一種用於皮膚護理的被修飾酶的製作方法

2023-12-05 19:02:16

專利名稱：一種用於皮膚護理的被修飾酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及被修飾酶、包含所說的被修飾酶和已知用於皮膚護理組合物中的諸成分的皮膚護理組合物、包含本發明的皮膚護理組合物的皮膚護理產品以及所說的被修飾酶用於提高酶的穩定性和/或降低酶的致敏能力的用途。
背景技術：
自古人就喜歡洗澡和淋浴。這到目前還沒有變化。對於今天的大多數人，洗澡和淋浴是用於保持良好身體衛生並獲得令人愉快的氣味的日常生活一部分。某些人也把在早晨進行一次清爽的淋浴或洗澡作為重要而必需的精神體驗，沒有這項內容，這些人就無法清醒。
在消費市場上可以發現許多用於身體護理和保持良好身體衛生的產品，例如用於清潔和溼潤身體所有部分的產品。一些這樣的產品包含作為有效成分的被修飾酶。
用於皮膚護理的酶長期以來，已經知道，以蔬菜和水果(如黃瓜、番茄、胡蘿蔔、香蕉等)形式的酶處理皮膚具有有益的潛在作用。
然而，在20世紀70年代之前，尚未將酶引入商業皮膚護理產品，部分是因為關於酶的知識有限，而且還因為人們認為酶的穩定性不能令人滿意，並在皮膚護理產品中具有一些不利的性質。例如，人們發現纖維素酶可以改變包含羧甲基纖維素的洗劑和乳膏的粘度；脂酶會導致包含脂肪酸酯的乳膏發生變化；發現蛋白酶會使蛋白質成分破壞並造成粘度降低。
此外，在那時，酶的高成本也阻礙了酶在這種個人護理產品中的應用。
人的皮膚人的皮膚是由幾層組成的。最上層(表皮)含有纖維狀蛋白質角蛋白，其功能是充當隔離環境的保護層。表皮的外層是由位於其下方的粒層中的細胞有組織地死亡而形成的。粒層中釋放出許多酶，它們將死細胞物質轉化成角蛋白。
真皮通過基膜與表皮連接，並通過循環系統將皮膚與身體其餘部分連接起來。真皮具有血管、神經纖維和淋巴管，並包含主要是由膠原纖維以及有限量的彈性蛋白和網硬蛋白纖維組成的纖維狀網絡。
用於個人護理產品的被修飾酶如上所述，某些酶的穩定性不能令人滿意，而且在某種條件下(取決於接觸的方式)可能會引起免疫應答，通常是IgG和/或IgE應答。
今天一般都認識到，當多肽(如酶)與聚合分子偶聯時，多肽的穩定性會得到提高，免疫應答會減少。
用於連接多肽和聚合分子的技術在本領域是熟知的。
最適合的商業技術之一早在20世紀70年代早期就已描述(美國專利no.4,179,337)。所說的專利涉及非免疫原性多肽，如與聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇偶聯的酶和肽激素。其中至少15％的多肽生理活性得到保持。
英國專利no.1,183,257(Crook等)描述了通過三嗪環將酶與多糖連接的化學。
另外，用於維持酶-聚合物結合物之酶促活性的技術在本領域也是已知的。
WO 93/15189(Veronese等)涉及一種通過將蛋白水解酶連接到大分子化的抑制劑上來保持經聚乙二醇修飾的蛋白水解酶活性的方法。該結合物旨在於醫療應用。
已經發現將多肽連接到聚合分子上通常會降低多肽活性或幹擾多肽與其底物相互作用。EP 183 503(Beecham Group PLC)公開了上述概念的一種發展，即提供了結合物，所述結合物含有藉助於可逆的連接基團而連接到至少一種水溶性聚合物上的藥學上有用的蛋白質。
EP471,125(Kanebo)公開了包含通過三嗪環偶聯到多糖上以提高耐熱性和保存穩定性的親本蛋白酶(芽孢桿菌蛋白酶Esperase)的皮膚護理產品。所利用的偶聯技術在上述的英國專利no.1,183,257(Crook等)中有描述。
JP 3083908描述了一種皮膚化妝品材料，該材料中含有來自豚鼠肝臟的、用一種或多種水溶性物質(如PEG、澱粉、纖維素等)修飾過的轉穀氨醯胺酶。這種修飾是通過激活聚合分子並將其偶聯到所說的酶上而進行的。據稱該組合物對皮膚比較溫和。
基於現有技術的一般知識概述用於將一種或多種聚合分子偶聯到多肽分子上的技術在本領域中是已知的。而且，已經知道這種修飾過的酶-聚合物結合物的免疫應答降低，穩定性提高。
發明概述本發明的目的是提供適合於在皮膚護理產品中使用的改進的被修飾酶結合物。
本發明的發明者發現當使用具有適合於皮膚護理的活性的被修飾酶時，對酶和聚合物分子必須有一定的要求，以獲得提高的穩定性和降低的致敏能力，而同時仍保持了顯著的殘留酶促活性。
本發明的發明者發現與酶表面偶聯的聚合分子的數目與重量必須與酶的重量和/或表面積平衡。而且，偶聯聚合分子的位置也很重要。
本發明的第一個方面涉及一種被修飾酶，其中分子量為1-35kDa的4-70個聚合分子被共價偶聯到分子量為15-100kDa的親本酶的表面。
在親本酶分子量為15-35kDa的情況下，4-20個共價偶聯的聚合分子應該共價偶聯到所說的親本酶的表面上。
如果親本酶的分子量在35-60kDa的範圍內，則將7-40(優選地10-30)個聚合分子偶聯到所說的親本酶的表面上。
同樣地，如果親本酶具有60-80kDa的分子量，則將10-50(優選地13-40)個聚合分子偶聯到所說的親本酶的表面上。
將15-70(優選地18-60)個聚合分子偶聯到具有80-100kDa分子量的親本酶的表面上。
通常，聚合分子被偶聯到酶表面上的氨基(-NH2)和N末端氨基上，然而，聚合分子也可以偶聯到酶鏈中處於表面的胺基酸的羧基(-COOH)上。
優選的連接基團是賴氨酸殘基和位於N末端的氨基。
羧酸連接基團可以是天冬氨酸或穀氨酸的羧酸基和C末端的COOH基團。
在本申請中，「連接基團」的數目是多肽鏈中賴氨酸殘基的氨基數加上N末端氨基的數目。
本發明的親本酶可以是水解酶，包括蛋白酶(尤其是枯草桿菌蛋白酶)、或脂酶，或氧化還原酶(包括漆酶和超氧化物歧化酶)。
本發明的第二個方面涉及包含本發明的被修飾酶以及用於皮膚護理產品的成分的皮膚護理組合物。
本發明的第三個方面涉及包含本發明皮膚護理組合物的皮膚護理產品。
與相應的皮膚護理產品(包含親本酶)比較，本發明皮膚護理產品的穩定性有所提高，致敏能力有所降低。
術語「致敏能力降低」在本發明的上下文中是指「變應原性降低」，這指在吸入本發明的被修飾酶時，產生的、可導致變應性狀態的IgE(在人類中，在特定的動物中是具有類似效果的分子)的量比相應的親本酶降低。
在本發明的上下文中，「皮膚護理產品」包括所有的用於身體皮膚清潔、護理和/或美化的個人護理產品以及其它產品，如頭髮護理產品，這些產品在使用期間可能會與皮膚或呼吸系統接觸。本發明也包括用於動物的相應產品。
按照本發明所涉及的皮膚護理產品的特定例子是肥皂、化妝品、護膚膏、護膚凝膠、護膚奶、潔膚洗液、清潔霜、清潔露、潔膚奶、冷霜、冷制皂、化妝基料(make-up base)、清潔乳、面膜、含鋅化妝水、T區精華素(T zone essence)、潤手香脂、香粉(essencepowder)、增白粉、皂粉、塊皂、透明皂、唇膏、口紅、營養素、粉底霜、搽臉粉、眼影粉、粉底、指甲油清潔劑、生髮油、美發液、髮乳、發用凝膠、滋發劑、頭髮定形製品、染髮劑、頭髮著色劑、頭皮滋潤劑(scalp treatment)、香波、香膏、護髮素、髮膠、曬黑油(sun oil)、防曬品、剃鬚泡沫與凝膠、剃鬚膏、嬰兒油、粉刺護理製品、止汗劑、驅蟲劑、祛臭劑等。
變應原性評價可以通過吸入檢驗，並比較氣管內施用親本酶的效果與施用本發明相應的被修飾酶的效果來評價變應原性。
現有幾種用於酶變應原性評價的體內動物模型。某些這樣的模型為人類中的危險評價提供了合適的依據。適合的模型包括豚鼠模型和小鼠模型。這些模型設法將呼吸性變應原表示為以前致敏的動物中所誘導的刺激反應的函數。按照這些模擬，將所宣稱的變應原通過氣管內引入動物。
豚鼠的一個適合品系(Dunkin Hartley品系)不會因變應性應答而產生IgE抗體，這一點與人類不同。然而，它們產生另一種類型的抗體IgG1A與IgG1B(參見，例如，Prentφ，ATLA，19，P.8-14，1991)，這些抗體造成了對所吸入的多肽(包括酶)產生變應原性應答。因此，當使用Dunkin Hartley動物模型時，IgG1A和IgG1B的相對量可以表示變應原性水平。
適合於氣管內接觸多肽和酶的大鼠品系是Brown Norway品系。Brown Norway大鼠產生IgE作為變應性應答。
BALB/C小鼠品系適合於確定由皮下注射引起的IgE應答。
在豚鼠和小鼠中評價呼吸性變應原的更多細節由Kimber等(1996)，基礎與應用毒理學，33，P.1-10描述。
其它動物(如大鼠，兔子等)也可以用於類似研究中。
附圖的簡要描述

圖1顯示了在用修飾的PD498-SPEG、未修飾的PD498與甘氨酸-SPEG15,000免疫之後，BALB/C小鼠中特異性的抗PD498 IgE應答的動力學。
圖2顯示了氣管內施用修飾的PD498-SPEG和未修飾的PD498的Dunkin Hartley豚鼠的IgG1水平。
圖3顯示了Dunkin Hartley豚鼠IT劑量應答研究中3μg、30μg和300μg修飾的PD498-SPEG 5000引起的IgG1水平(■3.0μg；▲30μg；300μg)。由於0.3μg的劑量不產生應答，故省略了0.3μg劑量曲線。
圖4顯示了Dunkin Hartley豚鼠IT劑量應答研究中0.3μg、3.0μg和30μg未修飾的親本PD498引起的IgG1水平(■0.3μg；▲3.0μg；30μg)。
發明詳述本發明的目的是提供適合於皮膚護理的被修飾酶。
如上所述，已經知道，將聚合分子與酶偶聯，可以提高多肽(包括酶)的穩定性並降低其致敏能力。當將聚合分子與酶偶聯時，出現的一個問題是酶促活性的喪失。
按照上述的EP 471,125(Kanebo)，將芽孢桿菌蛋白酶Esperase(可由Novo Nordisk A/S提供)通過三嗪環與40kDa葡聚糖(實施例1)及50kDa支鏈澱粉(實施例2)結合。
所說的芽孢桿菌蛋白酶(即Esperase)具有3個可及氨基(-NH2)連接基團，聚合分子(在這種情況下是多糖)可以偶聯在其上。這幾個連接基團是兩個氨基(即在3D結構表面上的兩個賴氨酸殘基)和一個N末端氨基。當將不超過3個聚合分子偶聯到所說的蛋白酶上時(修飾率為68％-71％，通過TNBS方法(Haynes等，(1967)，生物化學，6，P.641)測定)，據稱所保持的剩餘酶促活性在45％(參見實施例4)-67％(參見實施例3)之間。
本發明的發明者發現當使用具有適合於皮膚護理之活性的被修飾酶時，對酶和聚合物分子必須有一定的要求，以獲得提高的穩定性和降低的致敏能力，而同時仍保持了顯著的剩餘酶促活性。本發明的發明者發現與酶表面偶聯的聚合分子的數目與重量必須與酶的重量和/或表面積平衡。而且，偶聯聚合分子的位置(表面上)也很重要。
聚合分子數目與酶重量本發明基於下列一般原則酶的表面積和/或重量越大，就必須有越多的聚合分子偶聯在酶的表面上，以獲得提高的穩定性、顯著的剩餘酶促活性和/或降低的致敏能力。
如果僅僅極少聚合分子偶聯到具有大表面積的大酶上，那麼所說的極少聚合分子不能遮蔽(即隱藏/覆蓋)酶表面上的表位，而這種表位會造成導致抗體(尤其是IgE抗體)形成的免疫應答。
上述EP 471,125(Kanebo)描述了極少(即最多達3)大(即40和50kDa)聚合分子偶聯到具有大約28kDa分子量的微生物蛋白酶Esperase表面的情況。
本發明的第一個方面涉及一種適合於皮膚護理的被修飾酶，該酶具有分子量為1-35kDa的4-70個聚合分子共價偶聯到分子量為15-100kDa的親本酶的表面。
按照本發明，將具有15-35kDa分子量(這對許多微生物酶比較典型)的酶(如源於芽孢桿菌的細菌蛋白酶)與4-20個聚合分子共價偶聯。
換句話說，被修飾酶可以具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、1 3、14、15、16、17、18、19或20個共價偶聯於親本酶3D結構表面(包括N末端氨基)的聚合分子。
按照本發明，酶的重量和/或表面積、偶聯的聚合分子的數目以及聚合物的重量之間的優選比例如表1所示。
表1
按照本發明，聚合分子的分子量可以是1-35kDa。然而，如果聚合分子更小和/或更少，則酶表面的表位可能不能被充分遮蔽，從而導致免疫應答。按照本發明，聚合分子優選的分子量是4-25kDa，尤其是6-25kDa，如8-20kDa。
論及的所有聚合物分子量均是平均分子量。
偶聯的聚合分子的位置實際上，所有離子化基團(如賴氨酸殘基的氨基)均位於多肽分子的表面(參見例如Thomas E.Creighton，(1993)，「蛋白質」，W.H.Freeman和Company，紐約)。因此，在酶的表面上容易達到的連接基團(即氨基)數目通常等於酶一級結構中的賴氨酸殘基加N-末端氨基的數目。
當選擇欲進行結合以用於皮膚護理組合物與產品的親本酶時，優選地使用具有表1中所示連接基團數目的酶。
致敏能力與保持的殘餘酶促活性相比於其它蛋白質與多肽來說，尤其是對於酶，由於酶的活性和底物與酶結構裂縫中的活性位點之間的相互作用有關，因此在減少免疫系統對酶的應答和保持顯著的殘餘酶促活性之間有些衝突。
按照本發明，「顯著」保持的殘餘活性指保持了酶活性的20％、30％或40％以上，更好是50％、60％或70％以上，還要更好是70％或80％，高達80％-90％，甚至是高達100％。
不受任何理論的限制，被修飾酶的酶促活性損失可能是由於大/重聚合分子空間阻礙底物到達酶的催化裂縫而阻礙底物達到活性位點所造成的結果。也有可能(至少部分上)是因為酶的3D結構發生了不利的結構變化。當將極少的大/重聚合分子偶聯到酶表面時，有可能會在酶分子的不同部分引起不均勻的相互作用。這可能會導致酶結構局部偏離其正常構型，這在大多數情況下會導致酶促活性損失。
在EP 471,125(Kanebo)中描述的修飾蛋白酶具有極少(即最多達3個聚合分子)重/大聚合分子(即40和50kDa多糖)偶聯到酶表面的氨基上。觀察到的酶促活性損失(即45％-67％殘餘酶促活性)可能是因為在酶表面不同部分上的不均勻相互作用，引起酶結構偏離其正常的親本狀態構型。而且，酶表面上所偶聯的大/重聚合分子還可能會阻止底物到達酶的活性位點，導致所保持的酶促活性降低。
人們確信，當將更多的更小/輕聚合分子偶聯到酶的表面上時，聚合分子的不利影響就較不明顯，因為對酶結構具有影響的力在酶表面上的更大區域中更平衡/均一地分布。這樣，聚合分子對活性損失的影響就較不明顯。
因而，優選是將具有相對低分子量(即1-35kDa)的更多聚合分子(即大於4)偶聯到酶的表面上(在酶具有15-35kDa的分子量的情況下)。
在本發明優選的實施方案中，聚合分子廣泛分布於除鄰近活性位點的區域之外的酶表面上。在本發明的上下文中，「廣泛分布於」是指其所處的位置能使得偶聯到酶連接基團的聚合分子遮蔽酶表面的不同部分(優選地是除活性位點外的整個表面或接近於整個表面)，以確保所說的可識別的有關表位受到遮蔽，由此不被免疫系統的抗體識別。人們相信酶和抗體之間相互作用的表面積大約為5002(26×19)(參見Sheriff等，(1987)，美國國家科學院學報，84卷，p.8075)。
優選地，酶上的兩個或多個連接基團應不相互靠近，因為連接基團相互鄰近很可能會導致僅能偶聯一個聚合分子。
為了確保酶促活性的損失最小，優選地不將聚合分子偶聯到活性位點的近距離範圍內。這一距離取決於聚合分子的大小。因為不希望被大聚合分子阻礙到達活性位點，這樣，聚合分子越龐大，所偶聯的聚合分子離活性位點的距離就應越遠。
通常看來以距離酶的活性位點5、優選地10的範圍內沒有聚合分子偶聯到所說的酶上為佳。
而且，按照本發明，在可由免疫系統識別的已知表位或接近於可由免疫系統識別的已知表位或接近於所說的表位偶聯了聚合分子的酶也被視為很有好處。如果表位的位置是未知的，則將許多聚合分子偶聯到酶表面可及的連接基團上是頗為有利的。優選的是所說的連接基團以離活性位點適合的距離廣泛分布於酶的表面。按照本發明，優選的是符合上述有關偶聯聚合分子在酶表面分布要求的被修飾酶。尤其優選沒有或只有極少數聚合分子(即0-2)偶聯到距離酶的活性位點0-5範圍內、優選地0-10範圍內的酶。
聚合分子偶聯到酶上的聚合分子可以是任何適合的聚合分子，包括天然和合成的同聚物[如多元醇(即poly-OH)、多胺(即poly-NH2)以及多羧酸(即poly-COOH)]以及雜聚物，即包含一種或多種不同偶聯基團(如羥基與胺基)的聚合物。
適合的聚合分子的例子包括選自含有下述各類分子的組中的聚合分子聚亞烷基氧化物(PAO)，如聚亞烷基二醇(FAG)，包括聚乙二醇(PEG)，甲氧基聚乙二醇(mPEG)以及聚丙二醇、PEG-縮水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸鹽、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚D，L-胺基酸、乙烯-馬來酸酐共聚物、苯乙烯-馬來酸酐共聚物，葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖、肝素、同源的白蛋白、纖維素，包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羧乙基纖維素以及羥丙基纖維素，聚氨基葡糖的水解產物、澱粉(如羥乙基澱粉和羥丙基澱粉)、糖原、瓊脂糖及其衍生物、瓜爾膠、支鏈澱粉、菊粉、合成生物聚合膠、角叉菜膠(carrageenan)、果膠、藻酸水解產物和生物聚合物。
優選的聚合分子是無毒性的聚合分子，如(m)聚乙二醇((m)PEG)，還要求這些分子共價偶聯到酶表面連接基團上的化學方法相對比較簡單。
一般看來，聚亞烷基氧化物(PAO)(如聚乙烯氧化物，如PEG，特別是mPEG)是優選的聚合分子，因為這些聚合分子與多糖(如葡聚糖、支鏈澱粉等)相比，它們所具有的能交聯的活性基團很少。
按照本發明，儘管可以使用所有上述的聚合分子，但優選地使用甲氧基聚乙二醇(mPEG)。這是因為這樣的事實甲氧基乙二醇僅具有一個可與酶連接的活性末端。因而，交聯的可能性相對較不明顯。而且，這將使產物更均一，聚合分子與酶的反應更容易控制。
聚合物的活化如果將與酶偶聯的聚合分子沒有活性，就必須使用適合方法使其活化。聚合分子可通過接頭與酶偶聯。適合的接頭對熟練技術人員是熟知的。
用於活化聚合分子以及用於連接蛋白質的方法和化學在文獻中有詳細描述。一般用於活化不溶性聚合物的方法包括用下列化合物活化官能團溴化氰、高碘酸、戊二醛、biepoxides、環氧氯丙烷、二乙烯基碸、碳二亞胺、磺醯基滷化物、三氯三嗪等(參見R.F.Taylor，(1991)，「蛋白質固定，基礎和應用」，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，「蛋白質結合和交聯的化學」，CRC出版社，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，「固定的親和性配體技術」，學院出版社，N.Y.)。其中一些方法涉及不溶性聚合物的活化，但是也適用於可溶性聚合物(如高碘酸，三氯三嗪、磺醯基滷化物、二乙烯基碸、碳二亞胺等)的活化。在選擇活化與結合化學方法中必須考慮聚合物上的官能團氨基、羥基、巰基、羧基、醛或硫氫基以及蛋白質上選定的連接基團，活化與結合化學通常包括i)聚合物的活化，ii)結合，iii)剩餘活性基團的封閉。
下面簡要描述許多適合的聚合物活化方法。然而，應該理解也可以使用其它方法。
將聚合分子偶聯到酶的游離酸基團上可以藉助於二醯亞胺和，例如氨基-PEG或肼基-PEG(Pollak等，(1976)，J.Amr.Chem.Soc.，98，289-291)或重氮基乙酸酯/醯胺(Wong等，(1992)，「蛋白質結合和交聯化學」，CRC出版社)進行。
將聚合分子偶聯到羥基通常是非常困難的，因為這必須在水中進行。而通常水解反應比與羥基的反應更佔優勢。
將聚合分子偶聯到游離硫氫基可以用特定基團(如馬來醯亞胺或正吡啶基二硫化物)達到。乙烯基碸(美國專利no.5,414,135，(1995)，Snow等)對於硫氫基也有偏好，但是不象提到的其它化合物那樣有選擇性。
可以通過包含兩個鄰近羰基的基團靶向多肽鏈中的可及精氨酸殘基。
涉及將親電子性地活化的PEG偶聯到賴氨酸的氨基上的技術也有用。醇的許多常規離去基團形成胺鍵。例如，可以使用烷基磺酸鹽，如tresylates(Nilsson等，(1984)，酶學方法，104卷，JacobyW.B.編，學院出版社Orlando，P.56-66；Nilsson等，(1987)，酶學方法，135卷，Mosbach K.編，學院出版社Orlando，P.65-79；Scouten等，(1987)，酶學方法，135卷，Mosbach K.編，學院出版社Orlando，P.79-84；Crossland等，(1971)，J.Amr.Chem.Soc.1971，93，pp.4217-4219)、甲磺酸鹽(Harris，1985，同上；Harris等，(1984)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22，pp 341-352)、芳基磺酸鹽(如甲苯磺酸鹽)以及對硝基苯磺酸鹽。
有機磺醯氯(例如Tresyl氯化物)可有效地將許多聚合物(例如PEG)中的羥基轉化成良好的離去基團(磺酸鹽)，當與多肽中的親核基團(如氨基)進行反應時，該離去基團使得可以在聚合物和多肽之間形成穩定的鍵。除了要有高的結合產率之外，反應條件通常還要求比較溫和(中性或微鹼性pH值，以避免變性和活性極少或沒有破壞)，並且滿足多肽需要的非破壞性條件。
甲苯磺酸鹽比甲磺酸鹽反應性更強，而且更不穩定地分解成PEG、二噁烷和磺酸(Zalipsky，(1995)，生物結合物化學，6，150-165)。環氧化合物也可以用於產生胺鍵，但是活性比上述基團弱得多。
用碳醯氯將PEG轉化成氯甲酸酯將產生與賴氨酸的氨基甲酸酯鍵。這一轉變可以多種變化形式進行，如用N-羥基琥珀醯亞胺(美國專利no.5,122,614，(1992)；Zalipsky等，(1992)，生物技術應用和生物化學，15，P.100-114；Monfardini等，(1995)，生物結合物化學，6,62-69)、用咪唑(Allen等，(1991)，Carbohydr.Res.，213，pp 309-319)、用對硝基苯酚、DMAP(EP 632 082 A1，(1993)，Looze，Y.)等替代氯。通常通過使氯甲酸酯與所需的離去基團反應來製備衍生物。所有這些基團均產生與肽的氨基甲酸酯鍵。
此外，可以分別使用異氰酸鹽和異硫氰酸鹽來產生尿素和硫脲。
使用如上所述的相同的離去基團和環狀亞胺thrones，可以從PEG酸(美國專利no.5,349,001，(1994)，Greenwald等)獲得醯胺。這些化合物的反應活性十分高，但是可能會使水解變快。
也可以使用從與琥珀酸酐反應製備的PEG琥珀酸酯。由此所形成的酯基使結合物對水解更加敏感得多(美國專利no.5,122,614，(1992)，Zalipsky)。這一基團可以用N-羥基琥珀醯亞胺活化。
此外，可以引入一個特殊的接頭。最古老的是氰尿醯氯(Abuchowski等，(1977)，生物化學雜誌，252,3578-3581；美國專利no.4,179,337，(1979)，Dayis等；Shafer等，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24,375-378)。
將PEG偶聯到芳香族胺上，隨後重氮化，將產生非常活躍的重氮鹽，其在原位可與肽反應。通過使PEG的吖內酯衍生物(美國專利no.5,321,095，(1994)，Greenwald，R.B.)反應，因此引入又一個醯胺鍵，也可以形成醯胺鍵。
由於一些肽不包含許多賴氨酸，因此，將多於一個PEG連接到相同的賴氨酸上有可能是有利的。這可以通過例如使用1，3-二氨基-2-丙醇進行。
也可以將PEG通過氨基甲酸酯鍵連接到酶的氨基上(WO95/11924，Greenwald等)。賴氨酸殘基也可以用作主鏈。
親本酶上述的本發明結合物可以使用本領域中已知的任何適合技術基於所選擇的親本酶製備。
術語「親本」酶是指任何未偶聯的酶(即要修飾的酶)。該酶優選地可以是微生物來源的，如細菌、絲狀真菌或酵母來源的。
親本酶可以是天然存在的(或野生型)酶或其變體。
評價/選擇適合的親本酶酶的三維結構在評價/選擇要修飾的適合親本酶方面有些用處。三維結構可以是X-射線結構、核磁共振結構或建立的模型結構。Brookhaven資料庫可以作為X-射線和核磁共振結構的來源。
如果與所說的酶有至少30％序列等同的一種或多種同源酶的一個或多個3D結構已知，則可由本領域熟練人員建立模型結構。有幾個軟體包，如Biosym的「Homo1ogy95.0」軟體包，可以用來構建模型結構。
構建模型結構所需要的典型工作是對存在3D結構的同源序列進行序列對比、確定結構保守區域(SCR)、確定SCR的等同序列、在結構資料庫中搜索結構片段/環以取代變異區、確定這些區域的等同序列、通過能量最低化使結構精確化。已知相對於已知的3D結構含有大插入物(≥3個殘基)的區域相當難以模擬，必須小心地預測其結構。
獲得所說酶的3D-結構或基於與已知結構的同源性建立的結構模型後，這種結構即是確定合適親本酶(當修飾時，這些酶變應原性降低，充分保持殘餘酶促活性)的必要先決條件。
用於皮膚護理產品的優選的酶是在皮膚護理產品中使用的pH值範圍內有顯著酶促活性的那些酶。
酶活性親本酶可以具有已知用於皮膚護理的任何活性。所涉及的酶包括氧化還原酶(E.C.1，「酶命名法，(1992)，學院出版公司)，如漆酶和超氧化物歧化酶(SOD)；水解酶E.C.3，包括蛋白酶，特別是枯草桿菌蛋白酶，以及脂解酶；轉移酶，(E.C.2)，如轉穀氨醯胺酶(TG酶)；異構酶(E.C.5)，如蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)。
水解酶蛋白水解酶所涉及的蛋白水解酶包括選自下列組的、具有上述性質(即連接基團的數目，連接基團的位置等)的酶酸性天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶，或金屬蛋白酶。
具有適合數目偶聯基團的合適親本蛋白酶的特定例子示於表2中表2
枯草桿菌蛋白酶PD498具有29kDa的分子量，並示於SEQ IDNO.2中。PD498在其表面上具有12個賴氨酸基團可用於連接，還有一個N末端氨基。如上所述，優選的酶中，賴氨酸廣泛分布於酶表面。PD498中沒有任何一個賴氨酸殘基位於距離活性位點0～10的範圍內，這使得PD498特別適合於處理成修飾形式。此外，諸賴氨酸殘基在該酶的表面上廣泛分布(即遠離活性位點)。
枯草桿菌蛋白酶DY具有27kDa的分子量，在其表面上有12個氨基(即賴氨酸殘基)，還有一個N末端氨基(參見SEQ ID NO.3)。
親本蛋白酶Lion Y具有46kDa的分子量，在其表面上有14個氨基(即賴氨酸殘基)，還有一個N末端氨基(參見SEQ ID NO.4)。
中性金屬蛋白酶嗜熱菌蛋白酶具有34kDa的分子量，並在其表面上有11個氨基(即賴氨酸殘基)，還有一個N末端氨基(參見SEQ IDNO.5)。
脂解酶所涉及的脂解酶包括柔毛腐質黴(Humicola lanuginosa)脂酶(如在EP 258 068和EP 305 216中描述的那一種)，Humicolainsolens、Rhizomucor miehei脂酶(如EP 238 023所述)，犁頭酶脂解酶(WO 96/13578)，假絲酵母屬脂酶(如C.antarctica脂酶，例如在EP 214 761中描述的C.antarctica脂酶A或B)，假單胞菌屬脂酶(例如產鹼假單胞菌、類產鹼假單胞菌脂酶，如EP 218 272中所述；洋蔥假單孢菌脂酶，如EP 331 376中所述；WO95/14783中所公開的假單孢菌脂酶)，芽孢桿菌脂酶(例如枯草芽孢桿菌脂酶(Dartois等，(1993)Biochemica et Biophysica acta，1131，253-260)、嗜熱脂肪芽孢桿菌脂酶(JP 64/744992)和短小芽孢桿菌脂酶(WO 91/16422))。其它類型的脂解酶包括角質酶，例如在WO88/09367中描述的源自門多薩假單胞菌的角質酶，或源自Fusariumsolani pisi的角質酶(如在WO 90/09446中所述)。
氧化還原酶漆酶所涉及的漆酶包括在Novo Nordisk的WO 96/00290與WO95/33836中所公開的漆酶。
轉移酶轉穀氨醯胺酶適合的轉移酶包括在WO 96/06931(Novo Nordisk A/S)和WO96/22366(Novo Nordisk A/S)中所公開的任何轉穀氨醯胺酶。
異構酶蛋白質二硫鍵異構酶適合的蛋白質二硫鍵異構酶包括在WO 95/01425(Novo NordiskA/S)中描述的那些PDI，但並不限於此。
適於皮膚護理的酶活性本發明的第二個方面涉及包含本發明的被修飾酶和已知用於皮膚護理組合物的諸成分的皮膚護理組合物。
已知許多酶活性可用於皮膚護理組合物。
蛋白酶蛋白酶是潔膚產品中的有效成分。蛋白酶能除去皮膚死亡角質細胞的上層，由此使皮膚看上去更有光澤、更為清新。而且，蛋白酶也能提高皮膚的光滑性。
蛋白酶可用於化妝用品、盆浴和淋浴產品，包括香波、調理劑、洗劑、乳膏、肥皂塊、香皂以及液態肥皂。
脂酶脂酶可作為潔膚產品和抗痤瘡產品中的有效成分用於化妝品用途中，以除去過多的皮膚脂類，也可作為皮膚護理有效成分用於盆浴和淋浴產品(如乳膏和洗劑)中。
脂酶也可以用於頭髮清潔產品(例如香波)中，以有效地從頭髮表面除去皮脂和其它脂肪物質。
氧化還原酶用於個人護理用途的最常用的氧化還原酶是與底物(如葡萄糖)一起能確保產生H2O2的氧化酶(通常是葡糖氧化酶)，然後H2O2可起始過氧化物酶(通常是乳過氧化物酶)對例如SCN-或I-的氧化，形成抗微生物試劑(SCNO-或I2)。已知這一酶促複合物天然存在於例如乳汁和唾液中。
商業上，過氧化物酶在口腔護理產品(漱口液、牙粉、口香糖)中一直用作抗微生物體系，在這些產品中，它也可以與澱粉葡糖苷酶結合使用，以產生葡萄糖。已知這些體系也用於化妝品產品中，以利於保存。
氧化還原酶另一個應用是使用氧化酶、過氧化物酶和漆酶進行氧化性染髮(參見例如Novo Nordisk的WO 96/00290或WO95/33836)。
已知在皮膚(和頭髮)表面形成的自由基與皮膚的老化過程(頭髮的損壞)相關。
自由基會激活能導致脂膜、膠原以及細胞破壞的鏈式反應。
自由基清除劑(如超氧化物歧化酶)在化妝品中的應用是眾所周知的(R.L.Goldemberg，DCI，Nov.93，P.48-52)。
蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)也是一種氧化還原酶。它可以用於燙髮(使頭髮中的二硫鍵還原和再氧化)和修復受損頭髮(其中損傷主要是原有二硫鍵發生了還原)。
轉穀氨醯胺酶用於皮膚、頭髮或指甲的皮膚護理組合物包含(a)氨基功能活性成分，(b)催化活性成分與皮膚、頭髮或指甲交聯的轉穀氨醯胺酶，以及(c)在美國專利NO.5,490,980中已知的載體。
適合用於哺乳動物皮膚、頭髮或指甲的化妝品組合物包含(a)量足以在所說的皮膚、頭髮或指甲上形成保護層的至少一種角質細胞(corneocyte)包膜蛋白；(b)量足以使得在角質細胞包膜蛋白和所說皮膚、頭髮或指甲角質層中的外部暴露的角質細胞蛋白質之間形成共價鍵的轉穀氨醯胺酶；(c)量足以激活轉穀氨醯胺酶的鈣離子；以及(d)化妝上可接受的載體，其中所說的組合物包含具有兩相的乳化劑，其中所說的角質細胞包膜蛋白質包含在該兩相中的一相內，而轉穀氨醯胺酶包含在另一相內(參見美國專利NO.5,525,336)。
JP 3083908描述了一種皮膚化妝品材料，其中含有用水溶性物質修飾過的轉穀氨醯胺酶。該修飾物質是例如聚乙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚乙烯醇、葡萄糖、蔗糖、海藻酸、羧甲基纖維素、澱粉以及羥丙基纖維素中的一種或多種。這種修飾是通過例如導入活性基團並與酶鍵合完成的。這樣提供了一種對皮膚比較溫和、隨時間褪色和變味的程度較小、並具有良好的醫治粗糙皮膚、保溼性以及美化調理皮膚效果的物質。
本發明的皮膚護理產品本發明的第三個方面涉及包含本發明皮膚護理組合物的皮膚護理產品。術語「皮膚護理產品」如上定義。
本發明的皮膚護理產品可以包含有效量的本發明的被修飾酶。本領域熟練人員所知的這種有效量常佔最終皮膚護理產品的0-5％。
所涉及的本發明皮膚護理產品包括但不限於下列產品肥皂、化妝品、護膚膏、護膚凝膠、護膚奶、潔膚洗液、清潔霜、清潔露、潔膚奶、冷霜、冷制皂、化妝基料、清潔乳、面膜、含鋅化妝水、T區精華素、潤手香脂、香粉、增白粉、皂粉、塊皂、透明皂、唇膏、口紅、營養素、粉底霜、搽臉粉、眼影粉、粉底、指甲油清潔劑、生髮油、美發液、髮乳、發用凝膠、滋發劑、頭髮定形製品、染髮劑、頭髮著色劑、頭皮滋潤劑(scalp treatment)、香波、香膏、護髮素、髮膠、曬黑油(sur oil)、防曬品、剃鬚泡沫與凝膠、剃鬚膏、嬰兒油、粉刺護理製品、止汗劑、驅蟲劑、祛臭劑等。
常規皮膚護理產品配方術語「用於皮膚護理產品的成分」是指包括已知用於皮膚護理產品配方中的所有有效成分。這種成分的例子可參見「化妝品和化妝用品」(由Wilfried Umbach編輯，由Ellis Horwood有限公司出版，英國，(1991))以及「消費品中的表面活性劑」(由J.Falbe編輯，由Spring-Verlag出版，(1987))。
下面非窮盡性地列出了一些指導性配方。這些配方概述了本發明所涉及的重要皮膚護理產品配方。
香皂成分 例子％表面活性劑 肥皂(鈉鹽) 83-87螯合劑 乙二胺四乙酸鹽 0.1-0.3稠度調節劑 氯化鈉 大約0.5染料 ＜0.1光學增白劑 ＜0.1抗氧化劑 2，6-雙(1，1-二甲基乙基)-4-甲 0.1-0.3基苯酚(BHT)增白劑 二氧化鈦0.1-0.3香料 1.0-2.0酶 蛋白酶/脂酶 0-5水分 差額合成洗滌劑成分例子 ％表面活性劑 月桂基醚硫酸鹽30-50月桂基磺基琥珀酸鹽1-12加脂劑 脂肪醇10-20成形劑 甘油的單/二硬脂醯酯 0-10填料澱粉 0-10活性劑 水楊酸0-1染料 ＜0.2香料 0-2酶 蛋白酶/脂酶 0-5水分 差額泡沫浴和淋浴成分 例子％泡沫浴 ％淋浴表面活性劑月桂基醚硫酸鹽 10-20 10-12椰油醯胺丙基二甲基甜菜鹼2-4 2-4乙氧基化脂肪酸 0.5-2 -加脂劑脂肪醇 0.5-3乙氧基化脂肪醇 0.5-5 0-4酶蛋白酶/脂酶 0-5 0-5成分 例子％泡沫浴 ％淋浴泡沫穩定劑脂肪酸鏈烷醇醯胺0.2-2 0-4調理劑季銨化羥丙基纖維素 - 0-0.5增稠劑氯化鈉 0-3 0-3珠光劑乙二醇硬脂酸酯 0-2 -活性劑蔬菜提取物 0-1 0-1防腐劑5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷 0.1 0.1染料 0.1-0.2 0.1香料 0.3-3 0.3-2酶 蛋白酶/脂酶 0-5 0-5水分 差額 差額護膚膏(油包水型和水包油型)成分 例子 ％油包水型/水包油型乳化劑 脫水山梨醇倍半油酸酯 3-5 -硬脂酸鋁 1-2 -三乙醇胺硬脂酸 - 1-2十六烷醇/十八烷醇聚乙二醇 - 1-3醚脂肪衍生 棕櫚酸異丙酯 1-5 0-3物十六烷醇/十八烷醇 - 0-22-辛基十二烷醇 2-103-7硬脂酸/棕櫚酸 - 0-3辛酸/癸酸甘油三酯 5-10-甘油硬脂酸酯 - 0-5溼潤劑 甘油 1-5 1-5山梨糖醇 1-5 1-5聚(羥基羧酸) 0.5-2 -丙二醇 - 0-3穩定劑 硫酸鎂 0-0.8 -防腐劑 對羥基苯甲酸酯 0.2-0.4 0.2-0.4酶 蛋白酶/脂酶0-5 0-5水分 差額差額用於溼潤皮膚的爽身水(水包油型)和皮膚洗劑成分例子 ％爽身水％皮膚洗劑乳化劑 十六烷醇/十八烷醇聚乙二醇1-3 -醚脫水山梨醇單月桂酸酯 0.5-1 -硬脂酸鈉 - 1-2月桂基硫酸鈉 - 0.5-2脂肪衍生2-辛基十二烷醇 1-3 0-5物石蠟油(paraflin oils)- 20-25蜂蠟 0.5-1 -硬脂酸異辛酯 3-7 -棕櫚酸異丙酯 - 2-5溼潤劑 甘油 3-5 5-10山梨糖醇 - 0-5增稠劑 聚丙烯酸酯 0-0.3 0-1甲基羥丙基纖維素 0-0.3 0-0.5防腐劑 對羥基苯甲酸酯 0.2-0.4 0.2-0.4酶 蛋白酶/脂酶 0-5 0-5水分 差額差額潤面露成分 例子 ％表面活性劑 月桂基硫酸鎂 0.2-0.5加脂劑 己二酸二正丁基酯 1-2增溶劑 蓖麻油聚乙二醇醚 0.1-1清潔和清爽組分 乙醇 0-15溼潤劑 甘油 0-5山梨醇0-5防腐劑 對羥基苯甲酸酯0.2-0.4收斂劑 蔬菜提取物 1-5抗刺激劑泛醯醇 0-1尿囊素 0-0.2蔬菜提取物 0.5-3酶 蛋白酶/脂酶 0-5水分 差額洗髮香波成分例子 ％表面活性劑 月桂基醚硫酸鹽 12-16椰油脂肪酸醯氨丙基二甲 2-5基甜菜鹼脂肪酸聚乙二醇酯 0-2增泡劑 脂肪酸乙醇醯胺 0.5-2.5調理劑 季銨化羥乙基纖維素 0.4-1蛋白質水解產物 0.2-1加脂劑 乙氧基化的羊毛脂醇 0.2-1添加劑 去頭屑劑 0-1防腐劑 5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷 0.1-0.3珠光劑 乙二醇硬脂酸酯 0-2染料 ＜0.1pH調節劑酸/鹼0.1-1香料 0.3-0.5酶 蛋白酶/脂酶 0-5水分 差額護髮素和頭髮調理劑成分 例子 ％護髮素 ％頭髮調理劑表面活性 脂肪醇聚乙二醇醚 0.1-0.2 1.5-2.5劑十六烷基三甲基銨氯化物 0.5-1-二甲基苄基硬脂基銨氯化 -0.5-1物加脂劑 甘油的單/二鯨蠟酸/硬脂 0.5-1.5 1.5-2.5酸酯稠度調節 脂肪醇 1-2.52.5-3.5劑增稠劑 甲基羥丙基纖維素 0.3-0.6 0.4-0.8調理劑 季銨化羥乙基纖維素 0.1-0.3 0.3-0.4防腐劑 對羥基苯甲酸酯 0.1-0.3 0.1-0.3染料 ＜0.1＜0.1pH調節劑 酸/鹼0.1-10.1-1香料 0.2-0.5 0.2-0.5酶 蛋白酶/脂酶 0-5 0-5水分 差額 差額染髮劑成分 例子 ％組分1鹼性染髮膏表面活性劑 月桂基醚硫酸鹽1-4乙氧基化的蓖麻油 1-2稠度調節劑 脂肪醇8-10還原劑 亞硫酸鈉 0.8-1.2緩衝液 氯化銨0.5-1螯合劑 1-羥基乙烷-1，1-二膦酸0.1-0.2鹼性劑 氨1.2-2氧化染料 顯色劑(Developing agent) 1
偶聯劑 1酶 漆酶 0-5水分 差額組分II過氧化氫分散物表面活性劑 月桂基硫酸鹽 0.5-1氧化劑 過氧化氫 6-9穩定劑 1-羥基乙烷-1，1-二膦酸 1-1.5增稠劑 聚丙烯酸酯 3-5酶 漆酶 0-5水分 差額剃鬚膏成分例子 ％肥皂棕櫚酸/硬脂酸30-40氫氧化鉀 5-7氫氧化鈉 1-2脂肪組分椰子油 5-10聚乙二醇 0-2穩定劑 四硼酸鈉 0-0.5矽酸鈉 0-0.5山梨醇 0-3酶 蛋白酶 0-5水分 差額剃鬚液成分例子 ％消毒劑 乙醇 40-80加脂劑 己二酸二正丁基酯 1-2增溶劑 乙氧基化的蓖麻油 0.5-1收斂劑蔬菜提取物 1-10抗刺激劑 泛醯醇 0-0.5蔬菜提取物穩定劑甘油 0-5山梨醇 0-5丙二醇 0-3酶蛋白酶 0-5水 差額髮油成分 例子 ％稠度調節劑脂肪醇 4-5乙氧基化的羊毛脂醇 3-6礦物脂凡士林 45-52支鏈石蠟 10-18抗氧化劑 2，6-雙(1，1-二甲基乙基)-0.5-14-甲基苯酚(BHT)香料 0.2-0.4染料 0.1酶脂酶 0-5潤膚劑甘油 差額定型水成分 例子 ％溶劑 異丙醇 12-20成膜組分 乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯 2-3.5酯共聚物軟化劑乙烯基吡咯烷酮/二甲基氨 0.2-1基乙基異丁烯酸酯調理劑 蛋白質水解產物 0.2-0.5抗靜電劑 十六烷基三甲基銨氯化物 0.1-0.5乳化劑 乙氧基化的蓖麻油0.1-0.5香料 0.1-0.2染料 ＜0.1酶 脂酶0-5水分 差額本發明的最後一個方面涉及本發明的被修飾酶的用途，使用皮膚護理產品時，通過降低IgE應答而降低了皮膚護理產品的致敏能力。
材料和方法材料酶PD498WO 93/24623中所示的枯草桿菌蛋白酶類型的蛋白酶。PD498的序列在SEQ ID NO.1和2中顯示。
枯草桿菌蛋白酶DY分離自芽孢桿菌變種的、示於SEQ ID NO4的枯草桿菌蛋白酶類型蛋白酶(Detzel等(1993)，生物物理學檔案，302卷，2，P.499-502)。
ELISA試劑辣根過氧化物酶標記的抗大鼠Ig(Dako，DK，P162，#031；稀釋度1∶1000)。
小鼠抗大鼠IgE(Serotec MCA193；稀釋度1∶200)。
大鼠抗小鼠IgE(Serotec MCA419；稀釋度1∶100)。
生物素標記的小鼠抗大鼠IgG1單克隆抗體(Zymed03-9140；稀釋度1∶1000)生物素標記的大鼠抗小鼠IgGl單克隆抗體(Serotec MCA336B；稀釋度1∶1000)鏈黴親和素-辣根過氧化物酶(Kirkegard和Perry 14-30-00；稀釋度1∶1000)。
溶液終止溶液(DMG緩衝液)硼酸鈉，硼砂(Sigma)3，3-二甲基戊二酸(Sigma)CaCl2(Sigma)Tresyl氯化物(2，2，2-三氟乙磺醯氯)(Fluka)吐溫20聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯(Merck目錄號822184)1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)(Fluka)N-羥基琥珀醯亞胺(Fluka art.56480)碳醯氯(Fluka art.79380)乳糖(Merck 7656)PMSF(苯基甲基磺醯氟)Sigma琥珀醯-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-醯基對硝基苯胺(Suc-AAPF-pNP)Sigma NO.S-7388，分子量624.6g/摩爾。
著色底物OPD鄰苯二胺，(Kementec目錄號4260)試驗動物Brown Norway大鼠(得自Charles River，DE)Brown Norway大鼠(BN)在實驗開始時稱得體重為大於250克，在實驗結束時測得大約為450克。
Dunkin Hartley豚鼠，(得自Charles River，Wiga GmbhSulzfeld 1，Sandhofer Weg，DE)。
雄Dunkin Hartley(為Parainfluenza 3，E.cuniculi，Kpneumonia和P multocida的血清陰性)。動物在實驗開始時稱得體重為350-450克雌BALB/C小鼠(大約20g)(購自Bomholdtgaard，Ry，DK)裝備XCEL II(Novex)ELISA讀數儀(UVmax，Molecular Devices)HPLC(Waters)PFLC(Pharmacia)Superdex-75柱，Mono-Q，Mono S(購自Pharmacia，SW.)SLT購自SLT LabInstruments的Fotometer。
大小排阻層析儀(Spherogel TSK-G2000 SW)。
大小排阻層析儀(Superdex 200，Pharmacia，SW)Amicon小槽方法BALB/C小鼠的免疫通過皮下注射分別含有25μl PD498、PD498-SPEG 5,000和甘氨酸-SPEG-15,000的50μl 0.9％(重量/體積)NaCl溶液，對雌性Balb/C小鼠(20克)進行免疫。每一批的蛋白質量通過NanoOrange蛋白質定量試驗(Molecular Probes Europe N-6666)測定。免疫每兩周進行一次，共進行三個月。在免疫後一周時，從眼睛收集血液樣品(200μl)。通過血液凝固和離心獲得血清。
確定BALB/C小鼠中IgGl抗體相對濃度的ELISA方法1)用包被緩衝液中的1μg蛋白質/ml包被ELIAS板，在4℃下溫育過夜，或在室溫下溫育至少3小時。50μl/孔。輕微搖動。
2)倒空板，並用封閉緩衝液在室溫下封閉至少1/2小時。200μl/孔。輕微搖動。以洗滌緩衝液洗滌板3次。
3)將抗原與在稀釋緩衝液中的1/2稀釋度血清溫育。諸溶液在製備後立即添加到孔中。留一些孔僅用稀釋緩衝液處理(空白)。在室溫下溫育至少1小時。50μl/孔。輕微搖動。在洗滌緩衝液中洗滌板3次。
4)在稀釋緩衝液中稀釋生物素標記的大鼠抗小鼠IgGl單克隆抗體或生物素標記的小鼠抗大鼠IgGl單克隆抗體。在室溫下溫育至少1小時。50μl/孔。輕微搖動。在洗滌緩衝液中洗滌板3次。
5)在稀釋緩衝液中稀釋鏈黴親和素-辣根過氧化物酶。在室溫下溫育至少1小時。50μl/孔。輕微搖動。在洗滌緩衝液中洗滌板3次。
6)在底物緩衝液中混合0.6mg ODP/ml+0.4μl H2O2/ml。製備該溶液後立即使用。溫育10分鐘。50μl/孔。
7)終止反應加入終止溶液。50μl/孔。
8)在492nm對平板讀數，以620nm的讀數作為參照。數據用Lotus軟體計算並顯示。
確定BALB/C小鼠中IgE抗體相對濃度的ELISA方法使用三層夾心ELISA(three layer sandwish ELISA)確定特異性IgE血清抗體的相對濃度。
1)用10μg大鼠抗小鼠IgE或小鼠抗大鼠IgE/ml緩衝液1包被ELISA板。
50μl/孔。在4℃下溫育過夜。
2)倒空板並以封閉緩衝液在室溫下封閉至少1/2小時。
200μl/孔。輕微搖動。用洗滌緩衝液洗滌板3次。
3)與小鼠/大鼠血清一起溫育，從未稀釋的血清開始，並以2倍稀釋度連續稀釋。留一些孔僅用緩衝液4處理(空白)。50μl/孔。在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動。在洗滌緩衝液中洗滌板3次。
4)在稀釋緩衝液中將酶稀釋成適當的蛋白質濃度。50μl/孔。
在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動。在洗滌緩衝液中洗滌板3次。
5)用稀釋緩衝液稀釋特異性多克隆抗酶抗血清血清(pIg)以用於檢測結合抗體。50μl/孔。在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動。在洗滌緩衝液中洗滌板3次。
6)用稀釋緩衝液稀釋辣根過氧化酶結合的抗pIg抗體。50μl/孔。在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動。用洗滌緩衝液洗滌板3次。
7)於底物緩衝液中混合0.6mg ODP/ml+0.4μl H2O2/ml。製備好該溶液後立即使用。溫育10分鐘。50μl/孔。
8)終止反應加入終止溶液。50μl/孔。
9)在492nm對平板讀數，以620nm的讀數作為參照。數據用Lotus軟體計算並顯示。
用於測定IgGl陽性豚鼠的ELISA方法用碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)中的兔抗PD498 1∶8000包被ELISA微量滴定板，並在4℃下溫育過夜。第二天，用2％BSA封閉各板1小時，並用PBS吐溫20洗滌各板3次。
將1μg/ml PD498加入至各板中，溫育1小時，再用PBS吐溫20洗滌板3次。
將所有豚鼠血清樣品與對照加到具有2μl血清和98μl PBS的ELISA板上，溫育1小時，並以PBS吐溫20洗滌板3次。
然後將山羊抗豚鼠IgG1(PBS緩衝液中的1∶4000稀釋度(NordicImmunology 44-682))加到板上，溫育1小時，並用PBS吐溫20洗滌各板。
加入鹼性磷酸酶標記的兔抗山羊1∶8000(Sigma A4187)，溫育1小時，用PBS吐溫20洗滌板兩次，用二乙醇胺胺緩衝液洗滌板1次。
在37℃下，使用對硝基苯基磷酸酯對標記的鹼性磷酸酶顯色30分鐘，或者直到顯示出適當的顏色。
使用終止介質(包含EDTA的K2HPO4/HaH3緩衝液(pH 10))終止反應，並使用ELISA讀數儀讀取OD 405/650的數值。
在所有ELISA板上均包括雙盲樣本。
陽性和陰性血清值計算為平均盲值加2倍的標準差。這樣達到的準確度為95％。
大鼠的氣管內(IT)刺激使用具有2英寸長度金屬探頭的一次性注射器進行氣管內施用分子。這一探頭插入進大鼠的氣管中大約在會厭下1cm，放置0.1ml的分子溶液。刺激動物4次，最後一次刺激至放血之間間隔5天。
試驗動物是每組10隻的Brown Norway大鼠(BN)。在實驗開始時重量大於250克，實驗結束時重量大約450克。
豚鼠的氣管內(IT)刺激使用具有2英寸長度金屬探頭的一次性注射器進行氣管內施用分子。這一探頭插入進豚鼠的氣管中大約在會厭下1cm，放置0.1ml的分子溶液。一周刺激動物一次，連續刺激10周。
ELISA IgE試驗系統(用於Brown Norway大鼠)使用三層夾心ELISA確定特異性抗體的相對濃度。
使用免疫分子作為包被抗原(10μg/ml於中性磷酸鹽緩衝液中，50μl/孔)，於4℃下溫育過夜。所有殘留於孔表面的結合點用磷酸鹽緩衝液中的2％脫脂奶粉(200μl/孔)在室溫(RT)封閉至少30分鐘。用8-通道取液器，按50μl/孔，將欲用該抗原進行測試的所有血清的10倍稀釋度及隨後的3倍連續稀釋度加至平板中。各稀釋是在含有0.5％脫脂奶粉和0.05％吐溫20的磷酸鹽緩衝液中進行的，於室溫下在攪拌平臺上溫育2小時。「示蹤」分子是生物素醯化的小鼠抗大鼠IgE(50μl/孔)，在具有0.5％脫脂奶粉和0.05％吐溫20的磷酸鹽緩衝液中稀釋2000倍，於RT下在攪拌平臺上溫育2小時。對照(空白對照)的操作相同，但沒有大鼠血清。將稀釋2000倍的鏈黴親和素-辣根過氧化物酶50μl/孔在攪拌平臺上溫育1小時。50μl/孔的顯色底物是每10ml檸檬酸鹽緩衝液(pH5.2)中的OPD(6mg)和H2O2(4μl 30％的溶液)。按100μl/孔加入2N H2SO4以終止反應。利用SLT讀取486nm處的值，使用620nm處的值作為參照。數據用Lotus軟體計算和顯示。
測定分子量使用4-20％梯度的SDS聚丙烯醯胺凝膠(Novex)，通過標準方法進行蛋白質的電泳分離。蛋白質通過銀染檢測。相對於Novex的Mark-12寬範圍分子量標準的遷移率測量分子量。
蛋白酶活性用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa分析蛋白酶切割肽和對硝基苯胺之間的鍵，產生在405nm吸收的可見黃色。
緩衝液例如Britton和Robinson緩衝液pH8.3底物將100mg suc-AAPF-pNa溶解在1ml二甲基亞碸(DMSO)中。將100μl的這種溶液用Britton和Robinson緩衝液稀釋成10ml。
分析混合底物和蛋白酶溶液，在405nm下監測作為時間和ABS405nm/min的函數的吸光度。應該控制溫度(在20-50之間，取決於蛋白酶)。這測量的是樣品中的蛋白酶活性。
實施例實施例1用N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化mPEG 15,000
將mPEG 15,000懸浮在甲苯中(4ml/g mPEG)，在正常壓力下蒸餾除去20％以共沸乾燥反應物。當溶液冷卻到30℃時，加入二氯甲烷(1ml/g乾燥mPEG)，並加入甲苯中的碳醯氯(1.93M 5摩爾/摩爾mPEG)，混合物在室溫下攪動過夜。混合物蒸發至乾燥，所得的目的產物為蠟狀塊。
在蒸發之後，添加二氯甲烷和甲苯(1∶2，3ml/g乾燥mPEG)以重新溶解白色固體。以固體形式加入N-羥基琥珀醯亞胺(2摩爾/摩爾mPEG)，然後加入三乙胺(1.1摩爾/摩爾mPEG)。將混合物攪動3小時。混合物最初並不清亮，然後變得清亮，最後形成小沉澱。將混合物蒸發至乾燥，在乙酸乙酯(10ml)中重結晶，熱過濾以除去鹽和不溶性的微量物質。放置清亮液體，使其在室溫下緩慢冷卻16小時，然後在冰箱中過夜。濾出白色沉澱，以一些冷乙酸乙酯洗滌，並進行乾燥，得到98％(w/w)的產物。核磁共振表明有80-90％被活化和5o/oo(w/w)HNEt3Cl。mPEG 15,000(CDCl3)的1H-NMR為δ1.42t(I＝4.8 CH3iHNEt3Cl)，2.84s(I＝3.7琥珀醯亞胺)，3.10dq(I＝3.4 CH2iHNEt3Cl)，3.38s(I＝2.7 CH3iOMe)，3.40*dd(I＝4.5o/oo，13C satellite)，3.64bs(I＝1364主峰)，3.89*dd(I＝4.8o/oo13C satellite)，4.47dd(I＝1.8，PEG中的CH2)。於22℃下在乾燥器中存儲4個月後未見變化。
實施例2用N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化mPEG 5,000用N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化mPEG 5,000如實施例1所述進行。
實施例3PD498蛋白酶與活化的mPEG 5,000的結合在20ml的終體積內，於50mM硼酸鈉(pH10)中，將200mg PD498與1.8g用N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化的mPEG 5,000(按照實施例2製備)一起溫育。通過磁性攪拌，在室溫下進行反應。反應時間是1小時。通過添加DMG緩衝液至終濃度為5mM戊二酸二甲酯、1mM CaCl2和50mM硼酸鹽(pH5.0)來終止反應。
所得衍生物的分子量大約是100kDa，相當於每摩爾PD498連接了大約13摩爾mPEG。
與親本酶比較，被修飾酶對肽底物(琥珀醯-Ala-Ala-Pro-Phe-醯基對硝基苯胺)的剩餘活性接近100％。
實施例4枯草桿菌蛋白酶DY蛋白酶和活化的mPEG 5,000的結合使用與實施例3中所述相同的方法，將枯草桿菌蛋白酶DY蛋白酶與經N-琥珀醯亞胺碳酸酯活化的mPEG 5,000進行結合。
實施例5BALB/C小鼠皮下(SC)追蹤使用如上述實施例描述所製備的修飾的PD498-SPEG 5,000、未修飾的親本PD498和甘氨酸-SPEG 15,000皮下刺激BALB/C小鼠。
免疫小鼠的血清在特異性的IgE ELISA(如上所述)中進行檢測，以分析諸分子是否能活化免疫應答系統，引起特異性IgE應答(參見圖1)。
兩周一次共四次的免疫接種足以引發對PD498的IgE應答。
兩周一次的免疫方案持續3個月。在研究的最後，進行了七次免疫。如圖1所示，經未修飾的親本PD498免疫的BALB/C小鼠中，抗PD498 IgE水平在第5次免疫之前均增加，然後維持相當穩定的水平。相對而言，在用修飾的PD498-SPEG 5,000免疫過的小鼠中沒有檢測到特異性IgE應答。
實施例6豚鼠中PD498-SPEG 5,000的變應原性氣管內追蹤通過氣管內施藥，用1.0μg純化的PD498和1.0μg修飾的PD498-SPEG 5,000刺激Dunkin Hartley豚鼠。
用特異性的IgG1 ELISA(如上所述)檢測追蹤期間經免疫的Dunkin Hartley豚鼠的血清，以分析該分子是否能活化免疫應答系統，引起指示為變應性應答的特異性IgG1應答(參見圖2)。測定水平是1∶50。
圖2顯示了在10周的追蹤期間Dunkin Hartley豚鼠的IgG1水平。從圖中可以看出，在相當於第7周的第7號穿刺抽液(Tap-7)之前，檢測不到修飾的PD498的IgG1水平。用修飾的PD498連續刺激後，IgG1水平沒有明顯的提高。
實施例7豚鼠中劑量-反應的氣管內追蹤(IT)在豚鼠中通過氣管內追蹤檢測修飾的PD498-SPEG 5,000的潛在變應性應答。豚鼠一周刺激一次，連續10周。
在第一次氣管內刺激之前，使用如上所述用於豚鼠的ELISA，對從每隻Dunkin Hartley豚鼠收集的血樣進行血液檢測。這樣做是為了確保在ELISA中沒有血清的非特異性結合。
10隻一組的豚鼠用0.3微克、3微克、30微克、300微克的下列物質進行氣管內刺激■親本PD498，和■修飾的PD498-SPEG 5,000。
下列溶液用於盲檢■0.9％NaCl(用於親本PD498的盲檢)，■在0.9％NaCl中的300微克PEG 5,000(相當於PD498-SPEG5,000中的PEG量)(用於修飾的PD498-SPEG的盲檢)。
在IgG1 ELISA(如上所述)中檢驗所有試驗豚鼠的血清。圖3中給出了修飾的PD498-SPEG 5,000的氣管內追蹤結果。圖4中給出了未修飾的親本PD498的追蹤結果。
通過比較圖3和圖4可以看出與用親本酶氣管內刺激的豚鼠相比，用修飾的酶氣管內刺激豚鼠引起的應答有所降低。
按照前面公開的內容，對本領域技術人員來說明顯的是，實施本發明時，在不偏離本發明的實質或範圍的情況下可以有許多變更和修改。因此，本發明的範圍應按照下列權利要求定義的內容理解。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsveard(E)國家丹麥(F)郵區代碼(ZIP)DK-2880(G)電話45 4444 8888(H)傳真45 4449 3256(ii)發明名稱用於皮膚護理的被修飾酶(iii)序列數4(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release #1.0，版本#1.30(EPO)(2)關於SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度840個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來源(B)菌株芽孢桿菌PD498，NCIMB No.40484(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..840(xi)序列描述SEQ ID NO1TGG TCA CCG AAT GAC CCT TAC TAT TCT GCT TAC CAG TAT GGA CCA CAA 48Trp Ser Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Ser Ala Tyr Gln Tyr Gly Pro Gln1 5 10 15AAC ACC TCA ACC CCT GCT GCC TGG GAT GTA ACC CGT GGA AGC AGC ACT 96Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr Arg Gly Ser Ser Thr20 25 30CAA ACG GTG GCG GTC CTT GAT TCC GGA GTG GAT TAT AAC CAC CCT GAT144Gln Thr Val Ala Val Leu Asp Ser Gly Val Asp Tyr Asn His Pro Asp35 40 45CTT GCA AGA AAA GTA ATA AAA GGG TAC GAC TTT ATC GAC AGG GAC AAT192Lau Ala Arg Lys Val Ile Lys Gly Tyr Asp Phe Ile Asp Arg Asp Asn50 55 60AAC CCA ATG GAT CTT AAC GGA CAT GGT ACC CAT GTT GCC GGT ACT GTT240Asn Pro Met Asp Lau Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val65 70 75 80GCT GCT GAT ACG AAC AAT GGA ATT GGC GTA GCC GGT ATG GCA CCA GAT288Ala Ala Asp Thr Asn Asn Gly Ile Gly Val Ala Gly Met Ala Pro Asp85 90 95ACG AAG ATC CTT GCC GTA CGG GTC CTT GAT GCC AAT GGA AGT GGC TCA336Thr Lys Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Ala Asn Gly Ser Gly Ser100 105 110CTT GAC AGC ATT GCC TCA GGT ATC CGC TAT GCT GCT GAT CAA GGG GCA384Leu Asp Ser Ile Ala Ser Gly Ile Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Gly Ala115 120 125AAG GTA CTC AAC CTC TCC CTT GGT TGC GAA TGC AAC TCC ACA ACT CTT432Lys Val Leu Asn Leu Ser Leu Gly Cys Glu cys Asn Ser Thr Thr Leu130 135 140AAG AGT GCC GTC GAC TAT GCA TGG AAC AAA GGA GCT GTA GTC GTT GCT480Lys Ser Ala Val Asp Tyr Ala Trp Asn Lys Gly Ala Val Val Val Ala145 150 155 160GCT GCA GGG AAT GAC AAT GTA TCC CGT ACA TTC CAA CCA GCT TCT TAC528Ala Ala Gly Asn Asp Asn Val Ser Arg Thr Phe Gln Pro Ala Ser Tyr165 170 175CCT AAT GCC ATT GCA GTA GGT GCC ATT GAC TCC AAT GAT CGA AAA GCA576Pro Asn Ala Ile Ala Val Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asp Arg Lys Ala180 185 190TCA TTC TCC AAT TAC GGA ACG TGG GTG GAT GTC ACT GCT CCA GGT GTG624Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Thr Trp Val Asp Val Thr Ala Pro Gly Val195 200 205AAC ATA GCA TCA ACC GTT CCG AAT AAT GGC TAC TCC TAC ATG TCT GGT672Asn Ile Ala Ser Thr Val Pro Asn Asn Gly Tyr Ser Tyr Met Ser Gly210 215 220ACG TCC ATG GCA TCC CCT CAC GTG GCC GGT TTG GCT GCT TTG TTG GCA720Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ala225 230 235 240AGT CAA GGT AAG AAT AAC GTA CAA ATC CGC CAG GCC ATT GAG CAA ACC768Ser Gln Gly Lys Asn Asn Val Gln Ile Arg Gln Ala Ile Glu Gln Thr245 250 255GCC GAT AAG ATC TCT GGC ACT GGA ACA AAC TTC AAG TAT GGT AAA ATC816Ala Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Asn Phe Lys Tyr Gly Lys Ile260 265 270AAC TCA AAC AAA GCT GTA AGA TAC840Asn Ser Asn Lys Ala Val Arg Tyr275 280(2)關於SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度280個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Trp Ser Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Ser Ala Tyr Gln Tyr Gly Pro Gln1 5 10 15Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr Arg Gly Ser Ser Thr20 25 30Gln Thr Val Ala Val Leu Asp Ser Gly Val Asp Tyr Asn His Pro Asp35 40 45Leu Ala Arg Lys Val Ile Lys Gly Tyr Asp Phe Ile Asp Arg Asp Asn50 55 60Asn Pro Met Asp Leu Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val65 70 75 80Ala Ala Asp Thr Asn Asn Gly Ile Gly Val Ala Gly Met Ala Pro Asp85 90 95Thr Lys Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Ala Asn Gly Ser Gly Ser100 105 110Leu Asp Ser Ile Ala Ser Gly Ile Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Gly Ala115 120 125Lys Val Leu Asn Leu Ser Leu Gly Cys Glu Cys Asn Ser Thr Thr Leu130 135 140Lys Ser Ala Val Asp Tyr Ala Trp Asn Lys Gly Ala Val Val Val Ala145 150 155 160Ala Ala Gly Asn Asp Asn Val Ser Arg Thr Phe Gln Pro Ala Ser Tyr165 170 175Pro Asn Ala Ile Ala Val Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asp Arg Lys Ala180 185 190Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Thr Trp Val Asp Val Thr Ala Pro Gly Val195 200 205Asn Ile Ala Ser Thr Val Pro Asn Asn Gly Tyr Ser Tyr Met Ser Gly210 215 220Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ala225 230 235 240Ser Gln Gly Lys Asn Asn Val Gln Ile Arg Gln Ala Ile Glu Gln Thr245 250 255Ala Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Asn Phe Lys Tyr Gly Lys Ile260 265 270Asn Ser Asn Lys Ala Val Arg Tyr275 280(2)關於SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度274個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(vi)原始來源(B)菌株芽孢桿菌變種(xi)序列描述SEQ ID NO3Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val1 5 10 15Gln Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Gly Ile Ile Asp20 25 30Thr Gly Ile Ala (Ala/Ser) Ser His Thr Asp Leu Lys Val Val Gly Gly Ala3540 45Ser Phe Val Ser Gly Glu Ser Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly50 55 60Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val65 70 75 80Leu Gly Val Ala Pro Asn Val Ser Leu Tyr Ala Ile Lys Val Leu Asn85 90 95Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Ser Ala Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp100 105 110Ala Thr Gln Asn Gly Leu Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro115 120 125Ser Gly Ser Thr Ala Leu Lys Gln Ala Val Asp Lys Ala Tyr Ala Ser130 135 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Asp50 55 60Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala65 70 75 80Leu Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile85 90 95Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Asn Thr100 105 110Leu Phe Ser Gln Ala Trp Asn Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser115 120 125Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Ser Arg Gln Val130 135 140Asp Glu Tyr Val Arg Asn Asn Asp Met Thr Val Leu Phe Ala Ala Gly145 150 155 160Asn Glu Gly Pro Asn Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys165 170 175Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Tyr Arg Pro Ser Phe Gly
180 185 190Ser Ile Ala Asp Asn Pro Asn His Ile Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly195 200 205Ala Thr Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Thr210 215 220Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp225 230 235 240Ala Asn Tyr Asn Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala245 250 255Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Ile260 265 270Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Ile Lys Ala Ala Leu275 280 285Ile Ala Gly Ala Thr Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Ser Gly Asp Gln290 295 300Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val305 310 315 320Asn Glu Ala Thr Ala Leu Ala Thr Gly Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe325 330 335Gln Ala Gln Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Thr Asp340 345 350Ala Pro Gly Ser Thr Thr Ala Ser Tyr Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp355 360 365Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Gln Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe370 375 380Ser Tyr Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn385 390 395 400Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Ile Ile Glu Val Gln405 410 415Ala Tyr Asn Val Pro Ser Gly Pro Gln Arg Phe Ser Leu Ala Ile Val420 425 430His(2)關於SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度316個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(vi)原始來源(B)菌株Bacillus Thermoproteolyticus(xi)序列描述SEQ ID NO5Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly Asp1 5 10 15Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu Gln Asp20 25 30Asn Thr Arg Gly Asp Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys Tyr Arg Thr35 40 45Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn Gln Phe Phe Ala50 55 60Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr65 70 75 80Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Asn85 90 95Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn100 105 110Ala Phe Trp Asn Gly Ser Glu Met Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln115 120 125Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu130 135 140Thr His Ala Val Thr Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu145 150 155 160Ser Gly Ala Ile Asn Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val165 170 175Glu Phe Tyr Ala Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val180 185 190Tyr Thr Pro Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro195 200 205Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr210 215 220Gln Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala225 230 235 240Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val Val245 250 255Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala Leu Thr260 265 270Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg Ala Ala Ala275 280 285Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser Gln Glu Val Ala290 295 300Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val Lys305 310 31權利要求
1.一種被修飾酶，其特徵在於，其上有分子量為1-35kDa的4-70個聚合分子共價偶聯到分子量為15-100kDa的親本酶的表面。
2.按照權利要求1的被修飾酶，其特徵在於，有4-20個聚合分子共價偶聯到分子量為15-35kDa的所述酶的表面上。
3.按照權利要求2中任何一項的被修飾酶，其中有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、1 5、16、17、18、19或20個聚合分子，優選地13-18個聚合分子，共價偶聯到親本酶3-D結構的表面上。
4.按照權利要求1的被修飾酶，其中有7-40個、優選地10-30個聚合分子偶聯到分子量為35-60kDa的所述親本酶的表面上。
5.按照權利要求1的被修飾酶，其中有10-50個、優選地13-40個聚合分子偶聯到分子量為60-80kDa的所述親本酶的表面上。
6.按照權利要求1的被修飾酶，其中有15-70個、優選地18-60個聚合分子偶聯到分子量為80-100kDa的所述親本酶的表面上。
7.按照權利要求1-6中任何一項的被修飾酶，其中所述聚合分子的分子量為1-35kDa，如4-25kDa，優選地6-25kDa，尤其是8-20kDa。
8.按照權利要求1-7的被修飾酶，其中所述聚合分子選自包含天然或合成同聚物和異聚物的組。
9.按照權利要求8的被修飾酶，其中所述聚合物分子選自包含合成聚合分子的組，所述合成聚合分子包括分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸、聚(乙烯吡咯烷酮)以及聚D，L-胺基酸。
10.按照權利要求8的被修飾酶，其中所述聚合分子選自包含天然存在的聚合分子的組，所述天然存在的聚合分子包括葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖；纖維素，如甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素)；以及聚氨基葡糖的水解產物；澱粉，如羥乙基澱粉、羥丙基澱粉；糖原，瓊脂糖，瓜爾膠，菊粉，支鏈澱粉，合成生物聚合膠，角叉菜膠，果膠以及藻酸。
11.按照權利要求1-10中任何一項的被修飾酶，其中所述酶偶聯到已活化的聚合物上下列基團中的一種或多種上氨基、羥基、巰基、羧基、醛基或硫氫基。
12.按照權利要求1-11中任何一項的被修飾酶，其中所述聚合分子通過接頭(如三嗪環)偶聯到所述酶上。
13.按照權利要求1-12中任何一項的被修飾酶，其中所述酶是微生物來源的，如細菌、絲狀真菌或酵母來源的。
14.按照權利要求1-13中任何一項的被修飾酶，其中所述酶是一種水解酶，包括蛋白酶(如枯草桿菌蛋白酶)和脂酶。
15.按照權利要求14的被修飾酶，其中所述親本蛋白酶選自包括PD498、Savinase、蛋白酶K、蛋白酶R、Thermitase、枯草桿菌蛋白酶DY、Lion Y、Alcalase、蛋白酶T和JA16的組。
16.按照權利要求16的被修飾酶，其中所述酶是SEQ ID NO.1所示的PD498，或SEQ ID NO.3所示的枯草桿菌蛋白酶類型的蛋白酶枯草桿菌蛋白酶DY，或SEQ ID N0.4所示的Lion Y。
17.按照權利要求1-13中任何一項的被修飾酶，其中所述酶是一種氧化還原酶，包括漆酶和超氧化物歧化酶。
18.按照權利要求1-17中任何一項的被修飾酶，其中所述聚合分子通過位於酶表面上的氨基(-NH2)偶聯到所述酶上。
19.按照權利要求18的被修飾酶，其中所述聚合分子通過N-末端氨基或位於酶表面上的賴氨酸殘基偶聯到所述酶上。
20.按照權利要求1-19的被修飾酶，其中所述聚合分子偶聯到所述酶上距離酶活性位點大於5、優選地大於10的位置。
21.一種皮膚護理組合物，其中包含按照權利要求1-20中任何一項的被修飾酶以及已知用於皮膚護理產品的諸多成分。
22.一種皮膚護理產品，其中包含按照權利要求21的皮膚護理組合物，所述護理產品選自下組肥皂、化妝品、護膚膏、護膚凝膠、護膚奶、潔膚洗液、清潔霜、清潔露、潔膚奶、冷霜、冷制皂、化妝基料、清潔乳、面膜、含鋅化妝水、T區精華素、潤手香脂、香粉、增白粉、皂粉、塊皂、透明皂、唇膏、口紅、營養素、粉底霜、化妝底粉、眼影粉、粉底、指甲油清潔劑、生髮油、美發液、髮乳、發用凝膠、滋發劑、頭髮定形製品、染髮劑、頭髮著色劑、頭皮滋潤劑、香波、香膏、護髮素、髮膠、曬黑油、防曬品、剃鬚泡沫與凝膠、剃鬚膏、嬰兒油、粉刺護理製品、止汗劑、驅蟲劑、祛臭劑等。
23.按照權利要求1-20中任何一項的被修飾酶用於降低皮膚護理產品致敏能力的用途。
全文摘要
本發明涉及適用於皮膚護理的被修飾酶,其上有分子量為1－35kDa的4－70個聚合分子共價偶聯到分子量為15－100kDa的親本酶表面上。本發明還涉及包含這種被修飾酶的皮膚護理組合物和產品,最後還涉及所述被修飾酶用於降低皮膚護理產品致敏能力的用途。
文檔編號A61Q5/10GK1253585SQ9880176
公開日2000年5月17日 申請日期1998年1月12日 優先權日1997年1月10日
發明者A·A·奧爾森, A·普倫特 申請人:諾沃挪第克公司