一種5-[3-(生物素醯氨基己醯)-胺基]-丙烯基-2′-去氧-5′-三磷酸尿嘧啶核苷鋰鹽的...的製作方法
2023-12-05 18:42:16
專利名稱：一種5-[3-(生物素醯氨基己醯)-胺基]-丙烯基-2′-去氧-5′-三磷酸尿嘧啶核苷鋰鹽的 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種的合成新工藝，屬於生物醫藥診斷試劑的製備技術領域。
背景技術：
生物素標記的核苷三磷酸化合物在分子生物學和基因組學領域有著廣泛的應用。本發明 涉及5-[3-(生物素醯氨基己醯)-胺基]-丙烯基-2，-去氧-5，-三磷酸尿嘧啶核苷及其類似 物的製備工藝。
合成路線中最關鍵步驟為三磷酸化反應，Ter6z Kov6cs等(Tetrahedron Lett.1988,29， 4525-4528. Angew. Chew. Int. Ed. 1998, 37(20)， 2872-2875. Nucleic Acids Research. 2001, 29(7)， 1565 —1573.)報導了三磷酸化反應條件，他們純化分離產品的方法 均採用S印hadex層析或者製備高壓液相層析，嚴重限制了產品的大量製備，Wlassoff等 (Bioconjugate Chem. 1995， 6， 352-360.)報導了三磷酸鋰鹽的製備方法。
張禮和等人(北京醫科大學學報，1987， 19 (5)， 334—336。北京醫科大學學報，1990， 22 (3)， 209—212。)使用的合成路線以2'-去氧一5' —三磷酸尿嘧啶核苷為起始原料，5 位丙烯胺基取代以後與生物素醯氨基己醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯反應得到5-[3-(生物素醯 氨基己醯)-胺基]-丙烯基-2'-去氧-5'-三磷酸尿嘧啶核苷，原料本身就不易得，再加上 帶有三磷酸根，在常溫條件下穩定性都很差，所以反應都要儘可能在低溫和短時間內完成， 並且以後每一步反應物純化均要S印hadex層析或者製備高壓液相層析，同樣限制了產品的 大量製備。
發明內容
為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種5-[3-(生物素醯氨基己醯)-胺基]-丙烯 基-2'-去氧-5'-三磷酸尿噴啶核苷及其類似物的合成和純化方法，適用於大量合成。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案是將圖l所述化合物(a)和質子綿加入到單
口瓶中，加入磷酸三甲酯溶解後為淡黃色溶液，氮氣保護，冰浴控制溫度在1(TC以下，加入 三氯氧磷後反應液立即由清澈變渾濁(粉色)，溫度控制在10'C以下反應2-10hr後，加入焦 磷酸三正丁胺鹽的腿F溶液和三正丁胺的混合液，在低於l(TC的溫度下反應3min後加入碳 酸三乙胺鹽緩衝溶液終止反應，繼續攪拌lhr後，真空旋幹溶劑。將粗產品溶解在5 20ml氨 水中，0 3(TC溫度下磁力攪拌反應2 20hr後真空旋幹溶劑，加入10 30ml純淨水溶解，
3二氯甲烷(30ml)萃取3遍，將水相真空旋幹，得到的粗品通過柱層析，洗脫劑為丙醇，異 丙醇，氨水，水按不同比例混合，純化得到化合物2的純品。
將硼酸一硼酸鈉緩衝溶液(pH8-10)加入到盛有化合物2的單口瓶中，0 25'C下加入 生物素醯氨基己醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯的DMF溶液，0 25'C下反應，真空旋幹溶劑，得到 的粗品通過柱層析(洗脫劑為丙醇，異丙醇，氨水，水按不同比例混合)純化得到純品。
將5-[3-(生物素醯氨基己醯)-胺基]-丙烯基-2，-去氧-5，-三磷酸尿嘧啶核苷溶解在 水中，慢慢加入高氯酸鋰的丙酮溶液，大量白色固體析出後，離心機離心分層後，取出上層 清液，加入丙酮洗滌剩餘固體，重複三次後，將固體常溫真空抽乾，得到最終白色固體產品， 結構分別通過1H醒R， HPLC-MS得到驗證。最終產品化學純度大於95%。
本發明所涉及的三磷酸化反應產物產品的純化工藝包括但不僅限於上述化合物，可適用 於通式化合物，如圖2所示。
其中X:為氫、羥基等取代基團； Y:為氫、羥基等取代基團； R:5位取代的尿噴啶或5位取代胞嘧啶等基團； R,為H， Li， Na， K等。
下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
圖1是5-[3-(生物素醯氨基己醯)-胺基]-丙烯基-2，-去氧-5，-三磷酸尿嘧啶核苷及其 類似物的合成的工藝路線。
圖2是適用於本純化工藝的三磷酸化反應產物通式。
具體實施例方式
1)圖1中化合物(b)的製備
將化合物(a) (300mg)和質子綿(237mg， 1. llmmol)加入到25ml單口瓶中，加入磷酸三 甲酯(2. 6ml)溶解後為淡黃色溶液，氮氣保護，冰浴控制溫度在0。C，加入三氯氧磷(120ul)， 反應液立即由清澈變渾濁(粉色)，溫度控制在l(TC以下反應2.5hr後，加入焦磷酸三正丁 胺鹽的DMF溶液(0.5M) (9ml)和三正丁胺(lml)的混合液，l(TC以下反應3min後加入70ml 碳酸三乙胺鹽緩衝溶液(0. 1M)終止反應，繼續攪拌lhr後，真空旋幹溶劑，得到504mg粗品。將粗品溶解在16ml氨水中，20'C溫度下磁力攪拌反應10hr後真空旋幹溶劑，加入20ml 純淨水溶解，二氯甲烷(30ml)萃取3遍，將水相真空旋幹，得到的粗品通過柱層析(洗脫 劑為異丙醇氨水水=11: 7: 2， Rf = 0. 1)純化得到純品90mgC12H20N30"P3 = 523. 22， MS:524[M+H]+，產品結構分別通過"P麗R， 'H醒R， HPLC-MS得到驗證。
2) 5-[3-(生物素醯氨基己醯)-胺基]-丙烯基-2' _去氧-5，-三磷酸尿嘧啶核苷的製備
將15ml硼酸一硼酸鈉緩衝溶液(pH8. 5)加入到盛有中間體3 (40mg)的100ml單口 瓶中，2(TC下加入生物素醯氨基己醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯(150mg溶解在15mlDMF中)的 DMF溶液，2(TC下反應3hr後真空旋幹溶劑，得到的粗品通過柱層析(洗脫劑為異丙醇氨 水水=11: 7: 2， Rf = 0. l)純化得到純品50mg C28H45N60,7P3S = 862. 67， MS:863[M+H]+。 lH_NMR( S ， 300MHz， D20):7 . 94 (s， 1H， C4H) ， 6. 39(t， 1H， d. H) ， 6. 27 6. 35 (m， 2H， CH=CH) ， 4.67 (m， 1H, C3. H)， 4.37 4. 61(m, 2H， Biotin ，—) ， 4.21 (m， 3H， C4, H， C5. H， C5， . H) ， 3.91 (m， 1H， C=C—CH2)， 3.28 (m， 1H， Biotin S—CH)， 3.17 (t， 2H， C—CH2—N)， 2.73 3.00 (ddd， 2H， Biotin S—CH2) ， 2.38 (m， 2H， C2. H， C2. . H) ， 2. 18 2. 33 (m， 4H， 0=C—CH2)， 1.33 1.67 (m， 12H， CH2)。
31PNMR (D20) :S=—6. 16(d， yP)， 一11. 15 (d， a p)， 一21.51 (t， PP)。
3) 5-[3-(生物素醯氨基己醯)-胺基]-丙烯基_2，-去氧-5，-三磷酸尿嘧啶核苷鋰鹽的 製備
將5-[3-(生物素醯氨基己醯)-胺基]-丙烯基-2'-去氧-5，-三磷酸尿嘧啶核苷(36mg， 0.042mmo1)溶解在3ml純淨水中，慢慢加入llml高氯酸鋰的丙酮溶液，大量白色固體析出， 離心分層後，取出上層清液，加入8ml丙酮洗滌剩餘固體，重複三次後，將固體常溫真空抽 幹，得到20mg白色固體產品C28H41Li4N6017P3S=886.41， MS:863[M-4Li++5H]+，結構分別通過 力NMR， 3IPNMR， HPLC-MS得到驗證。最終產品化學純度大於95%。
質譜測定產品分子量C28H41Li4N6017P3S=886.41， MS:863[M-4Li++5H]+。
tH核磁共振氫譜歸屬:'H-NMR(S， 300MHz， D20):7 . 94 (s， 1H， C4H) ， 6.39 (t， 1H， d. H)， 6. 27 6. 35 (m， 2H， CH=CH) ， 4.67 (m， 1H， C3'H) ， 4. 37 4. 61 (m， 2H， Biotin nchCH\N) ， 4.21 (m， 3H， C4'H， C5. H， C5. . H) ， 3.91 (m， 1H， OC—CH2) ， 3. 28 (m， 1H， Biotin S—CH)， 3.17 (t， 2H， C_CH2—N)， 2. 73 3. 00 (ddd， 2H， Biotin S—CH》，2.38 (m， 2H， C2. H， C2. . H)， 2. 18 2.33 (m， 4H， 0=C_CH2) ， 1.33 1.67 (m， 12H， CH2)。
3'P核磁共振磷譜歸屬31PNMR (D20) : S =_6. 16 (d， yP)， 一11. 15 (d， a P)，
—21.51 (t， PP)。
權利要求
1.一種5-[3-(生物素醯氨基己醯)-胺基]-丙烯基-2』-去氧-5』-三磷酸尿嘧啶核苷鋰鹽的合成工藝，其特徵是包括以下合成步驟1)以5-(3-三氟乙醯胺基)-丙烯基-2』-脫氧脲嘧啶核苷為起始物在磷酸三甲酯，三氯氧磷和焦磷酸三正丁胺鹽等試劑作用下進行三磷酸化，其產物處理後用氨水作用脫去胺基保護基生成化合物2；2)化合物2用矽膠柱層析，用不同比例的醇和氨水系統洗脫線化；3)化合物2與生物素醯氨基己醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯反應生成化合物3；4)化合物3用矽膠柱層析，用不同比例的醇和氨水系統洗脫線化；5)化合物3在高氯酸鋰丙酮溶液中發生沉澱，得到目標產物5-[3-(生物素醯氨基己醯)-胺基]-丙烯基-2』-去氧-5』-三磷酸尿嘧啶核苷。
2. 根據權利要求1所述的合成工藝，其特徵是使用三磷酸化反應產物的純化工藝，該 化合物的純化工藝通過常規矽膠柱色譜完成，洗脫劑為丙醇，異丙醇，氨水，水按不同比例 混合，可適用於通式化合物。
全文摘要
本發明提供了一種5-[3-(生物素醯氨基己醯)-胺基]-丙烯基-2』-去氧-5』-三磷酸尿嘧啶核苷鋰鹽的合成方法，以簡便易得的2′-脫氧尿苷和生物素醯氨基己醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯為原料經過5步反應得到目標化合物的鋰鹽與現有合成工藝相比，本發明的合成方法合成原料容易獲得、收率較高、反應條件溫和且容易控制、分離純化方法容易操作，適用於大量製備。
文檔編號C07H19/00GK101684134SQ20081016694
公開日2010年3月31日 申請日期2008年9月28日 優先權日2008年9月28日
發明者曄 劉, 劉延春, 吳勁昌, 牟紅濤, 陽 蔡 申請人:北京紅惠新醫藥科技有限公司