嗜鹽古菌在開放條件下連續處理糖蜜酒精廢水生產pha的方法
2023-12-05 01:20:46 1
嗜鹽古菌在開放條件下連續處理糖蜜酒精廢水生產pha的方法
【專利摘要】嗜鹽古菌在開放條件下連續處理糖蜜酒精廢水生產PHA的方法，屬於PHA的生產【技術領域】。包括以下步驟：Haloferax?mediterranei菌種活化、在種子培養基中進行培養、SBR反應器內以糖蜜酒精廢水進行菌种放大培養、連續流反應器內以糖蜜廢水進行連續PHA生產、回收排除的剩餘汙泥中的PHA。連續流工藝簡單，相比較發酵工藝，無需反覆更換發酵液，無需反覆接種菌泥，連續進水連續出水，各工藝參數趨於恆定值，實現簡單，便於自動控制，易於工程操作，PHA產量高，實現了PHA的連續生產，同時也做到了剩餘汙泥的資源化利用。
【專利說明】嗜鹽古菌在開放條件下連續處理糖蜜酒精廢水生產PHA的 方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於PHA的生產【技術領域】，涉及一種利用嗜鹽古菌Haloferax mediterranei在連續推流反應器中處理糖蜜酒精廢水合成聚羥基脂肪酸酯（PHA)的技術 方法。該發明特別適用於糖蜜酒精廢水的預處理進行資源回收，具有廢物利用、能源生產和 資源回收的多重優勢。
【背景技術】
[0002] 目前，全球範圍內，PHA的工業化生產普遍採用單底物進行純菌批次生物發酵的 方法。例如，美國Metabolix公司創造了基因重組的Escherichia coli K12菌株，以葡 萄糖為底物進行發酵，24h可獲得90 %細胞乾重的PHA產品生產。德國Biomer公司利用 Alcaligenes latus菌株，以蔗糖為底物發酵進行PHA的工業生產。中國清華大學與廣東 江門生物技術開發中心有限公司、韓國科技院（韓國）和寶潔公司（USA)合作，已成功進行 了 Aeromonas hydrophila發酵合成PHA的工業生產。但是間歇發酵過程有明顯的缺陷：① 發酵過程中要不斷的向發酵罐中加入酸鹼溶液控制pH，要配置專門的投加設備；每個周期 結束後發酵罐要進行清洗、消毒；每周期要重新更換發酵液等，使得人力、物力、動力消耗較 大；②生產周期較短，由於分批發酵時菌體有一定的生長規律，都要經歷延滯期、對數生長 期、穩定期和衰亡期，而且每批發酵都要經菌種擴大發酵、設備衝洗、滅菌等階段；③生產效 率低，由於在整個發酵周期中包括放料、洗罐、加料、滅菌等時間，實際有效發酵時間短，發 酵效率很低。為此，如果將間歇發酵改為連續生產將克服上述問題，提高PHA生產效率，降 低PHA生產成本。
[0003] 在連續流生物技術層面，利用工業廢水作為底物在汙水生物處理過程中收穫PHA 是解決在這一問題很好的方式。利用廢水尤其是某些工業廢水中高含量的有機物作為碳 源，在進行廢水處理的同時收穫PHA，不僅解決了汙水處理問題，也使合成PHA過程中底物 單一性得到改善，對PHA組分的多樣性提供保證。這樣的方式一方面突破了現在PHA生產 依賴純菌發酵的現狀，另一方面也使汙水處理和資源回收有效的結合。因此可以有效地提 高生產效率，降低生產成本。
[0004] 糖蜜酒精產業是我國目前重要的工業產業。該行業產生的廢水具有有機含量高、 揮發性有機成分高的特性。本發明方法針對糖蜜酒精廢水利用嗜鹽古菌H. mediterranei, 在連續推流反應器內中對有機物廢物進行資源回收，實現在開放環境中PHA的連續生產。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在於提供一種在連續推流反應器中回收糖蜜酒精廢水合成PHA，實 現PHA連續生產的方法。該方法可以大大降低PHA工業生產成本，從而使PHA更具市場競 爭力，應用更廣泛。
[0006] 嗜鹽古菌在開放條件下連續處理糖蜜酒精廢水生產PHA的方法，其特徵在於，採 用的裝置為公知的汙水處理領域連續推流工藝反應器、鼓風曝氣裝置、SBR反應器，利用上 述的裝置馴化培養嗜鹽古菌H. mediterranei，在開放條件下實現PHA的連續生產，主要包 括以下步驟：
[0007] 步驟1，將菌株H. mediterranei按照公知的菌種活化方法進行活化；
[0008] 步驟2,挑取活化後的純菌株到滅菌後的液體種子培養基，搖床震蕩培養，轉速 150rpm，溫度37°C，溶解氧濃度> 3mg/L，培養48h ;5000rpm轉速下離心懸濁液收穫菌體，然 後將收穫的菌體再次放入滅菌後的種子培養基中，同樣條件下培養24h ;再次以5000rpm轉 速離心收穫培養的菌體，然後將離心收穫的菌體全部置於SBR反應器中；
[0009] 步驟3,向盛有放大菌體的SBR反應器中加入糖蜜酒精廢水，運行SBR反應器，控制 反應條件為溫度室溫，溶解氧> 3mg/L，曝氣時間20-23h，沉澱l-4h，然後排掉上清液；反覆 重複操作10-20次，直至SBR內的菌體乾重達到3000mg/L以上；
[0010] 步驟4,將沉澱收穫的SBR反應器中的菌體全部轉到連續流反應器中，啟動連續流 工藝裝置，連續處理鹽度範圍在40-100g/L的糖蜜酒精廢水，連續流的工藝參數為：水力停 留時間12-20h，有機負荷為0. 86-1. 43kgC0DAkgMLSS d)，曝氣池溶解氧濃度彡3mg/L，汙 泥停留時間4-6d，汙泥回流比為200-300%，運行溫度為室溫，二沉池沉澱時間3-5h ;
[0011] 步驟5，連續運行步驟4連續推流工藝20-30d後，對每日從二沉池排出的剩餘汙泥 進行PHA的提取和生產。
[0012] 連續運行步驟4連續推流工藝20-30d後，系統對糖蜜酒精廢水的C0D去除率可以 達到80%，糖蜜酒精廢水轉化成PHA的轉化率為0. 5-0.8g PHA/g C0D，連續運行生產的PHA 為共聚物PHBV。PHA的含量達到約菌體乾重的40%以上。
[0013] 本發明具有以下優點：
[0014] (1)目前國內的PHA生產主要集中於單底物發酵工藝，使用單底物成本很高，並且 合成PHA的組分單一，PHA應用範圍較窄。本發明利用工業廢水的複雜底物，不僅改善了底 物的單一性，同時進行了廢水的資源化；
[0015] (2)本發明中使用嗜鹽菌，優點在於：①高鹽環境限制了其他非嗜鹽微生物的生 長，因此可以省略嚴格的滅菌程序；②嗜鹽微生物胞內積累的PHA在淡水環境很容易通過 溶胞釋放，便於下遊回收PHA。③嗜鹽微生物積累的產物PHA多為特殊的共聚物，其物理性 能更適合生產應用，因此應用前景更好。這些優勢對進一步降低PHA生產成本，擴大PHA適 用範圍具有重要的意義。
[0016] (3)連續流工藝簡單，相比較發酵工藝，無需反覆更換發酵液，無需反覆接種菌泥， 連續進水連續出水，各工藝參數趨於恆定值，實現簡單，便於自動控制，易於工程操作；
[0017] (4)該工藝無需發酵罐衝洗裝置、pH調節裝置等硬體設備，減少設備成本，同時節 約能耗；
[0018] (5)連續流工藝的汙泥產量高，從二沉池排出的剩餘汙泥直接用於PHA的提取和 生產，PHA產量高，實現了 PHA的連續生產，同時也做到了剩餘汙泥的資源化利用。
【具體實施方式】
[0019] 以下結合【具體實施方式】對本發明作進一步的詳細說明，但本發明並不限於以下實 施例。
[0020] 實施例1
[0021] 在實施例中，所用菌種為Haloferax mediterranei，菌種編號ATCC 33500。
[0022] 該菌株的種子培養基配方為：每1L去離子水對應蛋白腖7. 5g、酵母提取物10g、檸 檬酸鈉3g、硫酸鎂20g、氯化鉀2g、硫酸亞鐵0. Olg、氯化鈉200g所組成的培養基，調節pH 至 7. 2。
[0023] 具體實施步驟如下：
[0024] 步驟1，將購買到的菌株H. mediterranei按照公知的菌種活化方法進行活化。
[0025] 步驟2,挑取活化後的純菌株到200ml滅菌後的液體種子培養基，搖床震蕩培養， 溫度37°C，轉速150rpm，溶解氧濃度> 3mg/L，培養48h。5000rmp轉速下離心菌懸液收穫菌 體，然後將離心後的菌體全部轉入到1L滅菌後的液體種子培養基中，37°C下搖床震蕩培養 24h，轉速150rpm，將1L菌懸液再次離心，再次以5000rpm轉速離心收穫培養的菌體。然後 將離心收穫的菌體全部置於10L SBR反應器中。
[0026] 步驟3,向盛有放大菌體的SBR反應器中加入8L糖蜜酒精廢水，運行SBR反應器。 控制反應條件為溫度室溫，溶解氧濃度> 3mg/L，曝氣20h，沉澱4h，排掉4L上清液。然後加 入4L糖蜜酒精廢水，按照上述步驟重複操作12次。SBR內菌體乾重達到3500mg/L。
[0027] 步驟4,將沉澱收穫的SBR反應器中的菌體轉到連續流反應器中，開始進行連續流 馴化培養。糖蜜酒精廢水C0D濃度為2500mg/L，進水C/N= 50,鹽度=50g/L。水力停留時 間12h，有機負荷為1. 43kgC0DAkgMLSS d)，曝氣池溶解氧濃度彡3mg/L，汙泥停留時間5d， 汙泥回流比為300%，運行溫度為室溫，二沉池沉澱時間4h。汙泥主要在曝氣區消耗廢水 中的碳源合成PHA。
[0028] 步驟5,連續運行連續推流工藝25d後，系統對糖蜜酒精廢水的C0D去除率可以達 到50%以上。糖蜜酒精廢水轉化成PHA的轉化率為0. 588g PHA/g C0D。生產的PHA為共 聚物PHBV。PHA的含量達到約菌體乾重的21 %。
[0029] 步驟6,對每日排出連續流系統的剩餘汙泥進行PHA回收。
[0030] 實施例2
[0031] 在實施例中，所用菌種為Haloferax mediterranei，菌種編號ATCC 33500。
[0032] 該菌株的種子培養基配方為：每1L去離子水對應蛋白腖7. 5g、酵母提取物10g、檸 檬酸鈉3g、硫酸鎂20g、氯化鉀2g、硫酸亞鐵0. 01g、氯化鈉200g所組成的培養基，調節pH 至 7. 2。
[0033] 具體實施步驟如下：
[0034] 步驟1，將購買到的菌株H. mediterranei按照公知的菌種活化方法進行活化。
[0035] 步驟2,挑取活化後的純菌株到200ml滅菌後的液體種子培養基，搖床震蕩培養， 溫度37°C，轉速150rpm，溶解氧濃度> 3mg/L，培養48h。5000rmp轉速下離心菌懸液收穫菌 體，然後將離心後的菌體全部轉入到1L滅菌後的液體種子培養基中，37°C下搖床震蕩培養 24h，轉速150rpm，將1L菌懸液再次離心，再次以5000rpm轉速離心收穫培養的菌體。然後 將離心收穫的菌體全部置於10L SBR反應器中。
[0036] 步驟3,向盛有放大菌體的SBR反應器中加入8L糖蜜酒精廢水，運行SBR反應器。 控制反應條件為溫度室溫，溶解氧濃度> 3mg/L，曝氣20h，沉澱4h，排掉4L上清液。然後加 入4L糖蜜酒精廢水，按照上述步驟重複操作12次。SBR內菌體乾重達到3500mg/L。
[0037] 步驟4,將沉澱收穫的SBR反應器中的菌體轉到連續流反應器中，開始進行連續流 馴化培養。糖蜜酒精廢水C0D濃度為2500mg/L，進水C/N= 50,鹽度=50g/L。水力停留時 間16h，有機負荷為1. 07kgC0DAkgMLSS d)，曝氣池溶解氧濃度彡3mg/L，汙泥停留時間5d， 汙泥回流比為300%，運行溫度為室溫，二沉池沉澱時間4h。汙泥主要在曝氣區消耗廢水中 的碳源合成PHA。
[0038] 步驟5,連續運行連續推流工藝25d後，系統對糖蜜酒精廢水的C0D去除率可以達 到80%以上。糖蜜酒精廢水轉化成PHA的轉化率為0. 76g PHA/g C0D。生產的PHA為共聚 物PHBV。PHA的含量達到約菌體乾重的43%。
[0039] 步驟6,對每日排出連續流系統的剩餘汙泥進行PHA回收。
[0040] 實施例3
[0041] 在實施例中，所用菌種為Haloferax mediterranei，菌種編號ATCC 33500。
[0042] 該菌株的種子培養基配方為：每1L去離子水對應蛋白腖7. 5g、酵母提取物10g、檸 檬酸鈉3g、硫酸鎂20g、氯化鉀2g、硫酸亞鐵0. 01g、氯化鈉200g所組成的培養基，調節pH 至 7. 2。
[0043] 具體實施步驟如下：
[0044] 步驟1，將購買到的菌株H. mediterranei按照公知的菌種活化方法進行活化。
[0045] 步驟2,挑取活化後的純菌株到200ml滅菌後的液體種子培養基，搖床震蕩培養， 溫度37°C，轉速150rpm，溶解氧濃度> 3mg/L，培養48h。5000rmp轉速下離心菌懸液收穫菌 體，然後將離心後的菌體全部轉入到1L滅菌後的液體種子培養基中，37°C下搖床震蕩培養 24h，轉速150rpm，將1L菌懸液再次離心，再次以5000rpm轉速離心收穫培養的菌體。然後 將離心收穫的菌體全部置於10L SBR反應器中。
[0046] 步驟3,向盛有放大菌體的SBR反應器中加入8L糖蜜酒精廢水，運行SBR反應器。 控制反應條件為溫度室溫，溶解氧濃度> 3mg/L，曝氣20h，沉澱4h，排掉4L上清液。然後加 入4L糖蜜酒精廢水，按照上述步驟重複操作12次。SBR內菌體乾重達到3500mg/L。
[0047] 步驟4,將沉澱收穫的SBR反應器中的菌體轉到連續流反應器中，開始進行連續流 馴化培養。糖蜜酒精廢水C0D濃度為2500mg/L，進水C/N = 50,鹽度=50g/L。水力停留 時間20h，有機負荷為0. 857kgC0DAkgMLSS d)，曝氣池溶解氧濃度彡3mg/L，汙泥停留時間 5d，汙泥回流比為300%，運行溫度為室溫，二沉池沉澱時間4h。汙泥主要在曝氣區消耗廢 水中的碳源合成PHA。
[0048] 步驟5,連續運行連續推流工藝25d後，系統對糖蜜酒精廢水的C0D去除率可以達 到70%以上。糖蜜酒精廢水轉化成PHA的轉化率為0.680g PHA/g C0D。生產的PHA為共 聚物PHBV。PHA的含量達到約菌體乾重的34%。
[0049] 步驟6,對每日排出連續流系統的剩餘汙泥進行PHA回收。
【權利要求】
1. 嗜鹽古菌在開放條件下連續處理糖蜜酒精廢水生產PHA的方法，其特徵在於，採用 的裝置為汙水處理領域連續推流工藝反應器、鼓風曝氣裝置、SBR反應器，利用上述的裝置 馴化培養嗜鹽古菌H. mediterranei，在開放條件下實現PHA的連續生產，主要包括以下步 驟： 步驟1，將菌株H. mediterranei進行活化； 步驟2,挑取活化後的純菌株到滅菌後的液體種子培養基，搖床震蕩培養，轉速 150rpm，溫度37°C，溶解氧濃度> 3mg/L，培養48h ;5000rpm轉速下離心懸濁液收穫菌體，然 後將收穫的菌體再次放入滅菌後的種子培養基中，同樣條件下培養24h ;再次以5000rpm轉 速離心收穫培養的菌體，然後將離心收穫的菌體全部置於SBR反應器中； 步驟3,向盛有放大菌體的SBR反應器中加入糖蜜酒精廢水，運行SBR反應器，控制反應 條件為溫度室溫，溶解氧> 3mg/L，曝氣時間20-23h，沉澱l-4h，然後排掉上清液；反覆重複 操作10-20次，直至SBR內的菌體乾重達到3000mg/L以上； 步驟4,將沉澱收穫的SBR反應器中的菌體全部轉到連續流反應器中，啟動連續流工藝 裝置，連續處理鹽度範圍在40-100g/L的糖蜜酒精廢水，連續流的工藝參數為：水力停留時 間12-20h，有機負荷為0. 86-1. 43kgCODAkgMLSS d)，曝氣池溶解氧濃度彡3mg/L，汙泥停 留時間4-6d，汙泥回流比為200-300%，運行溫度為室溫，二沉池沉澱時間3-5h ; 步驟5,連續運行步驟4連續推流工藝20-30d後，對每日從二沉池排出的剩餘汙泥進行 PHA的提取和生產。
2. 按照權利要求1的方法，其特徵在於，連續運行步驟4連續推流工藝20-30d後，系 統對糖蜜酒精廢水的COD去除率達到80%，糖蜜酒精廢水轉化成PHA的轉化率為0. 5-0. 8g PHA/g COD，PHA的含量達到約菌體乾重的40%以上。
【文檔編號】C02F3/12GK104195185SQ201410324698
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月9日 優先權日:2014年7月9日
【發明者】崔有為, 冀思遠, 張宏宇 申請人:北京工業大學