吉他黴素的免疫膠體金檢測卡及其製備方法與流程
2023-12-05 20:15:51
本發明可有效用於測定抗生素吉他黴素，方法簡單，方便，快捷，結果準確。
背景技術：
：吉他黴素(kitasamycin)又稱柱晶白黴素,是由北裡鏈黴菌(Streptomyceskitasatoensis)產生的一種多組分大環內酯類抗生素,含有A1、A3、A4、A5等9種A族和4種B族組分。對多數革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌及黴形體均有較強抗菌活性[3],用於防治畜禽細菌感染和黴形體病等以及用作促生長劑。吉他黴素具有強苦味,能影響動物適口性且對胃有刺激作用,其鹼性特點使其在胃酸性環境時(pH≤5.5)降解而活性降低,為避免以上缺點已成功研製吉他黴素微囊製劑(腸溶材料包被)。但其在動物源性食品中的殘留給人類健康帶來極大隱患。因此，殘留檢測刻不容緩。技術實現要素：針對以上情況，本發明的目的就是為了克服現有技術的缺陷，而提供一種吉他黴素的免疫膠體金檢測卡及其製備方法，可有效解決能快速有效的檢測出抗生素吉他黴素的問題。本發明的吉他黴素的膠體金的檢測卡包括單克隆抗體膠體金標記物的膠體金結合墊、包被了吉他黴素-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。本發明的吉他黴素膠體金檢測卡的製備方法由以下步驟實現：（1）膠體金溶液製備：取1L三角燒瓶2個，加入超純水495mL，而後加入1%氯金酸5ml，製成500ml0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸後在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉溶液5-7ml，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5min後停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8℃保存備用；（2）抗體的預處理：將要標記的吉他黴素抗體在1000r/min，4℃條件下，離心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀釋成lmg/ml；或者0.01mol/L,PBS稀釋成lmg/ml，過0.22um濾膜；（3）膠體金標記物的製備：取步驟（1）中的膠體溶液40mL，用0.25mol／LK2C03,，調節膠體金溶液PH至8.5，電磁攪拌器250r／min攪拌。逐滴加入4ml含0.3mg抗體蛋白的蛋白溶液。反應10min；逐滴加入4mLl0％BSA，繼續攪拌反應10min；金標抗體溶液常溫1500r/min離心10min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉澱；紅色上清溶液4℃，12000r/min離心20min，棄上清，收集沉澱定，將沉澱用金標抗體稀釋液定容至1mL，製備成吉他黴素單克隆抗體膠體金標記物：（4）膠體金膜的製備：將步驟（3）吉他黴素單克隆抗土膠體金標記物用劃膜儀以5/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維膜上，室溫自然晾乾或者37℃烘乾3h，製成含吉他黴素單克隆抗土膠體金標記物的膠體金膜；（5）包被膜製備：將羊抗鼠IgG抗體吉他黴素蛋白質偶聯物稀釋成1mg/mL,用劃膜儀依次以1/cm的濃度噴塗在硝酸纖維膜上，製備成包被膜，37℃包被2h後，室溫自然晾乾或者37℃烘乾；（6）樣品墊前處理；將樣品墊前處理液均勻塗布在玻璃纖維素膜上，在空氣溼度低於60%的條件下，室溫自然晾乾；（7）檢測卡的組裝：PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊，膠體金膜，包被膜和吸水墊，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。所述的吉他黴素膠體金檢測卡，起特徵在於所述步驟（5）中所包被的檢測線T設在質控線C的下方。所述步驟（6）中樣品墊處理液是由1g小牛血清（BSA）和0.8g氯化鈉（NaCl）,用含有0.5%TRITON-100的0.01mol/LPBS定容至100mL。附圖說明圖1為本發明吉他黴素的免疫膠體金檢測卡的結構圖：圖1.加樣孔2.檢測線3.質控線4.檢測孔5.試紙條6.檢測卡外殼；圖2為發明吉他黴素的免疫膠體金檢測卡內的試紙條的剖視結構圖，圖中7.樣品墊8.膠體金結合墊9.PVC膠體10.硝酸纖維素膜11.吸水墊。具體實施方式實施例1圖1為本發明吉他黴素的免疫膠體金檢測卡的結構圖，圖2為本發明吉他黴素的免疫膠體金檢測卡內的試紙條剖視結構圖：圖中9為PVC膠板；7為樣品墊；8為膠體金結合墊，該膠體金結合墊上包被了單克隆抗土膠體金標記物；10為包被膜，即硝酸纖維素膜，該硝酸纖維膜上包被了吉他黴素-BSA和羊抗鼠IgG；11為吸水墊，由吸水材料如濾紙製成。在PVC膠板9的另一端上（樣品端）粘附樣品墊7、膠體金結合墊8，樣品墊7和膠體金結合墊8為並排結構。在PVC膠體9的中間粘附硝酸纖維素膜10在硝酸纖維素膜上設置有羊抗鼠IgG質控線3和吉他黴素-BSA檢測線2。在PVC膠板9的另一端粘附吸水墊11。硝酸纖維索膜10的一端與結合墊8略交叉，另一端與吸水墊11略交叉。該試紙條5可裝入有塑料模具製成的檢測卡外殼6中，在檢測卡外殼6的上蓋設有加樣孔1和檢測孔4，樣品墊7正對加樣孔1，硝酸纖維素膜10正對檢測孔4。實例2吉他黴素膠體金檢測卡製備，是由以下步驟具體實現：（1）膠休金溶液製備：取1L三角燒瓶1個，加入超純水495mL，而後加入1％氯金酸5mL，配製成500mL0.01％氯金酸水溶液，加熱煮沸後在持續攪拌的情況下加入1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7mL，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5min後停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8℃保存備用；（2）抗體的預處理：將要標記的吉他黴素抗體在1000r/min，4℃條件下，離心20min,取上清，用0.01mol/LPBS稀釋成1mg/mL；或者用0.0lmol/LPBS稀釋成1mg/mL，過0.22um濾膜；（3）膠體金標記物的製備：取步驟(1)中的膠體金溶液40mL，用0.25mol/LK2C03,調節膠體會溶液PH至8.5，電磁攪拌器250r／min攪拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應10min：逐滴加入4mL10％BSA，繼續攪拌反應10min：金標抗體溶液常溫低速（1500r/min）離心10min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉澱：紅色上清溶液4℃，12000r/min離心20min，棄上清，收集沉澱，將沉澱用金標抗體稀釋液定容至1mL，製備成吉他黴素單克降抗體膠體金標記物；（4）膠體金膜的製備：將步驟(3)吉他黴素單克降抗體膠體會標記物用劃膜儀以5μL／cm濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾乾或37℃烘乾3h，製成含吉他黴素克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜：（5）包被膜製備：將羊抗鼠IgG抗體、吉他黴素蛋白質偶聯物稀釋成1mg/ml，用劃膜儀依次以1μL／cm的濃度噴塗在硝酸纖維素膜上，製備成包被膜，37℃包被2h後，室溫自然晾乾或37℃烘乾；（6）樣品墊前處理：將樣品墊處理液均勻塗布在玻璃纖維素膜上，在空氣溼度低於60％的條件下，室溫自然晾乾；（7）檢測卡的組裝：PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。實施例3吉他黴素最低檢出限量試驗準確稱量0.500g吉他黴素標準品溶於超純水並定容至100mL，標為A1溶液，取上A1溶液lmL於容量瓶加超純水並定容至1000mL，形成A2溶液，取A2溶液1mL於容量瓶加超純水定容至1000mL，形成A3溶液，則A3溶液的濃度為5ng/mL(5ppb)。取A3溶液1mL於4支試管中，並分別標號1~4，往試管中分別加入往9mL、4mL、1ml、0ml，超純水，配成A吉他黴素標準品溶液溶度分別是：0.5ng/mL.1ng/mL.2.5ng/mL、5ng/mL；另取一支空試管，加入5mL超純水，標為5號試管。取上述1~5號試管中液體作為樣品滴加到吉他黴素檢測卡上，加樣後5min觀察結果，檢測線2和質控線3的顯色結果見表1。表1吉他黴素最低檢出限量試驗試管編號吉他黴素溶液濃度（ng/mL）測定結果10.5檢測線T顯色比質控線C略淡21檢測線T顯色稍淡32.5檢測線T顯色較淡35檢測線T不顯色50檢測線T與質控線顯色基本相同經多次檢驗，吉他黴素的檢出率達99%，最低檢出限量為5ng/mL。當前第1頁1 2 3