一種石化廢水的基因毒性檢測方法
2023-12-05 02:58:31
專利名稱：一種石化廢水的基因毒性檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種石化廢水的毒性檢測方法，更具體的說是利用基因晶片技術檢測石化廢水分子毒性的方法。
背景技術：
石油化工合成的對苯二甲酸(terephthalic acid，TA)，俗稱精對苯二甲酸(PTA)。PTA是合成塑料、染料、農藥、化纖等產品的重要原料。已有眾多的研究報導表明，純化學品PTA具有急性毒性、亞急性毒性、慢性毒性和分子毒性。純化學品PTA生物毒性較低的研究報導甚多，可能產生了以純化學品PTA生物毒性替代PTA廢水生物毒性的誤解。迄今為止，只發現2篇PTA廢水生物毒性的研究報導[McBee K，BickHam J W，Arch.Environ.Contam Toxicol，1987；McBeeK，BickHam J W，Bull.Environ.Contam.Toxicol，1988]。事實是，PTA廢水中至少含有5種以上不同的苯環汙染物。苯環汙染物的COD佔PTA生產廢水總COD的70％以上。PTA廢水的生物毒性，是廢水中所有汙染物毒性的整合效應，不僅僅是廢水中所含的純化學品PTA。
基因晶片(DNA microarray)等生物晶片技術，已用於汙染物的分子毒性檢測，包括環境致癌機理，對人體敏感基因的影響等環境健康的研究、監測、評價；已用於環境微生物的多樣性檢測和環境質量評價。此外，生物晶片技術還可以在汙染物的環境分布與歸趨，汙染治理效果評價，汙染修復的微生物菌株篩選與改造等領域中發揮作用。1999年美國國家環境健康科學研究所(NIEHS)成功開發出毒理晶片(ToxChip)。有毒化學物質可使毒理晶片上基因的表達(開關)發生改變，晶片上基因表達變化的信息傳至已知毒物資料庫，進行典型分子遺傳毒性的比對分析，用以評價該化學物質的毒性，預測有毒化學物潛在的對人類基因組的危險性。
中國專利CN96180308.8(重組核酸序列和檢測樣品的基因毒性與誘變性以及基因毒性的動力學的方法)、CN200410076860.X(重組核酸序列和檢測樣品的基因毒性與誘變性以及基因毒性的動力學的方法)公開了採用生物傳感器來檢測樣品的基因毒性，這些發明需要培養包含帶有SOS調節型啟動子的核酸序列宿主微生物。其程序複雜，所需費用高。
發明內容
1、要解決的技術問題本發明的目的是提供一種石化廢水的基因毒性檢測方法，特別是對精對苯二甲酸的生產廢水，可以利用基因晶片技術簡便、準確的檢測分子毒性。
2、技術方案採用的技術方案如下一種石化廢水的基因毒性檢測方法，包括以下步驟(1)選取受試動物，利用石化廢水進行亞急性毒性試驗與肝臟取樣；(2)提取肝臟的總RNA，以RNA為模板合成cDNA；(3)合成cRNA，片斷化生物素標記的cRNA；(4)標記的cRNA經片斷化處理後用於基因晶片雜交，基因晶片進行雜交、洗脫、染色及檢測；(5)對獲得數據進行聚類分析和處理，得到基因表達水平，從中分析出基因毒性。
步驟(1)中所述的石化廢水是指精對苯二甲酸的生產廢水。步驟(5)中所述的聚類分析和處理是指以散點圖為基礎進行數據分析，再具體而言是指選取散點圖中表達明顯增強和表達明顯減弱的基因作為數據分析的基礎。
本發明的原理是運用基因表達譜晶片檢測PTA石化廢水對哺乳動物基因表達的作用和影響。通過實驗研究，分析上調或下調的基因表達水平來查找受到幹擾的基因及其對小鼠生理生化、新陳代謝途徑等的影響。
3、有益效果本發明提供了一種石化廢水的生殖毒性檢測與評價方法，可以簡便、準確的檢測分子毒性。其它方法檢測PTA純化學品分子毒性效應劑量，是本發明檢測PTA廢水對小鼠毒性效應PTA劑量的5-312倍。本發明靈敏、快速、高效，同時也可以適用於其他有機廢水。
四、說明書附1為分析灰度圖數據所得的散點圖。
五具體實施例方式
以下通過實施例進一步說明本發明1.受試動物與肝臟取樣受試動物為昆明種(Mus musculus，KM)雄性小鼠，由JS-NJ-JN青龍山動物飼養中心提供，體重平均20g，馴養7天，死亡率＜5％，用於試驗。小鼠隨機分為對照組和染毒組，各12隻。通過口腔灌胃，染毒組0.2ml廢水/d，對照組0.2ml生理鹽水/d。連續口腔灌胃35天(2005/4/5-2005/5/10)，取小鼠體內肝臟0.2g，迅速切成厚度＜0.5cm的碎塊，置於2ml RNA laterTM(購於QIAGEN公司)的保存液中。
2.提取總RNA2.1.提取總RNA使用Invitrogen公司TRIzol試劑提取肝臟總RNA，實驗步驟參考TRIZOLReagent(U.S.Patent No.5,346,994)要求。
2.2.純化總RNA使用QIAGEN公司RNeasy Mini Kit(Qiagen，P/N 74104)純化肝臟總RNA。
2.3.檢測總RNA紫外檢測在260nm處的吸光度，1個OD＝40μg/ml RNA。根據在260nm和280nm處的吸光值，檢測RNA的純度，純RNA的OD260/OD280比值應接近2.0(比值最好在1.9～2.1之間)。
3.以RNA為模板合成cDNA3.1.合成1stcDNA採用Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit。
合成1stcDNA的反應系統見表1。
表1.合成1stcDNA反應系統
3.2.合成2ndcDNA合成2ndcDNA，使用Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit。
(1)把第一條鏈的產物置於冰上，加入91μL RNase-Free water，30μL of 5×2ndStrand Buffer，3μL of dNTP(10mM)，1μL of E.coli DNA Ligase(10U/μl)，4μL ofE.coli DNA Polymerase(10U/μl)，1μL of E.coli RNase H(10U/μl)。總體積130μl。混勻，16℃，反應2小時；(2)加入2ul T4DNAPolymerase，混勻，16℃，5分鐘；(3)加入10ul EDTA(0.5M)，混勻，終止反應。-20℃保存。
3.3.純化cDNA用Affymetrix GeneChip Sample Cleanup Module純化cDNA。
4.合成cRNA4.1.以cDNA為模板外轉錄(IVT)合成cRNA使用GeneChip IVT Labeling Kit，合成cRNA。在外轉錄過程中進行cRNA的生物素標記。
4.2.純化cRNA使用Genechip Sample Cleanup Module純化cRNA。
4.3.cRNA的定量和檢測用紫外分光光度計測量cRNA的濃度和OD260/OD280；5.片斷化生物素標記的cRNA15μg cRNA，6μl 5×Fragmentation Buffer，補充RNase-Free Water至30μl。混勻，94℃溫浴35分鐘，之後置於冰上。
6.基因晶片和晶片雜交、洗脫、染色及檢測標記的cRNA經片段化處理後用於與基因晶片雜交。晶片的雜交、洗脫、染色及檢測之過程的一切操作均按Affymetrix公司推薦的條件進行。
7.對數據進行聚類分析和處理7.1數據分析散點1是灰度圖數據分析所得的散點圖。橫坐標是對照組(control)小鼠肝臟cRNA與基因晶片雜交結果的掃描信號的對數值，縱坐標是染毒樣品組(sample)小鼠肝臟cRNA與基因晶片雜交結果的掃描信號的對數值。
圖中8條斜線的中間兩條斜線(第4-第5)之間的散點，是對照組和染毒樣品組基因正常表達的區域，即對照組的基因表達與染毒樣品組的基因表達一致。中間兩條斜線以下的區域，是染毒樣品組基因的表達弱於對照組的散點區；中間兩條斜線以上的區域，是染毒樣品組基因的表達強於對照組的散點區。散點的斜率＞2，可以直觀指示目標基因的表達顯著增強，散點的斜率＜0.5表明目標基因的表達顯著減弱。目標基因表達的顯著增強或減弱，即可指示染毒小鼠相應的基因組(genome)中毒。
7.2數據分析方法我們從散點圖所示的上萬個信號值中，選取232個表達明顯增強的基因和74個表達明顯減弱的基因作為我們數據分析的基礎。為了進一步了解PTA廢水的危害，我們選取表達值增強和減弱最為顯著的各5個基因作為數據分析的對象，查閱文獻並研究其基因編碼的蛋白的功能，探究PTA石化廢水對小鼠這種哺乳動物在基因水平上可能產生的最大毒副作用，了解這種廢水可能對人體產生的潛在威脅。
7.3基因表達譜分析表2.染毒樣品組小鼠肝臟cRNA與基因晶片雜交中10個基因極端表達結果分析
應用GCOS軟體及Normalization方法進行數據分析，比較對照組與染毒樣品組小鼠的肝臟cRNA與基因晶片雜交的基因表達譜。染毒樣品組小鼠肝臟cRNA與基因晶片雜交的14000個基因表達產物中，有306個基因表達產物的信號值有顯著的增強或減弱現象。其中染毒樣品組有232個基因表達譜顯著強於對照組，74個基因表達譜顯著弱於對照組。分別從232個表達顯著增強基因和74個表達顯著減弱基因中各挑選出5個極端表達數據的基因見表5.
從表5可以看出，5個表達增強的基因涉及小鼠的免疫功能、白細胞在體內的活動以及炎症反應、肝臟的解毒功能、生殖系統以及荷爾蒙的調節。5個表達減弱的基因涉及小鼠的免疫功能、內源性類固醇的調節和激素的代謝、身體的發育、癌細胞的增殖。表達增強的基因和表達減弱的基因共同涉及的是免疫功能、荷爾蒙的代謝和身體發育、抗腫瘤膜和抗感染、影響生殖共4個方面。
7.4基因晶片檢測PTA廢水毒性的比較分析表3.基因晶片檢測PTA廢水毒性結果的比較
PTA廢水的總COD＝9072mg/L，其中PTA的COD為2993.8mg/L，佔總COD的33％。PTA廢水中5種苯環汙染物的物質總濃度為7676.4mg/L，PTA佔其中的39％。本研究中受試小鼠的平均體重20g，飼餵PTA廢水的劑量為0.2mL/d(口腔灌胃)，相當於中毒劑量為0.0907gCOD/(Kg體重·d)和0.032gPTA/(Kg體重·d)。
從表3可以看出，基因晶片檢測出PTA廢水對小鼠中毒的COD劑量為0.0907g/(Kg·d)；PTA劑量為0.032g/(Kg·d)；5種苯環汙染物劑量為0.0768g/(Kg·d)；中毒時間僅為35d時，即可發現PTA廢水對小鼠存在的分子毒性。而其它方法檢測出PTA純化學品分子毒性的效應濃度是基因晶片的5-312倍，表明基因晶片檢測的靈敏度遠遠高於其它方法。對於準確預警PTA廢水的環境健康與生態安全，具有重要意義。
本次實驗結果表明(1)以PTA石油化工廢水口腔灌胃飼餵雄性小鼠35d，中毒劑量為0.0907gPTA/(Kg·d)時，有232個基因表達顯著增強，74個基因表達顯著減弱。
(2)PTA廢水增強表達的前5個基因，主要涉及小鼠的免疫功能、神經炎症的控制、肝臟解毒、生殖功能。
(3)PTA廢水減弱表達的前5個基因，主要涉及小鼠的免疫功能、荷爾蒙代謝、身體發育、控制癌細胞的增殖以及抗感染。
(4)其它方法檢測PTA純化學品分子毒性效應劑量，是基因晶片檢測PTA廢水對小鼠毒性效應PTA劑量的5-312倍。基因晶片方法靈敏、快速、高效。
權利要求
1.一種石化廢水的基因毒性檢測方法，其特徵在於包括以下步驟(1)選取受試動物，利用石化廢水進行亞急性毒性試驗與肝臟取樣；(2)提取肝臟的總RNA，以RNA為模板合成cDNA；(3)合成cRNA，片斷化生物素標記的cRNA；(4)標記的cRNA經片斷化處理後用於基因晶片雜交，基因晶片進行雜交、洗脫、染色及檢測；(5)對獲得數據進行聚類分析和處理，得到基因表達水平，從中分析出基因毒性。
2.根據權利要求1所述的一種石化廢水的基因毒性檢測方法，其特徵在於步驟(1)中所述的石化廢水是指精對苯二甲酸的生產廢水。
3.根據權利要求1中所述的一種石化廢水的基因毒性檢測方法，其特徵在於步驟(5)中所述的聚類分析和處理是指以散點圖為基礎進行數據分析。
4.根據權利要求3中所述的一種石化廢水的基因毒性檢測方法，其特徵在於步驟(5)中所述的聚類分析和處理是指選取散點圖中表達明顯增強和表達明顯減弱的基因作為數據分析的基礎。
全文摘要
本發明公開了一種石化廢水的基因毒性檢測方法，涉及基因晶片技術檢測分子毒性。其方法包括以下步驟選取受試動物，利用石化廢水進行亞急性毒性試驗與肝臟取樣；提取肝臟的總RNA，以RNA為模板合成cDNA；合成cRNA，片斷化生物素標記的cRNA；標記的cRNA經片斷化處理後用於基因晶片雜交，基因晶片進行雜交、洗脫、染色及檢測；對獲得數據進行聚類分析和處理，得到基因表達水平，從中分析出基因毒性。其它方法檢測PTA純化學品分子毒性效應劑量，是本發明檢測PTA廢水對小鼠毒性效應PTA劑量的5－312倍。本發明靈敏、快速、高效，同時也可以適用於其他有機廢水。
文檔編號C12N15/00GK1793914SQ20051012277
公開日2006年6月28日 申請日期2005年12月2日 優先權日2005年12月2日
發明者程樹培, 朱程軍, 趙大勇, 孫石磊, 張徐祥, 潘文揚, 崔益斌, 陸建華, 喻敬周, 陳俊, 王淇麗, 蔣麗娟, 肖 琳, 於紅霞, 孫成 申請人:南京大學