一種前列腺癌生物標誌物miR-126-5P、診斷試劑盒及應用的製作方法

2023-12-04 19:22:26

專利名稱：一種前列腺癌生物標誌物miR-126-5P、診斷試劑盒及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種前列腺癌生物標誌物miR-126-5P、診斷試劑盒及應用，尤其涉及前列腺癌分子標誌物miR-126-5P在前列腺癌高危人群的篩選、前列腺癌的鑑定、前列腺癌治療狀況的監測、前列腺癌指導用藥的監測、和前列腺癌預後監測等領域用試劑中的應用。
背景技術：
MicroRNA (miRNA)是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈微小RNA分子，其在細胞內具有多種重要的調節作用。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNA也可以調節同一個基因。這種複雜的調節網絡既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNA的組合來精細調控某個基因的表達。據推測，miRNA調節著人類三分之一的基因。MicroRNA因其高度的保守性、時空特異性、穩定性以及組織特異性等特點使其優於蛋白質、DNA片段等其他生物標誌物而在疾病發病機制研究、早期診斷、個體化治療和預後等方面發揮越來越重要的作用。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50歲以後發病，95%發生於60歲以上的老年男性，發生率持續地隨年齡增長而增加。在美國，前列腺癌的發病率已經超過肺癌，成為第一位危害男性健康的腫瘤。中國等亞洲前列腺癌的發病率遠遠低於歐美國家，但近年來呈現上升趨勢。前列腺癌早期多無任何症狀，即使有所不適，也不足以引起病人的重視。當腫瘤增大壓迫尿道時，又往往與前列腺增生相混淆。在我國約80%的病人首先發現遠處轉移病灶，然後才發現前列腺癌。此時，病變已屬晚期，預後不良。目前，前列腺癌的臨床診斷方式主要有以下幾種:直腸指檢、血清前列腺特異性抗原(PSA)檢測、直腸超聲波檢測、活組織病理檢查等。直腸指檢是最簡單、最經濟實用的方法，主要是通過醫生的食指觸摸 前列腺，用以發現很多無症狀的前列腺癌患者，有可能獲得早期診斷及根治的機會。但上述方法均存在一定的局限性。如直腸指檢的局限性是:(1)當患者的前列腺腫塊不大時，容易漏診；(2)有的患者前列腺癌腫大不明顯，但已屬晚期，不易根治；(3)對患者有一定的不適和危害，當患者直腸有疾患時不能使用此檢測；(4)當醫生經驗不足時有漏診或誤診可能。正常情況下血液中的PSA不高(不高於4ng/ml)，當處於前列腺癌及其他前列腺疾病患病狀態時PSA升高，成為目前篩查前列腺癌最敏感的瘤標，但其也存在一定局限性:(1)需要取血檢測，對患者有一定的損傷；(2)PSA增高也常見於非前列腺癌疾病，如前列腺炎症、前列腺肥大等，因此不易確診；(3) PSA增高確診前列腺癌時，往往患者已屬中、後期，達不到早期診斷的目的。前列腺超聲波檢測操作簡便直觀、無損傷，通過顯示腫塊的大小、數目、位置、密度、邊緣、形態、有無鈣化以及鈣化的形態、大小、數目、分步以及周圍的暈環、皮膚改變等提供定位及定性徵象並判斷病變的性質:其局限性是:(1)對緻密性的小癌灶容易漏診；(2)有時不能提供明確的定性診斷；(3)因其不能顯示腫瘤的內部結構及周圍組織所以診斷符合率很低；(4)對一些缺乏典型徵象的實性良惡性腫塊有較高的誤診率。活組織病理檢查因其創傷性、複雜性不能作為初篩的手段，但它是前列腺癌確診的金標準，一般與其他方法技術連用。近年來的研究表明，前列腺癌和miRNA密切相關，它們可能參與腫瘤的發生、發展和轉移，所以對腫瘤的發病機制、早期診斷、個體化治療、轉移的檢測和預後等可能有相應的作用。與前列腺癌相關的miRNA種類較多且作用不一，已有研究表明在前列腺癌患者中上調的 miRNA 包括 miR-375, miR_148a，miR_200c，miR_106a，mir-128,miR-126-5P8，miR-20a，和 miR_30b 等；下調的 miRNA 包括 miR-143，miR-145，miR-199a_5p，miR-223, miR-27a, miR-152和miR-424等。雖然已在該領域進行了一些研究，但現有的miRNA標誌物的準確性、靈敏性方面均有不足，在臨床和研究中仍然存在尋找更加準確和靈敏的前列腺癌miRNA標誌物的需求。在研究過程中發現，miR-126_5P在前列腺癌患者血清中的含量比正常人血清中的含量高，而當前列腺癌患者在接收手術後，其血清中的miR-126-5P的含量就回落到與正常人血清中的含量一樣的正常水平。由此可見，患者在患病期間增加的miR-126-5P與前列腺癌的腫瘤存在著密切的相關性。

發明內容
為了克服上述現有技術中存在的不足，本發明提供了一種準確性和靈敏性更高的前列腺癌生物標誌物miR-126-5P、診斷試劑盒及該生物標誌物在前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療狀況監測、預後監測中的應用。為了解決上述技術問題， 本發明所採用的技術方案是:一種前列腺癌生物標誌物miR-126_5P,其特徵在於，所述的miR-126_5P為一種miRNA，miR-126-5P 的核苷酸序列為:SEQ ID N0.15』 -CATTATTACTTTTGGTAC-3』。前述的前列腺癌生物標誌物miR-126-5P在製備前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療狀況監測、預後監測的試劑盒中的應用。前述的前列腺癌生物標誌物miR-126-5P在製備前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療狀況監測、預後監測的試劑盒中的應用，通過檢測被試者血清中miR-126-5P的含量，並與正常水平miR-126-5P含量相比較以進行前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療狀況監測、預後監測。前述的前列腺癌生物標誌物miR-126_5P在製備前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療狀況監測、預後監測的試劑盒中的應用，所述被試者血清中miR-126-5P的含量通過總RNA提取、加polyA尾、RT-PCR、定量PCR進行檢測。應用前列腺癌生物標誌物miR-126_5P的診斷試劑盒，其特徵在於，包括:血清總RNA提取試劑、RNA加polyA試劑、RT-PCR試劑、定量PCR試劑，所述的定量PCR試劑包括miR-126-5P的特異性正向引物。前述的應用前列腺癌生物標誌物miR-126_5P的診斷試劑盒，所述的特異性正向引物的序列為:SEQ ID N0.75』 -UUGAGCAACGCGAACAAAUCA-3 』。前述的應用前列腺癌生物標誌物miR-126_5P的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒中血清總RNA提取試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.2的外源對照-1，為5』 -CAACCTCCTAGAAA GA-3』。前述的應用前列腺癌生物標誌物miR-126_5P的診斷試劑盒,所述診斷試劑盒中RNA加polyA試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.3的外源對照-2，為5』_TGAGCAACGCGMCAA-3，。前述的應用前列腺癌生物標誌物miR-126_5P的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒中RT-PCR 試劑中包括序列為 SEQ ID N0.4 的 RT-引物，為 5』 -CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN_3』，其中 V 為 A、C 和 G 中的任一種，N 為 A、T、C 和 G 中的任一種。前述的應用前列腺癌生物標誌物miR-126_5P的診斷試劑盒,所述診斷試劑盒中定量PCR試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.5 (5，-CTCACAC GACTCACGACAC-3』)的通用反向引物UPM-短片段，和核苷酸序列為SEQ ID N0.6 (5，-CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3』 )的通用反向引物UPM-長片段。本發明為前列腺癌的診斷提供了一種新的分子標誌物miR-126_5P，並將該分子標誌物應用於製備診斷前列腺癌的診斷試劑盒中，使用該分子標誌物及含有該分子標誌物的診斷試劑盒診斷前列腺癌，操作簡單、取材方便、安全無創傷，且具有高特異性、高靈敏性和易於大量篩查的特點，該分子標誌物特別適合應用於前列腺癌高危人群的篩選、前列腺癌的鑑定、前列腺癌治療狀況的監測、前列腺癌指導用藥的監測和前列腺癌預後監測等領域用試劑中。
具體實施例方式為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例進一步闡述本發明，但下述實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規實驗方法進行。1.血清或血漿中總RNA的提取:
抽取3名前列腺患者手術前7天及手術後7天的血液各2毫升，同時抽取同期3名正常人血液各2毫升作為對照。將上述血液凝血後進行離心，最後取上層血清I毫升置於1.5毫升的無DNA和RNA汙染的離心管中。使用北京康為世紀生物科技有限公司生產的RNA提取試劑盒自上述血清中提取總RNA，每250微升血清中加入I微升外源對照-1 (北京曠博生物技術有限公司提供)來監控上述血清中RNA的提取質量。提取的總RNA通過使用Therm NanoDrop2000c分光光度計，測定260/280nm紫外波長的比值進行的濃度測定。所述外源對照_1的序列為5』 -CAACCTCCTAGAAAGA-3』 (SEQ ID NO:2)。2.定量檢測血清中的microRNA:I)加 poly (A)尾:在無RNA酶的PCR管(VWR公司生產，200微升)中配製加A尾的反應液，體系總量為20微升。每20微升體系反應液中加入I微升特異的外源對照_2(北京曠博生物技術有限公司提供)來監控miRNA的加尾及反轉錄質量,所述反應液體系如表I所示。將裝有配製好反應液的PCR管放入PCR儀(Thermo)中，在37°C下孵育I小時，得到孵育反應液I。所述外源對照-2的序列為 5』 -TGAGCAACGCGAACAA-3』 (SEQ ID NO:3)。表I加polyA試劑組成
權利要求
1.一種前列腺癌生物標誌物miR-126-5P，其特徵在於，所述的miR-126_5P為一種miRNA, miR-126-5P 的核苷酸序列為:SEQ ID N0.1 5』 - CATTATTACTTTTGGTAC -3』。
2.權利要求1所述的前列腺癌生物標誌物miR-126-5P在製備前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療狀況監測、預後監測的試劑盒中的應用。
3.根據權利要求2所述的前列腺癌生物標誌物miR-126-5P在製備前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療狀況監測、預後監測的試劑盒中的應用，其特徵在於:通過檢測被試者血清中miR-126-5P的含量，並與正常水平miR-126_5P含量相比較以進行前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療狀況監測、預後監測。
4.根據權利要求3所述的前列腺癌生物標誌物miR-126-5P在製備前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療狀況監測、預後監測的試劑盒中的應用，其特徵在於:所述被試者血清中miR-126-5P的含量通過總RNA提取、加polyA尾、RT-PCR、定量PCR進行檢測。
5.應用前列腺 癌生物標誌物miR-126-5P的診斷試劑盒，其特徵在於，包括:血清總RNA提取試劑、RNA加polyA試劑、RT-PCR試劑、定量PCR試劑，所述的定量PCR試劑包括miR-126-5P的特異性正向引物。
6.根據權利要求5所述的應用前列腺癌生物標誌物miR-126-5P的診斷試劑盒，其特徵在於，所述的特異性正向引物的序列為:SEQ ID N0.7 5』 -UUGAGCAACGCGAACAAAUCA-3，。
7.根據權利要求5或6所述的應用前列腺癌生物標誌物miR-126-5P的診斷試劑盒，其特徵在於:所述診斷試劑盒中血清總RNA提取試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.2的外源對照-1。
8.根據權利要求7所述的應用前列腺癌生物標誌物miR-126-5P的診斷試劑盒，其特徵在於:所述診斷試劑盒中RNA加polyA試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.3的外源對照-2。
9.根據權利要求7所述的應用前列腺癌生物標誌物miR-126-5P的診斷試劑盒，其特徵在於:所述診斷試劑盒中RT-PCR試劑中包括序列為SEQ ID N0.4的RT-引物，其中V為A、C和G中的任一種，N為A、T、C和G中的任一種。
10.根據權利要求7所述的應用前列腺癌生物標誌物miR-126-5P的診斷試劑盒，其特徵在於:所述診斷試劑盒中定量PCR試劑中包括核苷酸序列為SEQ ID N0.5的通用反向引物UPM-短片段，和核苷酸序列為SEQ ID N0.6的通用反向引物UPM-長片段。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種前列腺癌生物標誌物miR-126-5P、診斷試劑盒及應用，所述的miR-126-5P為一種miRNA，前列腺癌診斷試劑盒通過檢測被試者血清中miR-126-5P的含量，並與正常水平miR-126-5P含量相比較以診斷前列腺癌。本發明為前列腺癌的診斷提供了一種新的分子標誌物miR-126-5P，並將該分子標誌物應用於製備診斷前列腺癌的診斷試劑盒中，使用該分子標誌物及含有該分子標誌物的診斷試劑盒診斷前列腺癌，操作簡單、取材方便、安全無創傷，且具有高特異性、高靈敏性和易於大量篩查的特點，該分子標誌物特別適合應用於前列腺癌高危人群的篩選、前列腺癌的鑑定、前列腺癌治療狀況的監測、前列腺癌指導用藥的監測和前列腺癌預後監測等領域用試劑中。
文檔編號C12N15/11GK103205423SQ201310124988
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月11日 優先權日2013年4月11日
發明者範盤生, 夏東元, 浦金賢 申請人:百瑞德(南京)生物科技有限公司