紅細胞處理洗脫放散試劑盒及其製備方法

2023-12-04 19:31:01 2

紅細胞處理洗脫放散試劑盒及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種紅細胞處理洗脫放散試劑盒，提供一種用於解離致敏在紅細胞膜上的IgG抗體的方法及其應用。本紅細胞處理洗脫放散試劑盒處理IgG抗體致敏的紅細胞所得到的含抗體的放散液以及直接抗人球蛋白試驗（DAT）陰性的紅細胞，不僅可以用於經典的間接抗人球蛋白試驗，還可以用於微柱凝膠卡檢測紅細胞抗原或檢測放散液中的抗體。所述試劑盒中包含以下3種試劑：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ，其中溶液Ⅰ與溶液Ⅱ按照體積比1:1~1:8的比例混合，配製成洗脫液；溶液Ⅲ用於判定反應終點。本發明提供一種使用方便且質量穩定的放散試劑盒及其製備方法。
【專利說明】紅細胞處理洗脫放散試劑盒及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用於解離致敏在紅細胞上的IgG抗體的方法及其應用。更具體的說，本發明涉及一種紅細胞處理洗脫放散試劑盒的組成、製備方法及其應用，涉及輸血醫學領域。
【背景技術】
[0002]紅細胞上的抗原與血清中抗體在適合條件下發生凝集或致敏，這種結合是可逆的。如果改變某些物理條件(如溫度)或化學條件(如pH時)，抗體又會從抗原抗體複合物上分離下來，這種方法稱放散試驗。放散試驗是把結合到紅細胞膜上的抗體解離下來，用於ABO亞型的鑑定、新生兒溶血病的診斷和自身免疫性溶血性貧血患者紅細胞的抗體特異性的鑑定，以及吸收後把抗體再放散下來進行鑑定或製備單特異性抗體，是免疫血清學實驗中非常重要的技術手段。放散試驗的方法多種多樣，但各有優缺點。很多試劑須臨用新配，步驟繁瑣，部分方法操作不易成功。本發明紅細胞處理洗脫放散試劑盒處理IgG抗體致敏紅細胞所得到的含抗體的放散液以及直接抗人球蛋白試驗(DAT)陰性的紅細胞，不僅可以用於經典的間接抗人球蛋白試驗，還可以用於微柱凝膠卡檢測紅細胞抗原或檢測放散液中的抗體。本發明紅細胞處理洗脫放散試劑盒響應了市場的需求。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一種使用方便且質量穩定的紅細胞處理洗脫放散試劑盒及其製備方法，可以用於解離紅細胞膜上致敏的IgG抗體。抗體解離後，仍能保持紅細胞的結構，這樣放散後的紅細胞仍能檢定其血型。
[0004]本發明的目的是這樣實現的:一種紅細胞處理洗脫放散試劑盒，它由溶液1、溶液II和溶液III組成。
[0005]所述的溶液I的主要成分是乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)，溶液II的主要成分是甘氨酸(Gly)，溶液III的主要成分是三羥甲基氨基甲烷(Tris)和溴甲酚紫。
[0006]所述溶液II的pH值至1.2^1.8 試劑盒的製備方法，包括以下步驟:
(1)溶液I的配製:稱取一定量的乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)溶於蒸餾水或去離子水，定容至1000ml ;溶液I中乙二胺四乙酸二鈉的質量濃度為8-12% ;優選10% ；
(2)溶液II的配製:稱取一定量的甘氨酸(Gly)溶於生理鹽水，定容至100ml，用12mol/L鹽酸(HCl)調pH值至1.2^1.8。溶液II的中甘氨酸的質量濃度為0.6-0.9% ;優選
0.75%。
[0007]洗脫液的配製:使用前將溶液I與溶液II按照體積比1:1~1:8的比例混合，配製成洗脫液。
[0008](3)溶液III的配製:①稱取一定量的三羥甲基氨基甲烷(TriS)和氯化鈉(NaCl)，溶於蒸餾水或去離子水，定容至1000ml 稱取一定量的溴甲酚紫溶於50ml，0.02mol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液中，再加水稀釋至250ml。將步驟①Tris-NaCl溶液與步驟②溴甲酚紫溶液混勻。溶液III用於判定反應終點。
[0009]將上述試劑溶液1、I1、III組裝成盒，2?25° C保存。
[0010]本發明的原理是，在酸性環境下，由於pH值很小，紅細胞上的抗原以及所結合的抗體產生質子化，帶有同型的正電荷，使得通過正負電荷彼此結合的抗原抗體失去結合能力，由於帶有同型電荷相互排斥而解離。抗原、抗體蛋白的三維結構由此受到影響，H+與天冬氨酸以及穀氨酸上的0H_基團結合引起三維立體分子結構的打開線性化，導致抗原抗體空間結構互補性的降低，抗原抗體解離。
[0011]本專利發明的紅細胞處理洗脫放散試劑盒，具有以下優點:(I)反應快速，可在40分鐘內判斷檢測結果；操作簡便，無汙染；(2)此方法可以解離紅細胞膜上致敏的IgG抗體。抗體解離後，仍能保持紅細胞的結構，這樣對放散後的紅細胞仍能檢定其血型；(3)獲得的紅細胞可以用於抗原檢測，也可以用於自身吸收；獲得的放散液可以用於抗體檢測；(4)所需孵育時間少，去除抗體效率高；(5)採用溴甲酚紫作為指示劑，溶液顏色由紫色轉變為藍色，準確確定反應終點。
[0012]【具體實施方式】:
本發明的紅細胞處理洗脫放散試劑盒的製備方法包括以下步驟:
(1)溶液I的配製:稱取IOOg乙二胺四乙酸二鈉溶於蒸餾水或去離子水，定容至IOOOml ；
(2)溶液II的配製:稱取0.75g甘氨酸溶於生理鹽水，定容至100ml，用鹽酸調pH值至
1.2?1.8 ；
(3)溶液III的配製:①稱取2.1g的三羥基氨基甲烷和5.25g氯化鈉，溶於蒸餾水或去離子水，定容至IOOOml ;②稱取0.25g的溴甲酚紫溶於50ml，0.02mol/L氫氧化鈉溶液中，再加水稀釋至250ml ;將步驟①三羥甲基氨基甲烷-氯化鈉溶液與步驟②溴甲酚紫溶液按4:1混勻。溶液III用於判定反應終點。
[0013]將上述試劑溶液1、II和III組裝成盒。
[0014]本發明試劑盒的使用方法
實施例1:製備直接抗人球蛋白試驗(DAT)陰性紅細胞
(I)洗脫液的配製:溶液I與溶液II按照1:廣1:8體積比混合，配製成洗脫液。
[0015](2)將DAT陽性的紅細胞，以1:4 (體積比)生理鹽水洗滌6次，得到壓積紅細胞。
[0016](3)取試管I支，加入洗脫液2ml，再加入Iml洗滌後的DAT陽性的壓積紅細胞，混勻。
[0017](4)室溫孵育2min (不宜超過2min)，立即加入0.1ml溶液III，混勻，3000rpm XImin離心，分離得壓積紅細胞及上清液。
[0018](5)以1:4體積比生理鹽水洗滌壓積紅細胞3次，用生理鹽水配製成2?4%濃度紅細胞懸液。
[0019](6)另取試管I支加入I滴上述2?4%濃度的紅細胞和2滴抗人球蛋白試劑(抗IgG),混合後離心，輕微振蕩試管，肉眼檢查無凝集。
[0020]實施例2:製備放散液
(I)洗脫液的配製:溶液I與溶液II按照體積比1:廣1:8的比例混合，配製成洗脫液。[0021 ] (2) DAT陽性的紅細胞，以1:4 (體積比)生理鹽水洗滌6次，得到壓積紅細胞。
[0022](3)取試管I支，加入洗脫液I飛ml，再加入Iml洗滌後的DAT陽性的壓積紅細胞，混勻。
[0023](4)室溫孵育2min (不宜超過2min)，立即加入0.1ml溶液III，混勻，3000rpm XImin離心，分離得壓積紅細胞及上清液。
[0024](5)將上清液移至另一乾淨的試管中，滴加溶液III，以溶液顏色由紫色轉變為藍色為反應終點。
[0025](6) 3000rpm X 3min離心，上清液即為可用於抗體檢測的放散液。
【權利要求】
1.一種紅細胞處理洗脫放散試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒由溶液1、溶液II和溶液III組成； 所述的溶液I的主要成分是乙二胺四乙酸二鈉； 所述的溶液II的主要成分是甘氨酸； 所述的溶液III的主要成分是三羥甲基氨基甲烷和溴甲酚紫。
2.根據權利要求1所述的一種紅細胞處理洗脫放散試劑盒，其特徵在於，所述的溶液II的PH值是1.2~1.8。
3.製備如權利要求1所述的紅細胞處理洗脫放散試劑盒的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: (1)溶液I的配製:稱取乙二胺四乙酸二鈉溶於蒸餾水或去離子水，配置乙二胺四乙酸二鈉的質量濃度為8-12% ； (2)溶液II的配製:稱取甘氨酸溶於生理鹽水，並用鹽酸調pH值至1.2^1.8 ;溶液II的中甘氨酸的質量濃度為0.6-0.9% ； (3)溶液III的配製:①稱取一定量的三羥甲基氨基甲烷Tris和氯化鈉NaCl，溶於蒸餾水或去離子水，定容至1000ml 稱取一定量的溴甲酚紫溶於50ml，0.02mol/L氫氧化鈉溶液中，再加水稀釋至250ml，將步驟①Tris-NaCl溶液與步驟②溴甲酚紫溶液混勻； 將上述試劑溶液1、II和III組裝成盒。
4.根據權利要求3所述的紅細胞處理洗脫放散試劑盒的製備方法，其特徵在於，所述溶液III的配製:①稱取2.1g的三羥基氨基甲烷和5.25g氯化鈉，溶於蒸餾水或去離子水，定容至1000ml ;②稱取0.25g的溴甲酚紫溶於50ml，0.02mol/L氫氧化鈉溶液中，再加水稀釋至250ml ;將步驟①三羥甲基氨基甲烷-氯化鈉溶液與步驟②溴甲酚紫溶液按4:1混勻。
5.根據權利要求3所述的紅細胞處理洗脫放散試劑盒的製備方法，其特徵在於，所述溶液I中乙二胺四乙酸二鈉的質量濃度為10%。
6.根據權利要求3所述的紅細胞處理洗脫放散試劑盒的製備方法，其特徵在於，溶液II的中甘氨酸的質量濃度為0.75%。
7.—種紅細胞處理洗脫放散試劑盒的使用方法，其特徵在於，將權利要求1-6之一所述的紅細胞處理洗脫放散試劑盒中的溶液I和溶液II製備成洗脫液，所述洗脫液中溶液I與溶液II按照體積比1: 1~1: 8，溶液III用於判定反應終點。
【文檔編號】G01N1/28GK103674645SQ201310673750
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月13日 優先權日:2013年12月13日
【發明者】陳玉平 申請人:江陰力博醫藥生物技術有限公司