一種克倫特羅半抗原化合物、合成方法及其用途的製作方法

2023-12-05 18:51:41

專利名稱：一種克倫特羅半抗原化合物、合成方法及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及選擇一種具有-COOH的、又最大可能包含克倫特羅原有結構的化合物作為克倫特羅半抗原以及該半抗原的合成方法和用途。
背景技術：
本發明屬於小分子化合物(分子量小於1000道爾頓)免疫化學和殘留分析技術領域，涉及有機合成，免疫化學及生物化學等，依靠免疫學、免疫化學基本原理和生物技術手段，設計、合成小分子目標分析物半抗原，並與載體蛋白質偶聯，製備有效人工抗原，免疫動物製備對小分子分析物特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學反應和易被檢測識別的標記物的放大作用，定量地檢測樣本中超微量小分子目標分析物，具有特異、靈敏、準確、快速、方便、廉價等特點，該技術研究的關鍵是半抗原的分子設計、合成和人工全抗原及抗體的製備，因此，目標分析物分子免疫學特性以及如何通過化學或生化技術突出和利用這些特性是該領域極為重要的研究內容，這一技術目前已成為獸藥殘留痕量分析研究的一個嶄新領域，被列為當前優先研究、開發和利用的獸藥殘留分析技術，世界糧農組織(FAO)已向許多國家推薦此項技術，美國化學將免疫分析與氣相色譜，液相色譜共同列為獸藥殘留分析的支柱技術。
影響免疫化學分析質量的根本因素是抗體的選擇性(或特異性)與親和性，這些性質又決定於免疫半抗原分子的結構，因此，免疫半抗原的分子設計與合成是建立小分子免疫化學分析的關鍵步驟。分子是構成物質的基礎結構，化合物內部分子結構特徵及分子間的組合方式等結構信息決定了化合物所表現的性質，也就是說，化合物的理化性質，生物活性及免疫原性等都是以分子為主體來表示和解釋的。
獸藥小分子必須與大分子物質連接後才能刺激動物產生特異性抗體，這已成為小分子免疫分析的基本模式。因此，半抗原的合成與鑑定試驗是產生特異性抗體和建立獸藥殘留快速檢測技術研究最基礎和最關鍵的步驟。理想的半抗原一方面應具備待測物的特徵結構，特別是立體化學特徵，另一方面半抗原與載體連接後應保證待測物的特徵結構能最大程度地為免疫活性細胞識別和結合，以製備出具有預期選擇性的抗體。①半抗原通常由待測物衍生化製備，或由原料合成，待測物的代謝或降解產物往往是有用的半抗原；②除待測物特徵結構外，在半抗原的未端需有可直接或間接與載體蛋白質偶聯的活性基團；③在活性基團與載體之間，必須有一定長度的間隔臂，以便使半抗原突出於載體表面，易為有機免疫系統識別；④間隔臂應遠離待測物的特徵結構部分和官能團；⑤半抗原的設計應考慮到獸藥原藥和有毒理學意義的代謝物，以及測定對象是單一的獸藥或某一類獸藥；⑥機體的免疫應答是個十分複雜的生化過程，半抗原誘導的抗體的選擇性和親合性尚難預測，多數情況下宜合成幾種結構的半抗原進行研究。
克倫特羅(clenbuterol，CL)是一種人工合成的β2-腎上腺素受體激動劑(β2-激動劑)，常作為支氣管擴張劑用於防治支氣管哮喘、哮喘性慢性支氣管炎及肺氣腫等呼吸系統疾病所致的支氣管痙攣。當其應用劑量達治療量5-10倍時，CL可增強肌肉發育，降低脂肪沉積，因此又稱為「瘦肉精」。由於其特殊的生物學功能，常被作為飼料添加劑非法用於肉用動物的生產之中。更為重要的是，由於CL在動物體內吸收快，分布廣，脂溶性高，具有殘留性積累和半衰期長等藥理特性。人在食用殘留CL肉品後引起的中毒事件不斷發生。因此，各國政府都禁止CL作為飼料添加劑用於肉用動物的生產之中，我國政府也規定嚴禁在飼料中添加CL。同時制訂了CL的最高殘留限量標準。因此加強對該類物質在肉食品中的殘留檢測和監督就十分必要。免疫分析技術，尤其是酶免疫分析技術具有操作簡便快捷，一次檢測樣品多、靈敏度高、費用價廉等優點，而成為最常用的檢測方法。
因此開發一種簡單、快速，適於鹽酸克倫特羅殘留現場監控的痕量分析法-免疫分析方法具有重要的現實意義。

發明內容
針對現有技術中存在的不足之處，本發明提供一種能最終用於簡單、快速檢測鹽酸克倫特羅殘留量的克倫特羅人工半抗原以及該半抗原的合成方法和用途。
本發明為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現的提供一種克倫特羅人工半抗原，其分子結構式為
此種半抗原化合物是最大程度保留克倫特羅的結構，又具有可以與氨基偶聯的基團-COOH。
本發明還提供了上述克倫特羅人工半抗原的合成方法。
本發明還提供了上述半抗原化合物的用途是用作動物免疫的抗原體系的原料。
本發明的克倫特羅人工半抗原的合成方法，是通過這樣的技術方案來實現的本發明的半抗原以游離的克倫特羅為原料，通過與丁二酸酐(即琥珀酸酐)反應得到克倫特羅半抗原化合物(CLH)，反應路線如下所示 本發明的克倫特羅半抗原化合物(CLH)的合成方法進一步描述如下1)、鹽酸克倫特羅原藥溶於水，加入氨水調節體系pH值在8～9，析出大量固體，抽濾，得到游離的克倫特羅原藥。
2)、將游離的克倫特羅原藥、琥珀酸酐和無水吡啶依次投入容器內，然後抽真空，充氮氣保護，在10～150℃下攪拌反應6～48h；游離的克倫特羅原藥與琥珀酸酐的克分子比為1∶1～5，無水吡啶與游離的克倫特羅原藥的克分子比在1∶100～300；反應結束後，停止加熱攪拌，靜置，有大量白色固體析出，反應液抽濾，用乙酸乙酯洗滌白色固體，將此白色固體烘乾，即得到克倫特羅人工半抗原。
本發明的克倫特羅半抗原的設計的位點在克倫特羅分子結構中-OH位置，把-OH通過化學合成改造成-OCOCH2CH2COOH，使其具有一定的可長可短的連接臂，同時又具有可以與蛋白質偶聯的-COOH。本發明中合成的克倫特羅半抗原化合物為國內外首創的新化合物，既最大程度地保留了克倫特羅的化學結構，又具有可調節長度的連接臂，用這一系列半抗原作為原料，用於製備適於動物免疫的抗原體系，免疫動物，所得的抗體的效價、特異性、親和力都比較好，所得的抗體用於ELISA方法檢測克倫特羅，最低檢測限可達1.0±1.5μg/L(0.001ppm)，檢測靈敏度高，與其他獸藥的交叉反應率低。
本發明的半抗原化合物，不僅合成方法簡便、純度較高，而且能應用於合成適於動物免疫的抗原體系。
具體實施例方式
實施例1、一種克倫特羅人工半抗原，分子結構式為 是用作動物免疫的抗原體系的原料。
上述克倫特羅人工半抗原合成方法如下鹽酸克倫特羅原藥溶於水，加入氨水調節體系pH值在8～9，析出大量固體，抽濾，得到游離的克倫特羅原藥。
將游離的克倫特羅原藥6.70g(0.023mol)、琥珀酸酐4.60g(0.046mol)和無水吡啶300ml依次投入500ml的圓底燒瓶中，然後抽真空，充氮氣保護，緩慢加熱在60℃下攪拌反應24h。
反應結束後，停止加熱攪拌，靜置12h。有大量白色固體析出，反應液抽濾，用丙酮和乙酸乙酯洗滌固體，將固體轉移到烘箱烘乾，最後得到白色固體(即目標產物——克倫特羅人工半抗原)6.65g，收率為76.7％。
所得的克倫特羅人工半抗原化合物的結構鑑定4-(1-(4-氨基-3，5-二氯苯基)-2-(叔丁基氨基)乙氧基)-4-羰基丁酸(C16H22Cl2N2O4)白色固體重結晶後用質譜、核磁共振氫譜鑑定結構MS(ESIsource，negative)375(M-)；1H-NMR(δppm)1.02(9H，s，-CH3)，2.48(2H，m，-CH2)，2.55(2H，m，-CH2)，2.75～2.94(2H，dd，-CH2)，5.37(2H，s，2-NH2)，5.52(1H，m，-CH)，7.22(2H，s，-ArH)。
元素分析(％，計算值)C50.90(50.94)；H5.86(5.88)；N7.48(7.43)實施例2、免疫原的製備免疫原的合成利用碳二亞胺法。將半抗原化合物(CLH)(50～80微摩爾)，溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲醯胺中，然後在該溶液中加入等當量的二環已基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺，讓其在室溫下反應過夜後，離心，取上清液500～800μL加入到4～8mL15～20mg/mL的牛血清蛋白碳酸鹽緩衝溶液中，加入時應緩慢，然後在伴有磁力攪拌情況下反應4～6小時，待反應完成後，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然後用0.8～0.9％生理鹽水透析，分裝保存於-20℃的冰箱中。
人工抗原的鑑定按合成克倫特羅免疫抗原反應所用半抗原、載體蛋白與偶聯產物的比例，進行紫外(200nm～400nm)掃描測定，通過比較三者分別在260nm和280nm的吸光值計算其結合比。
經計算結果如下半抗原CLH與BSA的結合比為16.3∶1；半抗原CLH與OVA的結合比為13.3∶1。
實施例3動物免疫製備單克隆抗體與多克隆抗體1)多抗製備實驗選用半周歲左右，體重為2～3公斤，健康的雄性家兔。每種免疫原免疫三隻兔子(由浙江省中醫學院負責兔子的飼養工作)，分別編號為兔子1～3。
實驗免疫劑量基礎免疫為0.5～1.0mg/kg，加強免疫劑量為1.0～1.5mg/kg，用生理鹽水稀釋適量CLH-BSA，加入等體積弗氏完全佐劑(加強免疫時採用弗氏不完全佐劑)，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。採用背部皮下多點注射與大腿肌肉注射相結合的方法。背部皮下免疫6點，大腿肌肉注射2點，3周後進行加強免疫，以後每隔2周再次加強免疫。從第三次免疫開始，每次免疫後第8天，從兔子心臟或耳緣靜脈採血，測定效價和特異性。
待免疫血清效價上去後，就可進行採血。本實驗採用心臟取血法。採血後，將採血瓶放置於37℃溫箱中半小時，待瓶中的血液凝固，然後用接種針沿瓶內壁將血塊與玻璃脫離，再放到4℃冰箱中3～4小時，待血塊收縮後，用毛細吸管將血清吸入試管中，離心，分離出血清。
2)單抗製備實驗選用6-10周齡的BaLb/c小鼠，20-22g，免疫5-10隻小鼠。取6-8周齡體重18-20g BALB/C雌性小鼠，將製備的QW-PS-BSA交聯物與等體積弗氏完全佐劑混合，充分乳化後，經背腹部皮下多點注射，劑量為50μg/每隻，以後每隔3周，取抗原(與一免等劑量)和等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化後腹腔和皮下注射加強免疫，加強免疫共4次，末免以加倍劑量的抗原進行腹腔注射，3天後取脾細胞進行融合。後經3-4次有限稀釋法克隆篩選得到一株細胞株2E3，經多次體外傳代和多次凍存復甦後，細胞株均能良好生長，並穩定分泌抗體。經擴大培養後，用於抗體製備和液氮保存。
抗體的純化辛酸-硫酸銨鹽析法是一個經典的方法。辛酸在偏酸性的條件下能將血清中除IgG以外的蛋白質都沉澱下來中，上清液中只有IgG。辛酸加入因抗體的來源不同而不同，人血清為70ul/ml，兔血清為75ul/ml，小鼠血清為40ul/ml，小鼠腹水為33ul/ml。這種方法IgG的回收率達90％以上。最後將抗體製成凍乾粉，分裝，-20℃保存。
抗血清效價測定免疫原複合物按常規方法免疫了三隻兔子。從加強免疫第二次開始，在每次免疫後第8天於兔子耳緣靜脈採血，血清經適當稀釋後用間接ELISA測定效價。第4次免疫後，兔子獲得了高效價的抗體，抗血清的效價為256000∶1～512000∶1(指OD490nm值等於1.0)。小鼠腹水效價在10-6左右。
抗體的交叉反應性以抗體對克倫特羅抑抑制質量濃度(IC50)與對競爭物的IC50之比的百分數為其交叉反應率(CR％)，所測競爭物為沙丁胺醇、腎上腺素、去甲腎上腺素和來克多巴胺。結果表明抗體與沙丁胺醇的交叉反應率為19.50％，來克多巴胺為1.74％，腎上腺素和去甲腎上腺素小於0.01％，克倫特羅為100％。
由此可知，除克倫特羅以外，所製備的抗體的特異性均較強。
最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種克倫特羅人工半抗原，其特徵在於它的分子結構式為
2.一種如權利要求1所述的克倫特羅人工半抗原的合成方法，其特徵在於包括下列步驟1)、鹽酸克倫特羅原藥溶於水，加入氨水調節體系pH值在8～9；析出大量固體，抽濾，得到游離的克倫特羅原藥；2)、將上述游離的克倫特羅原藥、琥珀酸酐和無水吡啶依次投入容器內，然後抽真空，充氮氣保護，在10～150℃下攪拌反應6～48h；所述游離的克倫特羅原藥與琥珀酸酐的克分子比為1∶1～5，所述無水吡啶與游離的克倫特羅原藥的克分子比在1∶100～300；反應結束後，停止加熱攪拌，靜置，有大量白色固體析出，反應液抽濾，用乙酸乙酯洗滌白色固體，將此白色固體烘乾，即得到克倫特羅人工半抗原。
3.一種如權利要求1所述的克倫特羅半抗原的用途，其特徵在於是用作動物免疫的抗原體系的原料。
全文摘要
本發明公開了一種克倫特羅人工半抗原，其分子結構式為右式，本發明還公開了上述克倫特羅人工半抗原的合成方法。該種克倫特羅半抗原的用途是用作動物免疫的抗原體系的原料，其最終產物能用於簡單、快速檢測鹽酸克倫特羅的殘留量。
文檔編號C07C209/00GK1793108SQ20061004893
公開日2006年6月28日 申請日期2006年1月6日 優先權日2006年1月6日
發明者李衛芬, 程敬麗, 朱國念, 黃雅麗, 韓森 申請人:浙江大學