遊動放線菌阿卡布糖生物合成基因及其分離方法和應用的製作方法

2023-12-05 04:46:36 2

專利名稱：遊動放線菌阿卡布糖生物合成基因及其分離方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及來自放線菌，主要是遊動放線菌屬SE 50/110及其突變株的阿卡布糖(acarbose)生物合成基因；涉及放線菌屬阿卡布糖生物合成基因的分離方法，即利用來源於已知的dTDP-葡萄糖脫水酶高度保守的蛋白區域的基因探針，尋找基因acbA(編碼dTDP-葡萄糖合酶)、acbB(編碼dTDP-葡萄糖脫水酶)和acbC(編碼一種環化酶，此環化酶與AroB即細菌3-脫氫奎尼酸合酶部分相同)，或者一個或多個來自遊動放線菌屬的阿卡布糖生物合成基因。本發明還涉及阿卡布糖生物合成基因的應用。
早期的專利申請(例如DE 2 064 092、DE 2 209 8334)涉及到以下發現，即許多放線菌，特別是遊動放線菌科，產生糖苷水解酶(優選消化道的碳水化合物水解酶)的寡糖樣抑制劑。所描述的此組抑制劑中，效力最強的抑制劑是化合物阿卡布糖，即O-4，6-二脫氧-4-[[1S-(1S，4R，5S，6S)-4，5，6-三羥基-3-(羥甲基)-2-環己烯-1-基]-氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-D-吡喃葡萄糖(DE2347782)。
在人類醫學上，阿卡布糖用於糖尿病的控制。遊動放線菌屬SE50(CBS No.961.70)及該菌株的天然變異株SE 50/110(CBS614.71)[DE22 09 834]，以及它們的選擇株和突變株，產生次級代謝物阿卡布糖。原始分離物來自肯亞的Ruiru附近。在上述專利申請，例如上述德國專利申請的實施例1-4中，描述了此類型蔗糖酶抑制劑的分離。從阿卡布糖的結構上預計，阿卡布糖分子的脫氧葡萄糖部分的生成與各種抗生素的6-脫氧糖殘基的生物合成相一致。所述抗生素的例子有氨基糖苷類，如鏈黴素、春日黴素；大環內酯類，如紅黴素、泰樂黴素；多烯類，如兩性黴素A和B、制黴菌素；蒽環型藥，如道諾黴素；糖肽類，如萬古黴素。
有可能利用基因工程，如利用與所需DNA序列特異結合的基因探針，直接從基因組中分離某些基因。這樣，有可能從大量未知序列中「釣」出要分離的基因。
在放線菌，特別是鏈黴菌中，進而得知在迄今所研究的次級代謝物生產菌中，生物合成基因並排地、成簇地排列在染色體上，而較少在質粒上[Martin，J.F.，J.Ind.Microbiol.9，73-90(1992)；Chater，K.F.，Ciba Found.Symp.，171(Secondary MetabolitesTheir Function andEvolution)144-62(1992)]。因此有可能通過用基因探針來「釣」，分離相鄰的、至今未知的生物合成基因，從而能夠闡明這些未知的生物合成基因在所需的生物合成過程中的重要性。
分子生物學技術相應的應用迄今還未能在遊動放線菌科獲得成功，也未期望能在這種遺傳學上未鑑定的微生物中獲得成功。
今人驚訝的是，現已發現一來源於已知dTDP-葡萄糖脫水酶的高度保守蛋白質區域的基因探針，適用於在遊動放線菌屬中尋找acbA基因(編碼dTDP-葡萄糖合酶)和acbB基因(編碼dTDP-葡萄糖脫水酶)。更今人驚訝的是，發現了以acbC形式存在的另一基因，此基因與acbB基因相鄰，編碼一種環化酶(與AroB即細菌3-脫氫奎尼酸合酶部分相同)，因此與不飽和環多醇(Valienamines)的生物合成有關。
本發明涉及acbB的完整DNA序列和acbA及acbC的部分DNA序列。
acbB的完整胺基酸序列和acbA及acbC的部分胺基酸序列。
從放線菌，特別是從遊動放線菌屬中分離次級代謝產物生物合成基因的方法，其特徵是將來源於已知dTDP-葡萄糖脫水酶的高度保守蛋白質區域的基因探針用於尋找acbA基因(編碼dTDP-葡萄糖合酶)、acbB基因(編碼dTDP-葡萄糖脫水酶)和acbC基因(編碼一種環化酶，此環化酶與AroB即細菌3-脫氫奎尼酸合酶部分相同)，或者來源於遊動放線菌屬的一個或更多個阿卡布糖生物合成基因。
放線菌中與阿卡布糖相關的天然物質(如有效黴素、Oligostatins(trestatins)、脂解素)的生物合成基因的分離方法。
通過以下途徑提高遊動放線菌屬的阿卡布糖合成產量，即增加基因劑量或使用更有效的啟動子，或者通過基因操作(如調節基因蛋白表達或調節基因識別位點的基因操作)來改變調節控制。
在一些限制阿卡布糖合成的生物合成步驟(瓶頸酶)中進行蛋白質工程，或通過蛋白質工程防止額外組份的生成，從而增加阿卡布糖合成產量。通過消除不需要的額外組份的生物合成途徑或不需要的酶降解反應，將遊動放線菌屬的產物範圍限制在所需的主要產物。
為了在遊動放線菌屬中提高阿卡布糖生產能力，改變調控，因此改變營養需要。
在異源宿主菌株(如變鉛青鏈黴菌和其它鏈黴菌、快速生長細菌如大腸桿菌、枯草桿菌或穀氨酸棒桿菌、或酵母)中表達，以便通過改進空間-時間產率來增加產量；建立簡化的純化方法；達到產物範圍的特殊限制。
利用阿卡布糖生物合成基因，由合成的或微生物生產的前體開始，進行阿卡布糖或此類物質的體外合成。
下面詳細描述本發明。
所有的基因工程方法，除非另有說明，一律按照J.Sambrook et al.圖2是用作為用於分離阿卡布糖生物合成基因的基因探針(acb探針)的、含有已知的dTDP-葡萄糖脫水酶序列的質粒pAS1的示意圖。
圖3是含有與acb探針雜交的遊動放線菌屬DNA的2.2kb BamHI片段的質粒pAS2的示意圖。
圖4是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構建的、含有來自pAS2的1.3kb Pst I/Bam HI片段的質粒pAS 2/1的示意圖。
圖5是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構建的、含有來自pAS2的1.6kb Sph I/Bam HI片段的質粒pAS 2/2的示意圖。
圖6是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構建的、含有來自pAS2的0.9kb Pst I片段的質粒pAS 2/3的示意圖。
圖7是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構建的、含有來自pAS2的0.6kb SphI片段的質粒pAS 2/4的示意圖。
圖8是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構建的、含有來自pAS2的0.8kb Hinc II/Hind III片段的質粒pAS 2/5的示意圖。
圖9是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構建的、含有來自pAS2的0.65kb Xho I/Sal I片段的質粒pAS 2/6的示意圖。


圖10是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構建的、含有來自pAS2的0.5kb Xho I/Sal I片段的質粒pAS 2/7的示意圖。
圖11是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構建的、含有來自pAS2/3的0.28kb Hinc II片段的質粒pAS 2/8的示意圖。
圖12是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構建的、含有來自pAS2/1的0.7kb Xho I/Bcl I片段的質粒pAS 2/9的示意圖。
圖13是為2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所構建的、含有來自pAS2的0.3kb Sst I/Bcl I片段的質粒pAS 2/10的示意圖。
圖14是2.2kb Bam HI片段的DNA序列以及基因acbA、B、C的胺基酸序列的示意圖。
下面詳細描述本發明。
所有的基因工程方法，除非另有說明，一律按照J.Sambrook et al.(Molecular CloningA Laboratory manual；2nd edition，1989；Cold SpringHarbor Laboratory Press，N.Y.，U.S A.)進行操作。
使用寡核苷酸引物(見表1)，用PCR(聚合酶鏈反應)技術從遊動放線菌屬SE 50/110中獲得篩選用的基因探針，寡核苷酸引物來源於已知dTDP-葡萄糖脫水酶的高度保守蛋白質區域。將擴增後的遊動放線菌屬SE 50/110 DNA片段克隆於pUC18中，轉化到大腸桿菌DH5α(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)中。產生的質粒(pAS1，見圖2)用煮沸法或鹼溶解法從大腸桿菌中分離(Sambrook et al.，1989)。
來自大腸桿菌DH5α的質粒pAS1用限制酶EcoR I和HindIII水解。分離0.3lkb的EcoR I/Hind III片段，並通過所謂的缺口翻譯法用32P標記的脫氧核苷酸標記。這個放謝性標記的片段作為基因探針用於分離阿卡布糖生物合成基因，該片段在下文中稱為acb探針。
阿卡布糖生物合成基因按以下步驟分離。來自遊動放線菌屬的染色體DNA用不同的限制酶(SstI、Bgl II和BamH I)切割，經過凝膠層析，用acb探針通過Southern雜交研究同源基因。與基因探針雜交的DNA限制片段的大小如下10kb(Sst I)、9-10kb(Bgl II)和2.2kb(BamH I)。將與acb探針雜交的不同的DNA片段從凝膠上洗脫下來，連接到載體pUC18上，克隆於大腸桿菌DH5α中。
優選對2.2kb BamH I DNA片段進行克隆及序列分析。通過併集物雜交(pool hybridization)識別含有與acb探針雜交的遊動放線菌屬DNA的大腸桿菌DH5α克隆(見實施例7)。從陽性克隆中分離質粒DNA，用Southem雜交證實併集物雜交的結果。所得的質粒(見圖3)用不同的限制性核酸內切酶進行切割。產生的DNA片段亞克隆到大腸桿菌DH5α的pUC18中，進行再連接和序列分析。
為了確定遊動放線菌屬的2.2kb BamH I片段的DNA序列，構建下列質粒(實施例7)，分析插入DNA的序列(見圖1、14)pAS 2/1＝來自pAS2的1.3kb Pst I/BamH I片段(圖4)pAS 2/2＝來自pAS2的1.6kb Sph I/BamH I片段(圖5)pAS 2/3＝來自pAS2的0.9kb Pst I/片段(圖6)pAS 2/4＝來自pAS2的0.6kb Sph I/片段(圖7)pAS2/5＝來自pAS2/1的0.8kb Hinc II/Hind III片段(圖8)pAS 2/6＝來自pAS2的0.65kb Xho I/Sal I片段(圖9)pAS 2/7＝來自pAS2的0.5kb Xho I/Sal I片段(圖1 0)pAS 2/8＝來自pAS2/3的0.28kb Hinc II片段(圖11)pAS 2/9＝來自pAS2/1的0.7kbXho I/Bcl I片段(圖12)pAS 2/10＝來自pAS2的0.3kbSst I/Bcl I片段(圖13)用F.Sanger等人(1977)的方法或由其衍生出的方法進行DNA序列分析。將自讀序列分析試劑盒(Pharmacia，Freiburg，Germany)連同自動雷射螢光(ALF)DNA序列分析儀(Pharmacia，Freiburg，Germany)一起使用。購買合適的螢光素標記的pUC反向序列分析引物及序列分析引物(Pharmacia，Freiburg，Germany，見表1)。PCR引物引物名稱 序列AS2 5』GCCGCCGAATCCCATGTGGAC3』AS5 5』CCCGTAGTTGTTGGAGCAGCGGGT3』序列分析反應引物引物名稱序列通用引物5』GTAAAACGACGGCCAGT3』反向引物5』GAAACAGCTATGACCATG3』
實施例實施例1大腸桿菌菌株的培養，質粒DNA的製備和分離將大腸桿菌DH5α在LB培養基中在37℃下培養。在選擇壓(氨苄青黴素，100μg/ml)下保持攜有質粒的細菌。培養在迴旋式搖床上以270轉/分進行。至少培養16小時的混合物稱為過夜培養物(OC)。
1.5ml在選擇壓下培養的過夜培養物細胞用於製備質粒DNA。用鹼性SDS溶解法分離質粒(Birnboim Doly，1979)。
按照製造商的說明(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)，用專一性限制性核酸內切酶對載體DNA進行特異性水解。用5U特定的限制性核酸內切酶來限制10μg質粒DNA，37℃下保溫2小時。為了確保完全水解，再次加入等量的限制性核酸內切酶，再保溫至少1小時。
切割後的DNA，根據DNA片段的大小，在0.5-1.2％水平瓊脂糖凝膠上電泳。為進行洗脫，用無菌解剖刀切下含有DNA片段的凝膠塊並稱重。用JETsorb試劑盒按說明(Genomed，BadOeynhausen，Germany)從瓊脂糖上洗脫出DNA片段。
實施例2遊動放線菌屬的培養，染色體DNA的製備、切割和凝膠電泳將遊動放線菌屬SE 50/110在TSB培養基中，在迴旋式搖床上，於30℃下培養3天。預培養(5ml)在培養管內於240轉/分下進行。在500ml帶隔板培養瓶中以100轉/分進行主培養(50ml)。培養後，離心沉降細胞，用TE緩衝液洗滌兩次。
用1.5-2mg細胞(鮮重)以苯酚/氯仿抽提法製備完整的DNA(D.A.Hopwood et al.，1985)。
20μg染色體DNA用10U適當的限制酶(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)在相應的緩衝液中於37℃水解2小時。為了確保完全水解，再加入等量的限制性核酸內切酶，重新保溫至少1小時。
切割後的DNA在0.7％水平瓊脂糖凝膠上電泳。
再次用JETsorb試劑盒洗脫出DNA片段(見實施例1)。
實施例3acb基因探針的製備按實施例1由pAS1製備的片段按製造商的說明，用GibcoBRL，Eggenstein，Germanv生產的缺口翻譯系統進行放射性標記。用0.5-1.0μg的DNA片段和[α-32P]dCTP(3000 Ci/mmol；Amersham，Braunschweig，Germany)。然後將混合物煮沸10分鐘(變性)，立即加入雜交溶液中(見實施例4)。
實施例4將DNA轉移至膜上，DNA雜交(Southem雜交)及放射自顯影用Southern轉移法將DNA片段從瓊脂糖凝膠轉移到濾膜上(Southern，E.M.，1975)。按實施例2獲得的瓊脂糖凝膠在0.25M HCl中搖動20分鐘。將凝膠置於3層Whatman 3MM吸水紙(Whatman，maidstone，England)上，將一張HybondTM-N+膜(Amersham，Braunshweig，Germany)放在凝膠上，去掉氣泡。將幾層吸水紙置於其上。將一個重約1kg的重物置於這疊濾紙上。通過將DNA吸入0.4M NaOH中轉移DNA。轉移至少12小時後，尼龍濾膜用2xSSC衝洗5分鐘並風乾。
將尼龍濾膜置於50-100ml預雜交溶液中，於68℃下在水浴中搖動至少2小時。在此期間，至少換兩次溶液。雜交在雜交盒中進行至少12小時。使用15ml含acb探針(見實施例3)的雜交溶液。
然後，尼龍濾膜用6×後洗液和1×後洗液各洗15分鐘。當尼龍濾膜還潮溼時，用膠紙蓋住尼龍濾膜。在帶有增感屏的暗盒中，用Hyperfilm MP(Amersham，Braunshweig，Germany)於-80℃下進行放射自顯影至少16小時。
實施例5從遊動放線菌屬完整的DNA中分離和克隆BamH I片段來自遊動放線菌屬SE50/110的染色體DNA用BamH I完全水解，經瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖上洗脫出長度為1.5-3kb的DNA片段。載體質粒pUC18由大腸桿菌DH5α製備，載體質粒用BamH I水解，並按製造商說明用鹼性磷酸酶(Boehringer，Mannheim，Germany)處理。取0.01-0.1μg DNA，按片段與載體之比為3∶1，混合物體積為20μl進行連接。使用1U T4 DNA連接酶及合適的緩衝液(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)。用完全連接混合物轉化大腸桿菌DH5α轉化感受態細胞(如Hanahan 1983所述)。將氨苄青黴素抗性轉化株轉移到LB-Amp選擇平板上(100μg/ml)。
實施例6鑑別含有dTDP-D-葡萄糖合酶基因的克隆研究青黴素抗性轉化株中是否含有dTDP-D-葡萄糖合酶基因。每種情況下都是從這些克隆中取10個克隆在選擇平板上劃線，將它們培養過夜，用3ml LB培養基從平板上洗下。從20個這樣的10克隆併集物中分離質粒DNA(如Bimboim Doly，1979所述)。用限制性核酸內切酶EcoR I和Hind III水解這20個不同的質粒製備物，以從多聚接頭上去掉克隆的BamH I片段。然後將限制混合物在0.8％瓊脂糖凝膠上進行電泳。用Southem轉移法將DNA從瓊脂糖凝膠上轉移至尼龍濾膜上(見實施例4)。再次與acb探針雜交(見實施例4)。這些併集物中的一個與acb探針有陽性反應，將這個併集物分成10個單獨的克隆。同樣分離出這些克隆的質粒，並進行上述操作。雜交質粒被稱為pAS2，它含有一個2.2kb的BamHI片段。
實施例7質粒pAS2的亞克隆由質粒pAS2開始，產生幾個亞克隆，以便闡明雙鏈DNA的序列(圖1；圖4-13)。pAS2/1和pAS2/3質粒pAS2用Pst 1水解，在1％瓊脂糖凝膠上分離限制混合物。從瓊脂糖凝膠上洗脫出水解產生的0.9kb Pst I片段和帶有餘下的1.3kb Pst I/BamH I片段的質粒條帶(JETsorb試劑盒；Genomed，Bad Oeynhausen，Germany)。
重新連接帶有1.3kb Pst I/BamH I片段的質粒，得到亞克隆pAS 2/1。將0.9kb Pst I片段克隆到載體pUC18(用Pst I水解)中，產生亞克隆pAS 2/3。pAS 2/2和pAS 2/4質粒pAS2用Sph I水解。重新連接帶有1.6kb Sph I/BamH I片段的質粒，得到亞克隆pAS 2/2。將0.6kb Sph I片段克隆到pUC18(用Sph I水解)中，產生亞克隆pAS 2/4。pAS 2/5
質粒pAS 2/1用Hinc II/Hind III水解。將產生的0.8kb片段克隆到pUC18(用Hind III/Hinc II水解)中，產生亞克隆pAS 2/5。pAS 2/6質粒pAS2用Xho I/Sal I水解。將產生的0.65kb片段克隆到pUC18(用Sal I水解)中，產生亞克隆pAS 2/6。pAS 2/7質粒pAS2用Xho I/Sal I水解。將產生的0.5kb片段克隆到pUC18(用Sal I水解)中，產生亞克隆pAS 2/7。pAS 2/8質粒pAS 2/3用Hinc II水解。將產生的0.3kb片段克隆到pUC18(用Hinc II水解)中，產生亞克隆pAS 2/8。pAS 2/9質粒pAS 2/1用Xho I/Bcl I水解。將產生的0.7kb片段克隆到pUC18(用Sal I/BamH I水解)中，產生亞克隆pAS 2/9。PAS 2/10質粒pAS2用Sst I/Bcl I水解。將產生的0.3kb片段克隆到pUC18(用Sst I/BamH I水解)中，產生亞克隆pAS 2/10。
實施例8遊動放線菌屬2.2kb BamH I片段的DNA序列分析對實施例7描述的質粒進行序列分析。來自一個製備物(見實施例1)的6-8μg質粒DNA用於序列分析反應。用自讀序列分析試劑盒(Pharmacia，Freiburg，Germany)進行序列分析反應。在這裡使用對雙鏈DNA進行序列分析的標準操作程序。為能使用A.L.F.(自動雷射螢光(DNA)序列分析儀)來分析核苷酸序列，將螢光素標記的通用序列引物和反向序列引物用作序列分析反應的起始分子(見表1)。為製備凝膠，將8ml Hydro Link Long Ranger(Serva，Heidelberg，Germany)，33.6g尿素、8ml10×TBE緩衝液，加水至80ml混合，過濾滅菌，抽氣1分鐘。加入350μl 10％(W/V)過硫酸銨和40μl N，N，N』，N』-四甲基乙二胺引發聚合反應。將溶液倒入凝膠模(50×50×0.05cm)中。在38w，45℃恆溫下電泳。用1×TBE緩衝液作電泳緩衝液。在一臺聯機計算機(Compaq 386/20e)上將所測得的螢光信號轉化成DNA序列。這臺聯機計算機也用來控制電泳儀(Program A.L.F.Manger 2.5；Pharmacia)。緩衝液與溶液培養細菌用的培養基LB培養基胰蛋白腖10gNaCl10g酵母抽提物 5g水 加至1000ml用4M NaOH調pH至7.5TSB培養基胰蛋白腖大豆肉湯(Oxoid) 30g水 加至1000mlTE緩衝液(pH8.0)Tris-HCl10mMNa2EDTA1mM質粒DNA的標準製備(Birnboim Doly 1979方法的修改方法)混合物I50mM葡萄糖50mM Tris-HCl(pH8.0)
10mM EDTA(pH 8.0)5mg/ml溶菌酶混合物II200mM NaOH1％(w/v)SDS(十二烷基硫酸鈉)混合物III3M醋酸鉀1.8M甲酸鹽DNA-DNA雜交20XSSC3M NaCl0.3M檸檬酸鈉pH7.2預雜交溶液6XSSC0.01M磷酸鈉緩衝液pH6.81mM EDTA0.5％SDS0.1％脫脂奶粉雜交溶液在標記反應後，將acb探針加入到15ml預雜交溶液中。6X後洗液6XSSC0.5％SDSDNA序列分析TBE緩衝液(pH8.0)
1M Tris鹼0.83M硼酸10mM EDTA參考文獻1.Bimboim H.C.Doly J.(1979)A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinantplasmid DNANucleic Acids Res.，7，1513-15232.Hanahan D.(1983)Studies on transformation of Escherichia coli with plasmidsJ.Mol.Biol.166，557-5803.HopWood DA.et al.，(1985)Genetic manipulation of Streptomyces；A laboratory manual；The John Innes Foundation，Norwich，England4.Sanger F.；Nicklen S.；Coulson A.R.(1977)DNA sequencing with chain-terminating inhibitorsProc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463-54675.Southem E.M.，(1975)Detection of specific sequences among DNA Fragmentsseparated by gel electrophoresisJ.Mol.Biol.，98，503-521
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱BayerAG(B)街道B ayerwerk(C)城市Leverkusen(E)國家德國(F)郵政編碼51368(G)電話0214-3061455(H)傳真021 4-303482(ii)發明名稱阿卡布糖基因(iii)序列數；1(iv)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，Version#1.30B(EPA)(2)1號序列信息(i)序列特徵(A)長度2219個鹼基對(B)類型核苷酸(C)股數雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體遊動放線菌屬SE 50/110(xi)序列描述1號序列GGATCCGGGA GTACTTCACC CATCACGGCA TCGATCATTC GATCCTGGTG ATGCGGGTGG 60GCGAGACGGT CAAGGACTTC GACACGGCGG GCCGCATCGT CGCCGCGATG GACGCCTTCG 120GACTGGCCCG CCGCCGGGAG CCGATGATCG TCGTCGGTGG TGGGGTGCTG ATGGACGTGG 180CCGGTCTGGT GGCCAGCCTC TACCGGGCGC GGCACGCCGT TCTGCGGGTG CCGACGACAC 240TGGTCGGACT GATCGACGCG GTGTCGCGCG AAGACCGGGT CAACTTCAAC GGCCACAAGG 300AACCGGCTGG GTACGTACGC CCGGCTGATC TGACCCTGCT GGACCGCCGC TTCCTGGCCA 360CCCTGGACCG GCGCCACCTC AGCAACGGGC TCGCCGAGAT GCTCAAGATC GCGCTGATCA 420AGGATGCCGA GCTGTTCCAG CTGCTGGAGC GGCACGGGCG GGTCCTGATC GAGGAACGGT 480TCCAGGGCGT ACCGGAACCG GTGACCGGGC CGCCGTCCGG GCCCTGCGCG CGCCACCCAT 540GGCATGCTGG AGGAACTCGG CCCAATCTGT GGGAGAGCCG GCTGGAACGC AGTGTCGACT 600ACGGGCACAC GTTCAGCCCG ACCATCGAGA TGCGCGCGCT GCCGGCTCTG CTGCACGGCG 660AGGCCGTGTG TGTGGACATG GCGCTGACCA CGGTGCTGGC GTACCGGCGG GGTCTGCTCG 720ACGTCGCGCA GCGGGACCGG ATCTTCGCGG TGATGACCGC CCTGGGCCTG CCGACCGGCA 780TCCGCCTGCT CACGCCGGAG GTGCTGGAGG CGGCGTTGCA GGACACCGTC CGGCACCGGG 840ACGGGTGGCA GCGGCTGCCA CTGCCGGTGG GGATCGGGGG TGTCACGTTC GTCAACGACG 900TGACGGCCGC CGAGCTGCAG CCGCCGCGCT GATGCAGCAC CGGCTCGCCG AGGACGCCCT 960GCTGCTGCGC GCCCTAGCTC GGGCCGCGGA CGCCGATCGC CGGAAGCGAC CGGCGTCCGT 1020CCGCCCACCG GTTGCCGTCA GTCCACCAGG AACGGTTGGC GCGATACCAC GCGACCGTTT 1080CCGCGATGCC GTCGGTGAAA TCGACCCGCG GCCGGTAACC GAGTTCCCCG GCGATTTTCG 1140AATAGTCGAG AGAATAGCGC CGGTCGTGAC CTTTGCGATC GGTCACGAAA GATATGCGCG 1200AACGCCGGGC GCCGCACGCC TCGAGGAGGA TCTCGGTCAA TTCGAGATTC GTCGCCTCCC 1260ACCCACCGCC GATGTGATAG ACCTCGCCTG CCCGGCCGGC ACCCAGGGCC AGGGCGAGAC 1320CGCGGCAATG GTCGCTGACG TGGAGCCAGT CGCGGATGTT GCGGCCGTCG CCGTAGACCG 1380GTACGTCGAG CCCGTCGAGC AGCCTGGTGA CGAACAGCGG AATCATTTTC TCCGGGAATT 1440GCCGGGGCCC GTAGTTGTTG GAGCAGCGGG TCACCACGAC GTCCATCCCG TGCGTCTGGT 1500GGTAGGCCAG AGCGAGGAGG TCGGACCCGG CTTTGCTCGC GGCGTACGGC GAGTTGGGCG 1560CCAGCGGATG GCCCTCGGCC CACGAGCCGG TGTCGATCGA CCCGTACACC TCGTCGGTGG 1620AAACATGCAG GAAGCGGCCG ATATGGTGGC GTAGCGCGGC GTCCAGTAGC ACCTGAGTGC 1680CGACCAGGTT GCTGGCCACG AAGGGGCCGG AGGCGACCAC CGAGCGGTCG ACGTGGGTCT 1740CGGCGGCGAA GTGCGCCACG GTGTCGTGCC GCGCCATCAG CCCCTCGATT AGACCTTCGT 1800CACAGATGTC GCCCCGAACG AAGCTGAAAC GAGGGTCCGC CGACGCTTCG GCGAGATTTC 1860TGAGATTGCC TCCGTAACCC AGTTTGTCGA CGACCGTAAC CTGCGTCACG GGTTGTGGTG 1920TGGCAATGTC GCCACTGATC AGGGAAGTTA CAAAATGGGA CCCGATAAAG CCGGCTCCGC 1980CGGTGACCAA GATTTTCATC GCCGGGATTG TAGCAATGCC GCCAATGGGT GCCCGATGTT 2040CGGCCGAGCC ATTTACGGGG CTTGCTGATA TGGTCGGTCA CGTGCGCGGA ATATTGCTGG 2100CCGGGGGAAC CGGCTCACGG CTTCGACCGG TGACCTGGGC GGTTTCCAAA CAACTGATGC 2160CGGTCTATGA CAAACCGATG ATCTACTATC CGCTGGCCAC GCTCGTCAGC TGCGGATCC 2219
權利要求
1.具有1號序列的DNA序列。
2.權利要求1的DNA，其特徵在於它含有編碼dTDP-葡萄糖合酶的完整acbA DNA序列和acbB(編碼dTDP-葡萄糖脫水酶)和acbC(編碼一種環化酶)的部分DNA序列。
3.權利要求2的DNA的功能變異體。
4.含有權利要求1-3的DNA的載體。
5.用權利要求4的載體轉化的微生物。
6.具有1號序列的胺基酸序列。
7.權利要求6的胺基酸序列的功能變異體和突變體。
8.含有權利要求6和7的胺基酸序列或其部分的蛋白質。
9.分離一個或多個來自放線菌的阿卡布糖生物合成基因的方法，其特徵在於用來源於已知dTDP-葡萄糖脫水酶的高度保守蛋白質區域的寡核苷酸引物作為基因探針，與阿卡布糖生物合成基因雜交。
10.製備阿卡布糖的方法，其特徵在於培養權利要求5的微生物，從液體培養基中分離阿卡布糖。
11.按照權利要求2獲得的基因在鑑定其他阿卡布糖結構基因和調節基因中的應用。
12.按照權利要求2和11獲得的基因在通過增加基因劑量，或使用更有效的啟動子或通過基因操作(如對調節基因蛋白表達或調節基因識別位點的基因操作)改變調控作用來提高阿卡布糖合成產量的應用。
13.按權利要求2和11獲得的基因在分離與阿卡布糖相關的天然物質的生物合成基因中的應用。
14.按權利要求2和11獲得的基因在通過蛋白質工程修飾生物合成酶中的應用。
15.按權利要求2和11獲得的基因在消除不需要的阿卡布糖額外組份生物合成途徑中的應用。
16.按權利要求2和11獲得的基因在消除不需要的阿卡布糖酶降解反應中的應用。
17.按權利要求2和11獲得的基因在獲得生物合成酶中的應用及在由合成的或由微生物製備的前體合成阿卡布糖或此類化合物中的應用。
全文摘要
本發明涉及放線菌，主要是遊動放線菌屬SE50/110及其突變株的阿卡布糖生物合成基因；涉及放線菌阿卡布糖生物合成基因的分離方法，即利用來源於已知dTDP-葡萄糖脫水酶的高度保守蛋白質區域的基因探針，尋找acbA基因(編碼dTDP-葡萄糖合酶)、acbB基因(編碼dTDP-葡萄糖脫水酶)和acbC基因(編碼一種環化酶，此環化酶與AroB即細菌-3脫氫奎尼酸合酶部分相同)或者一個或多個遊動放線菌屬阿卡布糖生物合成基因；還涉及阿卡布糖生物合成基因的應用。
文檔編號C12N15/60GK1144271SQ96102718
公開日1997年3月5日 申請日期1996年3月1日 優先權日1995年3月2日
發明者A·克呂格, W·皮帕斯堡, J·迪斯勒, A·施特拉曼 申請人:拜爾公司