細胞色素氧化酶1A1酶檢測試劑盒及其使用方法和應用與流程
2023-12-05 05:00:36 2
本發明屬醫藥生物技術領域，具體涉及一種細胞色素氧化酶1a1酶檢測試劑盒及其使用方法和應用。
背景技術：
細胞色素p450(cytochromep450,p450)酶，又稱混合功能氧化酶或微粒體單加氧酶，是機體內最重要的藥物代謝酶。p450參與了人體膽固醇，激素，脂肪酸，維生素等內源性物質的合成和代謝，對維持人體正常生理功能起到重要作用，同時也參與了多數外來物的生物轉化，大約70％的藥物(包括絕大部分臨床藥物和殺蟲劑)的主要清除是由p450介導的。細胞色素p450酶催化的i相反應是化合物在體內代謝的關鍵步驟，因為這一步反應通常是藥物從體內清除的限速步驟，可影響化合物的半衰期、清除率等動力學特徵，且p450酶活性常隨遺傳因素、年齡、疾病狀態或其它藥物相互作用的影響而發生改變。藥物對機體p450酶的影響，能造成臨床上顯著的藥物相互作用。
cyp1a1是重要的i相代謝酶，主要在人肝外組織中表達，例如人肺、皮膚、小腸中表達。cyp1a1參與多種環境毒素和內源性底物的代謝，並在多種前致癌物被激活成具有遺傳毒性中間體或最終致癌物的過程中起到了重要作用,例如在一定程度上激活咖啡因誘使肝硬化的發生(molaspectsmed.1999.20：1-137)。除此之外，cyp1a1的分布存在很大的個體差異，cyp1a1酶的表達受遺傳、年齡、疾病、性別、環境和共服藥物等多種因素的影響。因此，cyp1a1在不同個體中的肝臟含量也有很大差別，其含量範圍分別為：cyp1a1:0-3pmol/mg(pharmacology&therapeutics2013；138:103)。因此，開展cyp1a1酶活的個體差異研究對於臨床個性化安全用藥有著重要意義。目前國內外製藥巨頭在藥物開發過程中，需要在體外評估各候選新藥抑制cyp1a1的能力。因此，開發高效、超靈敏、高特異性的cyp1a1活性檢測方法對於臨床樣本中cyp1a1活性的檢測，以及新藥高內涵高通量篩選至關重要。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種細胞色素氧化酶1a1的螢光試劑盒及其使用方法和應用。
一種細胞色素氧化酶1a1酶檢測試劑盒，該試劑盒使用n-正丁基-4-氯乙氧基-1，8-萘醯亞胺作為cyp1a1探針底物(圖1)，化合物可被cyp1a1特異性氧化代謝釋放出去氯乙基化代謝產物，通過定量檢測單位時間內其去氯乙基化代謝產物的生成量來測定各類生物樣品中cyp1a1酶的活性。該酶促反應具有選擇性高、代謝產物易檢測、酶活及抑制活性評價快速高效等特點。
一種細胞色素氧化酶1a1酶檢測試劑盒，該試劑盒包括5種試劑：a液、b液、c液、d液、e液和質控標準品；
所述a液為：ph＝7.4,100mm磷酸鹽緩衝液，40mmmgcl2，100mm6-磷酸葡萄糖，
所述b液為1unit/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，
所述c液為0.1～10mm的式(1)化合物的溶液，溶劑為c2h3n，
所述d液為10mmnadp+，
所述e液為c2h3n，
所述質控標準品為5mg/ml的cyp1a1水溶液。
保存方式：保存在－20℃冰箱裡，所述a液、所述b液、所述c液和所述d液避免光照，終止液(reagentd)具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月。
一種細胞色素氧化酶1a1酶檢測試劑盒的使用方法，具體按下面步驟進行：
(1)預孵育：將待測樣品與a液，b液和c液混勻，優選37℃為最優反應時間；孵育體系ph介於5.5～10.5之間，優選ph7.4為最優反應ph值，37℃孵育下孵育3～5分鐘；
(2)起始反應：加入d液後混勻，37℃孵育下孵育20～120分鐘；
(2)檢測：加入e液終止，確保以上底物相應的o-去氯乙基化產物達到定量限且底物轉化率不超過20％時終止反應；
所述待測樣品為：重組表達的細胞色素氧化酶1a1單酶、人組織製備液、各類組織細胞或其他生物體系；
一種細胞色素氧化酶1a1酶檢測試劑盒的應用，該試劑盒可用於細胞色素氧化酶1a1活性的快速定量檢測，以及該酶抑制劑的快速篩選與評估。
所述試劑盒用於細胞色素氧化酶1a1活性的快速定量檢測的方法為：探針底物n-正丁基-4-氯乙氧基-1，8-萘醯亞胺可被人細胞色素氧化酶1a1特異性氧化代謝釋放出去氯乙基化代謝產物；按照試劑盒的使用方法，通過定量檢測單位時間內去氯乙基化代謝產物的生成量來測定各類生物樣品中cyp1a1酶的活性。
該試劑盒用於細胞色素氧化酶1a1抑制劑的快速篩選與評估方法為：以式(1)化合物的氧化反應作為cyp1a1的特異性探針反應，按照試劑盒的使用方法，通過定量比較抑制劑存在與缺失狀態下單位時間內其底物消除量或去氯乙基化產物的生成量評估該生物體系中cyp1a1的殘餘活性，進而實現cyp1a1抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價。
該試劑盒檢測原理是利用細胞色素氧化酶1a1能催化脫烷基化反應的特性，特異地識別與催化式(1)化合物結構中的氯乙基，在生理ph條件下催化生成相應的o-去氯乙基化產物。利用該探針反應可對多種生物體系中cyp1a1的分布和功能進行定量評價。其檢測原理如圖9所示。
本發明所述特異性檢測細胞色素氧化酶(cyp1a1)的試劑盒的應用領域，包括但不限於重組表達的cyp1a1酶、含有cyp1a1的細胞及組織製備物等生物樣品中cyp1a1活性的定量測定。
本發明提供的檢測細胞色素氧化酶(cyp1a1)的試劑盒的應用，需注意所述去氯乙基化產物的生成率應介於0.1％～20％之間。
本發明所提供的檢測細胞色素氧化酶(cyp1a1)的試劑盒，底物n-正丁基-4-氯乙氧基-1，8-萘醯亞胺均是螢光化合物，可採用酶標儀實現產物的快速靈敏檢測。此外，該比率型特異性探針底物及相應cyp1a1活性檢測過程受生物體系基質及雜質的幹擾較少，可用於各種生物體系中cyp1a1酶活的定量測定。
本發明中試劑盒可用於重組細胞色素氧化酶、細胞或組織製備液等多種生物體系中cyp1a1酶活的定量測定，還可用於快速篩選cyp1a1酶的抑制劑及抑制能力的定量評價。
選用本發明所述的細胞色素氧化酶1a1檢測試劑盒及其使用方法具有以下突出優勢：
(1)高特異性：1,8-萘醯亞胺類化合物可被細胞色素氧化酶cyp1a1單酶高特異性地代謝成一個代謝產物，即o-去氯乙基化產物；
(2)廉價易得：1,8-萘醯亞胺類化合物可經化學合成獲得，合成工藝簡單易行；
(3)高靈敏度：具有1,8-萘醯亞胺母核結構的化合物均具有良好的螢光發射光譜特性(450～700nm)，且該底物及其o-去氯乙基化代謝產物具有不同的螢光發射光譜特徵(如圖9所示)，能較好的進行區分檢測，同時可通過比率型標準曲線的建立進行定量測定cyp1a1單酶的檢測下限為5nm。
(4)高通量檢測：利用該類螢光探針底物可實現96,386孔板的快速檢測，可實現每日2萬個樣品的高通量檢測，具有單個測試成本低廉(<0.5元)的優勢。
附圖說明
圖1.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺的結構；
圖2.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺的檢測流程圖；
圖3.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺的人cyp重組單酶篩選試驗結果；
圖4.cyp1a1氧化代謝n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺的線性反應濃度；
圖5.cyp1a1的活性化學抑制實驗；
圖6.12例hlm對n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺的代謝圖；
圖7.22例肺癌和癌旁s9對n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺的氧化代謝速率差異；
圖8.不同濃度的tcdd誘導腫瘤細胞s9對n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺的氧化代謝速率差異；
圖9.cyp1a1介導n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺的代謝通路示意圖；
具體實施方式
下面的實施例將對本發明予以進一步的說明，但並不因此而限制本發明。細胞色素氧化酶1a1酶檢測試劑盒的結構通式如圖1所示，檢測流程如圖2所示。
實施例1.體外測定人重組cyp單酶的選擇性
(1)預先準備90μlcyp代謝反應體系，包括ph7.4的pbs緩衝液(100mm)、40mmmgcl2、100mm6-磷酸葡萄糖、1unit/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、重組人cyp各單酶(50nm)、n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺終濃度為10μm，於37℃條件下震蕩預孵3分鐘；
(2)向反應體系中加入10μl濃度為10mm的nadp+起始反應；
(3)30分鐘後，加入100μlc2h3n，劇烈震蕩後，終止反應；
(4)用高速冷凍離心機在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘後，取上清，進行螢光檢測(ex＝372nm，em＝450nm)；重組人cyp1a1酶的選擇性最高約是其它單酶的10倍左右(圖3)。
實施例2.cyp1a1氧化代謝n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺的線性反應濃度
(1)預先準備90μlcyp代謝反應體系，包括ph7.4的pbs緩衝液(100mm)、40mmmgcl2、100mm6-磷酸葡萄糖、1unit/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、重組人cyp各單酶(系列濃度)、n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺終濃度為10μm，於37℃條件下震蕩預孵3分鐘；
(2)向反應體系中加入10μl濃度為10mm的nadp+起始反應；
(3)1h後，加入100μlc2h3n，劇烈震蕩後，終止反應；
(3)用高速冷凍離心機在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘後，取上清，進行螢光檢測(ex＝372nm，em＝450nm)；n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺能檢測到5nm的cyp1a1(圖4)。
實施例3.cyp1a1抑制劑的抑制能力表徵
(1)預先準備cyp代謝反應體系，包括ph7.4的pbs緩衝液(100mm)、40mmmgcl2、100mm6-磷酸葡萄糖、1unit/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、人肝微粒體、不同cyp亞型的特異性抑制劑、n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺終濃度為10μm或，於37℃條件下震蕩預孵5-20分鐘；
(2)向反應體系中加入20μl濃度為10mm的nadp+起始反應；
(3)30分鐘後，加入200μlc2h3n，劇烈震蕩後，終止反應；
(4)用高速冷凍離心機在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘後，取上清，進行螢光檢測(ex＝372nm，em＝450nm)；n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺在人肝微粒體中的去氯乙氧基活性能夠分別被cyp酶和cyp1a1亞型特異性抑制劑abt和呋喃茶鹼顯著抑制，而其它cyp亞型抑制劑對其氧化反應沒有顯著的抑制活性，證實n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺能夠特異性檢測複雜生物樣本的cyp1a1的活性(圖5)。
實施例4.不同個體來源肝微粒體中cyp1a1的活性定量評估
(1)選取12例人肝微粒體(hlm)稀釋至2.5mg/ml，準備cyp1a1代謝反應體系，包括ph7.4的pbs緩衝液(100mm)、40mmmgcl2、100mm6-磷酸葡萄糖、1unit/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、人肝微粒體，n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺終濃度為10μm，於37℃條件下震蕩預孵3分鐘；
(2)向反應體系中加入20μl濃度為10mm的nadp+起始反應；
(3)30分鐘後，加入200μlc2h3n，劇烈震蕩後，終止反應；
(4)用高速冷凍離心機在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘後，取上清，進行螢光檢測(ex＝372nm，em＝450nm)，將所獲螢光強度代入標準曲線後得到12例人肝微粒體(hlm)對n-正丁基-4-甲氯乙基-1,8-萘醯亞胺的代謝速率(圖6)。
實施例5.不同個體來源肺癌和癌旁s9中cyp1a1的活性定量評估
(1)選取22例肺癌和其對應的癌旁組織s9，準備cyp1a1代謝反應體系，包括ph7.4的pbs緩衝液(100mm)、40mmmgcl2、100mm6-磷酸葡萄糖、1unit/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、人肺s9、n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺終濃度為10μm，於37℃條件下震蕩預孵3分鐘；
(2)向反應體系中加入20μl濃度為10mm的nadp+起始反應；
(3)30分鐘後，加入200μlc2h3n，劇烈震蕩後，終止反應；
(4)用高速冷凍離心機在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘後，取上清，進行螢光檢測(ex＝372nm，em＝450nm)，將所獲螢光強度代入標準曲線後得到22例肺癌和其對應的癌旁組織s9對n-正丁基-4-甲氯乙基-1,8-萘醯亞胺的代謝速率(圖7)。
實施例6.腫瘤細胞中cyp1a1的活性定量評估
(1)選取被不同濃度cyp1a1誘導劑tcdd誘導的腫瘤細胞，準備cyp1a1代謝反應體系，包括ph7.4的pbs緩衝液(100mm)、40mmmgcl2、100mm6-磷酸葡萄糖、1unit/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、細胞勻漿、n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘醯亞胺終濃度為10μm，於37℃條件下震蕩預孵3分鐘；
(2)向反應體系中加入20μl濃度為10mm的nadp+起始反應；
(3)30分鐘後，加入200μlc2h3n，劇烈震蕩後，終止反應；
(4)用高速冷凍離心機在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘後，取上清，進行螢光檢測(ex＝372nm，em＝450nm)，將檢測到的螢光強度代入標準曲線後得到不同濃度tcdd誘導的腫瘤細胞對n-正丁基-4-甲氯乙基-1,8-萘醯亞胺的代謝速率(圖8)。