通過以下技術方案得以實現的，一種可降解多環芳烴的菌株，其特徵在於，該菌株為CitrobacterfreundiiL2-14，在中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCCNO：M2016371。本發明可降解多環芳烴的菌株是從多環芳烴汙染的土壤中篩選得到的一株新的菌株，屬於弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)，命名為L2-14，該菌株已於2016年07月04日保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNO：M2016371，保藏地點為中國武漢武漢大學，地址為湖北省武漢市武昌珞珈山。本發明可降解多環芳烴的菌株可在15～35℃，pH值6.0～8.5培養條件下較好生長；菌株形態特徵為革蘭氏陰性，杆狀，周生鞭毛，無芽孢，不生莢膜；菌株在LB固體培養基上培養18小時可形成圓形半透明的菌落，表面溼潤，邊緣整齊；同時，本菌株對多環芳烴汙染，尤其是對高環多環芳烴具有快速降解能力，且降解底物範圍廣、降解率高，從而也使其在多種多環芳烴汙染修復中有著廣闊的應用潛力。在上述可降解多環芳烴的菌株中，作為優選，所述菌株的16SrRNA序列如SEQ.NO1所示。菌株的另一種表達形式，具有相應的鹼基序列。在上述可降解多環芳烴的菌株中，作為優選，所述菌株具有降解多環芳烴的能力。由於本菌株能夠以多環芳烴為碳源進行生長，尤其是對高環芳烴的也具有較好的降解能力，從而使具有降解多環芳烴的能力，實現對汙染土壤的修復過程。在上述可降解多環芳烴的菌株中，其中的多環芳烴可以是低環多環芳烴如萘、芴等等，也可以是高環芳烴，本菌株對這些多環芳烴均具有較好的降解能力。作為優選，所述多環芳烴為具有4環以上的多環芳烴。由於多環芳烴的苯環個數達到或超過4個時，其生物毒性明顯升高，生物可降解性顯著降低，而本發明通過篩選得到的菌株對具有4環以上的多環芳烴有著很好的適應性，對這些高環的多環芳烴同樣具有較好的降解效果，從而能夠對高環多環芳烴汙染的環境達到修復的效果。作為進一步的優選，所述多環芳烴選自菲、熒蒽、芘、苯並蒽或苯並芘。在上述可降解多環芳烴的菌株中，作為優選，所述菌株具有以多環芳烴為碳源和能源進行生長的能力。正是由於該菌株能夠以多環芳烴為碳源和能源進行生長，從而實現對汙染物多環芳烴降解的效果。當然，本菌株也可以在營養培養基如普通牛肉膏蛋白腖、普通LB、營養瓊脂中生長。本發明的目的之二是通過以下技術方案得以實現的，一種上述可降解多環芳烴的菌株應用，其特徵在於，所述菌株用於修復多環芳烴汙染的土壤。由於本發明的可降解多環芳烴菌株能夠以多環芳烴為碳源和能源進行生長，從而也具有了對多環芳烴汙染物進行降解的能力，通過將其應用到汙染土壤中對汙染物進行降解，從而達到修復土壤的效果，且由於本菌株對於高環多環芳烴也具有較好的降解能力，從而也提高了其應用的廣泛性。綜上所述，與現有技術相比具有以下優點：1.本發明可降解多環芳烴的菌株，能夠對多環芳烴汙染實現快速解降的效果，尤其是對高環多環芳烴有快速降解能力，且降解底物範圍廣、降解率高。2.本發明可降解多環芳烴的菌株，具有以多環芳烴為碳源和能源進行生長的能力，無需外加其它碳源和能源，就能夠從而實現有針對性的解降多環芳烴汙染物的效果。附圖說明圖1本可降解多環芳烴的菌株CitrobacterfreundiiL2-14隨時間對萘的降解曲線圖。圖2本可降解多環芳烴的菌株CitrobacterfreundiiL2-14隨時間對芘萘的降解曲線圖。圖3本可降解多環芳烴的菌株CitrobacterfreundiiL2-14隨時間對苯並芘的降解曲線圖。具體實施方式下面通過具體實施例和附圖，對本發明的技術方案作進一步具體的說明，但是本發明並不限於這些實施例。實施例1本可降解多環芳烴菌株CitrobacterfreundiiL2-14的分離和篩選從某固廢拆解場採集距地表下15cm處的表層土壤樣品，按每1g土壤樣品加入1mL馴化液的比例(土壤樣品：馴化液的比例為1g：1mL)加入馴化液進行馴化培養,馴化培養條件為溫度25℃，轉速100rpm，時間72h。其中，上述馴化液的配方為：(NH4)2SO4：2g/L；MgSO4：0.2g/L；K2HPO4：4g/L；KH2PO4：6g/L；多環芳烴(萘、菲、熒蒽、芘、苯並蒽和苯並芘)混合物200mg/L，其中，萘、菲、熒蒽、芘、苯並蒽和苯並芘的加入量可以是等量，也可以採用不同的含量，主要是加入這些多環芳烴起到較好的馴化效果。然後，將上述馴化混合物按質量比為1：50的比例接種於無機鹽選擇培養基中進行選擇培養，其中，無機鹽選擇培養基配方為：蛋白腖：5g/L；(NH4)2SO4：2g/L；MgSO4：0.2g/L；K2HPO4：4g/L；KH2PO4：6g/L；多環芳烴(萘、菲、熒蒽、芘、苯並蒽和苯並芘)混合物200mg/L，其中，萘、菲、熒蒽、芘、苯並蒽和苯並芘的加入量可以是等量，也可以採用不同的含量；選擇培養條件為溫度25℃，轉速100rpm，時間72h，得到相應的選擇培養物。將上述選擇培養物用磷酸鹽緩衝溶液進行梯度稀釋，選取合適濃度的梯度稀釋液稀釋塗布於固體無機鹽選擇培養基上，選取單菌落進行分離，即分離出一株菌株命名為L2-14。該菌株於2016年7月4日保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏號CCTCCNO：M2016371。同時，對該菌株進行鑑定，其中，菌株L2-14的16SrDNA基因PCR擴增、測序由上海美吉生物公司完成，得到長度為1430bp的序列，具體測序結果見SEQNO.1。同時，根據測序結果構建系統發育樹，選擇同源性大於97％的基因序列進行系統發育分析，系統發育樹分析結果表明菌株L2-14與Citrobacterfreundii的進化距離最近，結合形態、菌落特徵及生理生化特性，鑑定菌株屬於弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)，即本CitrobacterfreundiiL2-14菌株。將本CitrobacterfreundiiL2-14菌株接種在LB固體培養基(胰蛋白腖1.0％，酵母提取物0.5％，氯化鈉1.0％，瓊脂2％)培養18小時形成圓形半透明的菌落，表面溼潤，邊緣整齊。且該菌株CitrobacterfreundiiL2-14的生理生化特徵如下表1所示：表1：鑑定項目鑑定結果吲哚產生-M.R實驗+V.P實驗-明膠水解-尿酶實驗+H2S+苯丙氨酸脫羧酶-精氨酸雙水解酶-KNO3+KCN+丙二酸鹽利用-檸檬酸鹽利用+葡萄糖利用+麥芽糖利用+阿拉伯糖利用+木糖利用+甘露醇利用+蔗糖利用+實施例2本CitrobacterfreundiiL2-14菌株用於降解多環芳烴取本菌株CitrobacterfreundiiL2-14接種在LB固體培養基中進行活化；再選取單菌落接種於5mL的LB液體培養基進行培養，在溫度28℃且轉速100rpm的條件下進行培養至菌液OD600≈1；然後，將菌液按照2％的接種量接種於無機鹽葡萄糖培養基中，在溫度28℃且轉速100rpm的條件下培養至菌液OD600≈1；其中，無機鹽葡萄糖培養基配方為：蛋白腖：5g/L；葡萄糖：10g/L；(NH4)2SO4：2g/L；MgSO4：0.2g/L；K2HPO4：4g/L；KH2PO4：6g/L，培養結束後，得到相應的菌液。將上述菌液用10000r/min離心機離心5分鐘，取下層菌體沉澱，用pH為7.0～7.5的磷酸鹽緩衝液洗滌2次，備用。取上述菌體分別等體積重懸於無機鹽-萘、無機鹽-芘、無機鹽-苯並芘培養基中，控制溫度為25℃、轉速為100rpm進行培養12天。過程中採用高效液相色譜檢測不同時間的上述三種體系中萘、芘、苯並芘的含量來測試降解效果；其中，無機鹽-萘培養基配方為：蛋白腖：2g/L；(NH4)2SO4：2g/L；MgSO4：0.2g/L；K2HPO4：4g/L；KH2PO4：6g/L；萘：200mg/L；無機鹽-芘培養基配方為：蛋白腖：2g/L；(NH4)2SO4：2g/L；MgSO4：0.2g/L；K2HPO4：4g/L；KH2PO4：6g/L；芘：200mg/L；無機鹽-苯並芘培養基配方為：蛋白腖：2g/L；(NH4)2SO4：2g/L；MgSO4：0.2g/L；K2HPO4：4g/L；KH2PO4：6g/L；苯並芘：200mg/L。其中，檢測結果如圖1-3所示；從圖中可以看出，12天後，上述體系中萘、芘、苯並芘的降解率分別為84.6％、84.6％、62.6％，從而也說明了本發明的菌株具有較好的降解多環芳烴的能力，同時也能夠較好的降解高環多環芳烴的能力。同樣，將無機鹽-苯並芘培養基中的苯並芘替代為菲、熒蒽或苯並蒽，12天後，降解率均能夠達到60％以上。本發明中所描述的具體實施例僅是對本發明精神作舉例說明。本發明所屬
技術領域：
的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或採用類似的方式替代，但並不會偏離本發明的精神或者超越所附權利要求書所定義的範圍。儘管對本發明已作出了詳細的說明並引證了一些具體實施例，但是對本領域熟練技術人員來說，只要不離開本發明的精神和範圍可作各種變化或修正是顯然的。當前第1頁1 2 3