免疫親和沉澱法純化抗體的製作方法

2023-12-05 08:20:01 1

專利名稱：免疫親和沉澱法純化抗體的製作方法
技術領域：
本發明是一種免疫化學方面的抗體純化新方法，主要涉及免疫化學的研究和醫藥衛生的生產領域。
背景技術：
在許多免疫化學的研究和醫藥衛生的生產過程中，常常需要免疫親和層析級別的純化抗體。為了得到親和力好、特異性強、純度高的抗體，現在常用的純化方法是免疫親和層析法。免疫親和層析法的過程是一般情況下，先用偶聯劑溴化氰(CNBr，有劇毒，操作時需要防護)將抗原連接到固相載體一瓊脂糖凝膠(S^harose 4B或6B)上作為免疫吸附齊U，然後將免疫吸附劑裝入層析柱中，用淋洗液洗去未被連接的抗原和連接劑後，即可上樣待純化的抗體混合物，當混合物中的抗體與免疫吸附劑上連接的抗原靠近時，抗原抗體會產生特異性結合，形成抗體-免疫吸附劑結合物，從而將需要純化的抗體暫時地特異固定·在免疫吸附劑上，混合液中的其他組份則游離在液相中，充分反應後，淋洗除去未結合的其他混合物，淋洗完的層析柱上只留下單一的抗體-免疫吸附劑結合物，最後，再通過改變PH值，解離抗原和抗體的結合，從而洗脫下親和力好、特異性強、純度高的抗體。免疫親和層析法用於純化抗體時存在的缺點①製備免疫吸附劑時，要使用偶聯劑溴化氰，該化合物有劇毒，操作時要特殊防護；②經活化的瓊脂糖凝膠比較昂貴，生產製備時購置成本高。

發明內容
本發明採用免疫親和沉澱法純化抗體首先，採用以丙烯醯胺和丙烯酸為單體的共聚物固相微球(該微球是圓球狀，直徑為2 5μπι，可懸浮於水溶液中)作為固相載體，這種固相載體上含有羧基(-C00H)，將含有氨基(-NH2)的抗原與固相載體混合，再加入偶聯劑——I-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)，室溫震蕩反應過夜，EDC能使羧基和氨基脫水形成醯胺鍵，從而將抗原連接到固相載體上，形成了抗原-固相載體的免疫吸附劑。通過離心洗滌，除去未被連接上的抗原和其他混合物後，得到單一的免疫吸附齊U。然後，將待純化的抗體原液與免疫吸附劑混合，2 8°C放置過夜，抗原抗體產生特異性結合，形成抗體-免疫吸附劑結合物，通過離心洗滌，除去未結合的其他混合物，得到單一的抗體-免疫吸附劑結合物，再降低體系中的PH值，則抗體就會被解離到溶液中，通過離心分離上清後立即用鹼性溶液調整上清液的PH值到中性，此上清經透析後即為純化的抗體溶液。免疫吸附劑通過離心洗滌後懸浮於免疫吸附劑保存液中，2 8°C放置，可重複用於純化抗體。免疫吸附劑保存液的組份為0. 02M PB(磷酸鹽緩衝溶液，pH7. 4)、0. 9% NaCl、O. 1% NaN3。本發明所用的固相載體製備成本低。抗原和固相載體的偶聯劑是碳二亞胺(EDC)，無毒性。連接過程為室溫震蕩過夜，非常簡便。抗體的純化過程，採用的是最常用的離心方法，一次可大批量製備。而且，免疫吸附劑經純化抗體後，還可重複使用，2 8°C下也可長期保存。所以，本發明建立了一種操作簡便、不操作劇毒物、製備成本低廉、適合大量生產、可用於製備純度達到免疫親和層析級別抗體的方法。本發明操作步驟如下I、抗原的準備用於本發明的抗原需要有氨基(-NH2),—般的蛋白質抗原都有氨基，經過純化後即可使用。2、固相載體的準備固相載體在偶聯前，一般需要先用O. OlMPB (pH7. 4)的緩衝液離心洗滌3次，用以除去懸浮液中的雜物。本發明中的通用離心條件為離心機轉速要求不小於每分鐘3500轉，離心時間不小於10分鐘，洗滌時每次用不小於10倍固相載體體積的O. OlMPB (pH7. 4)的緩衝液。3、固相載體與抗原的連接將固相載體和抗原(加入前測抗原的濃度)共同混合於O. OIMPB(pH7. 4)的緩衝液中，再加入EDC的水溶液，於室溫下震蕩反應過夜。因為固相載體上含有羧基，羧基在EDC的作用下可與抗原上的氨基共價連接，從而使得固相載體 和抗原產生穩定的共價連接形成了免疫吸附劑。固相載體與抗原連接後，離心，測上清抗原濃度，從而可計算免疫吸附劑上連接的抗原量。然後，再對免疫吸附劑離心洗滌至上清A28tol (溶液在280nm紫外光下的光吸收值)< O. 02。洗滌完後，免疫吸附劑用等體積左右的0·01ΜΡΒ(ρΗ7·4)的緩衝液懸浮。4、免疫吸附劑與抗體的結合取一定體積的待純化抗體原液直接加入到免疫吸附劑懸浮液中，2 8°C放置過夜。次日，離心，沉澱物即為抗體-免疫吸附劑，除去上清，將抗體-免疫吸附劑離心洗滌至上清A28tol < O. 02。5、抗體-免疫吸附劑的解離取抗體-免疫吸附劑沉澱物，加入pH值為2 3的甘氨酸-鹽酸緩衝液，混勻，放置5分鐘後離心，分離出上清後立即用氫氧化鈉溶液調整上清的PH值到7. O左右。此解離的上清即為純化的抗體溶液。6、抗體純化後的處理將解離的上清用透析袋對O. OlMPB(pH7. 4)的緩衝液透析，透析後用紫外分光光度儀測蛋白濃度。7、免疫吸附劑的保存和重複使用將純化抗體後的免疫吸附劑離心洗滌至上清A280nm < O. 02，然後懸浮於免疫吸附劑保存液中，2 8°C保存，可重複用於純化抗體。8、純化抗體的檢驗將純化的抗體標記上1251，再取少量125I-抗體同含過量抗原的免疫吸附劑混合反應足夠時間，通過計算同一次實驗中被結合的125I-抗體量佔實驗體系中加入的總125I-抗體量的比率可間接得出純化的抗體中有活性的抗體量佔純化抗體總蛋白量的比率。
具體實施例方式實例用免疫親和沉澱法純化兔IgG的抗體。①兔IgG的純化(此時兔IgG被當作抗原，對應的抗體為兔IgG的抗體)^lOml兔血清，用硫酸銨沉澱法粗提，並對O. OlMPB (pH7. 4)的緩衝液透析，4500ml/次，共更換三次透析液，得濃度為13. 54mg/ml的兔IgG13. 3ml。②固相載體與兔IgG的連接取Ig固相載體用O. OlMPB(pH7. 4)的緩衝液離心(3500r/min)洗滌3次，離心時間10分鐘，每次用400ml O. OlMPB (pH7. 4)的緩衝液，固相載體離心後沉澱的體積大約為19ml。固相載體用19ml0.01MPB(pH7.4)的緩衝液復懸，取100 μ I此未連接兔IgG的固相載體懸浮液留樣，再加入上步粗提的兔IgGlOmlJP 135. 4mg,及300mg EDC (上午11:00加完)，室溫震蕩反應，下午15:00再補加200mg EDC，繼續震蕩反應過夜。次日離心，分離出上清為30ml，測上清蛋白濃度為2. 37mg/ml，則上清中含有71. Img未被連接的兔IgG,而固相載體上連接有64. 3mg兔IgG0用400ml O. OlMPB (ρΗ7· 4)的緩衝液離心(3500r/min)洗滌連接有兔IgG的免疫吸附劑，每次離心10分鐘，共離心洗滌3次後，測得上清A280nm = O-Oll0③沉澱用20ml O. OlMPB (pH7. 4)的緩衝液懸浮，取100 μ I此免疫吸附劑懸浮液留樣，再加40ml兔IgG的抗體血清，混合後2 8 °C放置過夜。④次日，3500r/min離心10分鐘，分離上清,取沉澱；用400ml O. OlMPB (pH7. 4)離心洗滌，每次離心10分鐘，重複3次，測上清A280nm = 0.017 ;取沉澱，加入O. IM ρΗ2· 4甘氨酸-鹽酸緩衝液30ml，混勻，5分鐘後離心，分離出上清，上清立即用2M NaOH溶液調整pH到7. O左右，並對O. OlMPB (pH7. 4)的緩衝液透析，4500ml/次，共換三次透析液。最後，將免 疫吸附劑離心洗滌至上清A28tol < O. 02後放於免疫吸附劑保存液中懸浮，2 8°C保存。⑤用紫外分光光度儀測純化的兔IgG的抗體蛋白濃度為2. 04mg/ml (見表I)，總體積有31ml，所以共收到63. 24mg的純化抗體。⑥重複一次純化抗體將純化抗體後的免疫吸附劑懸浮液離心取沉澱，再重複③ ⑤的操作步驟(第③步中，不需要再取100μ I免疫吸附劑懸浮液留樣)，第二次操作得到純化的兔IgG的抗體31ml,濃度為I. 92mg/ml (見表I),共59. 52mg。將兩次純化的抗體混合，得兔IgG的抗體62ml,濃度為I. 98mg/ml,共122. 76mg。表I純化抗體的濃度檢測表
純化抗體原液稀釋 f布釋後蛋白原液蛋白濃 批次倍數__28°nm26°nm 濃度(mg/ml)度(mg/ml)
4 倍0.6180.5170.512.04
的抗體_____
第二次純化 &
4 倍0.5820.4920.481.92
的抗體 _____注蛋白濃度(mg/ml)= I. 45A280nm-0. 74A260nm⑦純化抗體的檢驗(I) 125I-兔IgG的抗體的製備取19. 8 μ g/10 μ I純化的兔IgG的抗體，加200 μ 10. 2ΜΡΒ (ρΗ7· 4)、500 μ Ci Na125I 溶液，混勻；加入 15 μ g/30 μ I 氯胺-T 水溶液，室溫震蕩反應I. 5分鐘；再加入30 μ g/30 μ I偏重亞硫酸鈉水溶液，室溫震蕩反應I. 5分鐘；將反應液上葡聚糖凝膠G-25分離柱，用O. OlMPB (ρΗ7. 4)的緩衝液淋洗，用Y -射線檢測儀監測流出液的125I放射性計數，流出液有兩個放射性計數峰，第一個峰即為125I-兔IgG的抗體產品峰，收此產品峰約3ml共280 μ Ci，取20 μ I收到的125I-兔IgG的抗體濃溶液加入到50ml實驗緩衝液中，該實驗緩衝液組份為0. 02MPB(pH7. 4),0.5% BSA(牛血清白蛋白)、
O.1% NaN3。混勻，此配好的溶液即為125I-兔IgG的抗體標記物。如果收到的產品峰迴收了 80%投入的兔IgG的抗體，則500 μ I125I-兔IgG的抗體標記物中大約含125I-兔IgG的抗體量如下19. 8μ gXO. 8 + 3000X20 + 50000X500 ^ I. Ing(2)過量兔IgG-免疫吸附劑與125I-兔IgG的抗體標記物的結合用實驗緩衝液將留樣的未連接兔IgG的固相載體懸浮液(用於做對照實驗)和連接了兔IgG的免疫吸附劑懸浮液分別按I : 50、1 IOOU 200稀釋，則每IOOy I I 200的免疫吸附劑懸浮液中含有兔 IgG 的量為64. 3mg+(19+20) Χ0. 1 + 200 O. 8 μ g，I 50 和 I : 100 稀釋度的免疫吸附劑中含有兔IgG的量則更多。將各稀釋度均做如下實驗(見表2):表2兔IgG-免疫吸附劑與純化抗體結合實驗操作表
權利要求
1.一種免疫親和沉澱法用於純化抗體，其特徵包括以下步驟採用含羧基(-COOH)的以丙烯醯胺和丙烯酸為單體的共聚物固相微球作為固相載體，同含有氨基(-NH2)的抗原混合，再加入偶聯劑一I-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)，室溫震蕩反應過夜，從而將抗原連接到固相載體上，形成抗原-固相載體的免疫吸附劑；然後，將待純化的抗體原液與免疫吸附劑混合，2 8°C放置過夜，抗原抗體產生特異性結合，形成抗體-免疫吸附劑結合物，通過離心洗滌，除去未結合的其他混合物，得到單一的抗體-免疫吸附劑結合物；再降低體系中的PH值，則抗體被解離到溶液中，通過離心分離上清後對上清透析，即得到純化的抗體；免疫吸附劑可通過離心洗滌後懸浮於保存液中，2 8°C放置，可重複用於純化抗體。
2.根據權利要求I所述的免疫親和沉澱法，其特徵在於，採用以丙烯醯胺和丙烯酸為單體的共聚物固相微球作為免疫親和沉澱法的固相載體。
3.根據權利要求I所述的免疫親和沉澱法，其特徵在於，固相微球與抗原的連接是通過固相微球上的羧基與抗原的氨基形成的共價鍵連接。
4.根據權利要求I所述的免疫親和沉澱法，其特徵在於，採用碳二亞胺(EDC)作為固相載體與抗原的偶聯劑。
5.根據權利要求I所述的免疫親和沉澱法，其特徵在於，採用離心方法分離純化過程中的固相和液相，包括用離心方法分離解離後的抗體與固相免疫吸附劑。
6.根據權利要求I所述的免疫親和沉澱法，其特徵在於，免疫吸附劑與抗體的解離是通過降低體系中的PH值到2 3實現的。
全文摘要
本發明公開了一種免疫親和沉澱法用於純化抗體，其過程為採用丙烯醯胺和丙烯酸為單體的共聚物固相微球作為固相載體，通過偶聯劑——1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)將抗原連接到固相載體上形成免疫吸附劑，將待純化的抗體原液與免疫吸附劑混合，充分反應後形成抗體-免疫吸附劑結合物，通過離心洗滌除去未結合的其他混合物，得到單一的抗體-免疫吸附劑結合物，再降低體系中的pH值，則抗體被解離到溶液中，通過離心分離上清後對上清透析，即得到純化的抗體。本發明建立了一種操作簡便、適合大量生產、製備純度達到免疫親和層析級別抗體的方法。
文檔編號C07K16/00GK102942627SQ20121005408
公開日2013年2月27日 申請日期2012年3月5日 優先權日2012年3月5日
發明者賀佑豐, 袁鵬飛, 呂東川, 谷澤亮, 張庚寬, 王丁泉 申請人:北京北方生物技術研究所