香桂組織培養快速繁殖方法

2023-12-05 06:37:41 1

專利名稱：香桂組織培養快速繁殖方法
技術領域：
本發明屬於植物組織培養技術的植物再生，尤其是香桂組織培養快速繁殖方法。
香桂是我國特有的造林樹種，原產於我國四川盆地的南部山區、海撥500-1500m的石灰巖山地，其材質優良，枝、葉含有豐富的芳香油，油的主要成份為黃樟油素，可利用其合成洋茉莉醛、新洋茉莉醛、胡椒基丙酮、香蘭素等多種公認的名貴花香型、奶香型香料，是外貿暢銷物資，也是有關輕工業的重要原料。
採用植物組織培養技術可以在短期內快速繁殖多種植物，不僅繁殖速率極高，而且會因是無性繁殖，可以保持原繁殖母株的優良性狀，近年來在生產上應用越來越廣。植物組織培養技術的原理是利用植物細胞的全能性(即組成植物體的每一個細胞都具有發育成為一個完整個體的潛在能力)，採取植物體上的單個細胞、細胞團、分生組織或器官的一部分，通過人工配製不同營養成份和激素的培養基來培養並調節控制其發育，使這些細胞、組織等形成成千上萬個小植株，並且保持了母本植株全部的優良性狀，這種方法可以在短時間內獲得大量的試管苗，並能在人工控制條件的車間內一年四季進行，因而可以實現種苗繁殖的工廠化生產，且可以在較少的面積內進行大規模生產，因而無需佔用大量土地。目前，我國利用植物組織培養技術再生植株的種類已達1000多種，其中，木本植物100多種，用現有植物組織培養技術不能直接進行香桂組織的培養及快速繁殖。
香桂是木本植物，且含油量高，其組織培養難度大，至今在國內外尚未見到利用組織培養技術成功繁殖香桂的報導。
本發明的目的是提供一種適合於香桂組織培養的快速繁殖方法，使香桂樹苗大大增加，實現香桂苗的大規模生產。
本發明的具體方案是一種香桂組織培養快速繁殖方法，按如下步聚進行(1)外植體製備選擇生長健壯，黃樟油素含量高的優良香桂植株，取其0.5～2.0cm長莖尖或側芽切段，或取其分生組織切塊0.2～3mm，用75％酒精浸泡10～30秒，無菌水衝洗1次，置入0.1％HgCl2溶液中滅菌3～15分鐘，在超淨工作檯上用無菌水衝洗3～5次，每次5分鐘，濾紙吸乾後，作為外植體進行培養；(2)不定芽誘導培養將外植體接種在下述重量配比的原料製成的不定芽誘導培養基中誘導愈傷組織及不定芽產生細胞分裂素 0.5～10mg生長素 0.05～1.0mg維生素C(或者聚乙烯吡咯烷酮) 0.5～10mg生物素 1～10mg香蕉鮮汁 2～30g蔗糖 30～60gMS(或1/2MS或1/4MS或LS或White或LS)培養基基本組分 2000～5000mg蒸餾水 加至1000ml在17～26℃、每日照光8～14小時、光照強度1000～4000lx的條件下培養1～2個月後，將生成的不定芽移入芽生長繁殖培養基中；(3)芽生長繁殖培養將上述(2)步所獲得的不定芽切下接種在下述重量配比的原料製成的芽生長繁殖培養基中細胞分裂素 0.05～1.0mg生長素 0.01～1.0mg生物素 1～10mg赤黴素 0～3.0mg香蕉鮮汁 2～30g蔗糖 30～60gMS(或1/2MS或1/4MS或LS或White或LS)培養基基本組分 2000～5000mg蒸餾水 加至1000ml在17～26℃、每日照光8～14小時、光照強度1000～4000lx的條件下培養20～40天後，小芽可迅速長大，長大後將其切成帶芽切段，再接種在芽生長繁殖培養基中擴大繁殖，達到一定數量後再將其轉入生根培養基中；(4)生根形成試管苗將從基部切下的無根試管苗插入下述重量配比的原料製成的生根培養基中生長素 0.01～5.0mg水解酪蛋白 200～1000mg蔗糖 15～50g1/2MS(或1/4MS)培養基基本組分 2000～3000mg蒸餾水 加至1000ml在17～26℃、每日照光8～14小時、光照強度5000～10000lx的條件下培養20～45天後，試管苗生根成苗；(5)試管苗馴化移栽將根系發育良好的試管苗移入溫室，馴化1～2周後，再打開瓶蓋加少量水，練苗2～3天；或者將試管苗直接進入試管苗馴化移栽過程，試管苗在馴化、練苗的過程中生根；把經練苗後的試管苗移栽在溫室中蛭石或珍珠巖、河沙、腐殖質土等組成的營養缽中，以塑料棚覆蓋，2周後再逐漸打開塑料棚，在溫室土壤中生長一個月後，定植於大田。
本發明的不定芽誘導培養基中各原料的優選重量配比是細胞分裂素 1.0～5.0mg生長素 0.2～0.6mg維生素C 3～8mg生物素 3～8mg香蕉鮮汁5～15g蔗糖30～50gMS(或1/2MS或1/4MS或LS或White)培養基基本組分 2400～4700mg蒸餾水 加至1000ml本發明的芽生長繁殖培養基中各原料的優選重量配比是細胞分裂素 0.1～0.8mg生長素 0.05～0.5mg生物素 3～8mg香蕉鮮汁 5～20g蔗糖 30～45gMS(或1/2MS或1/4MS或LS或White)培養基基本組分2400～4700mg蒸餾水 加至1000ml本發明的生根培養基中各原料的優選重量配比是生長素0.1～3.0mg水解酪蛋白400～800mg蔗糖 20～30g1/2MS(或1/4MS)培養基基本組分 2000～2500mg蒸餾水加至1000ml本發明的不定芽誘導培養基中各原料的最佳重量配比是細胞分裂素5.5mg生長素0.2mg維生素C 5mg生物素4mg香蕉鮮汁 10g蔗糖 45gMS培養基基本組分 4696.430mg蒸餾水加至1000ml本發明的芽生長繁殖培養基中各原料的最佳重量配比是細胞分裂素0.3mg生長素0.2mg生物素4mg香蕉鮮汁 10g
蔗糖 45gMS培養基基本組分 4696.430mg蒸餾水加至1000ml本發明的生根培養基中各原料的最佳重量配比是生長素 0.5mg水解酪蛋白 500mg蔗糖 25g1/2MS培養基基本組分 2451.430mg蒸餾水 加至1000ml本發明的芽生長繁殖培養基也可以是將外植體直接種在下述的芽生長繁殖培養基中細胞分裂素0.3mg生長素0.2mg生物素4mg赤黴素2mg香蕉鮮汁 10g蔗糖 45gMS培養基基本組分 4696.430mg蒸餾水加至1000ml本發明不定芽誘導培養基和芽生長繁殖培養基配比中的細胞分裂素是6-苄氨基嘌呤或激動素或玉米素或玉米素核苷。
本發明生根培養基配比中的生長素是吲哚丁酸或吲哚乙酸或奈乙酸。
本發明選用MS作為基本培養基，提供香桂種苗生長所需的大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成份；在發明的外植體製備及培養階段，加入了維生素C或聚乙烯吡咯烷酮，防止了外植體的褐化與死亡，提高了外植體的成活率和培養的成功率。在不定芽誘導培養和芽生長繁殖培養過程中採用的不定芽誘導培養基和芽生長繁殖培養基配比中細胞分裂素與生長素的重量比較高，並在兩種培養基中均增加了生物素、香蕉鮮汁，提高了培養基中蔗糖的濃度，從而使得不定芽能早日形成，並迅速生長，以利於獲得更多更健壯的試管苗。在生根形成試管苗過程採用的生根培養基配比中，採用了1/2MS的培養基，將蔗糖濃度降低至2451.430mg，提高光照強度至5000～10000lx，有利於試管苗由異養向自養的轉化，大大提高了移栽成活率。
採用本發明提供的方法在不定芽誘導階段一般20天左右就可開始出現分化，再經5～10天培養，即可出現叢生綠苗。在芽生長階段，1個小芽經剪切再進一步扦插繁殖，一般20天左右即可長至5～7cm高，具3～8個新芽。在生根培養基上，培養20～25天後，可見有白色短根出現。如果生根——馴化一次性在溫室中完成，生根馴化時間可減少在25～30天左右，且整個苗木生長健壯，移栽成活率高。
利用本辦法可周年繁殖優良香桂種苗，一個外植體一年可繁殖數千至數萬株。在繁殖過程中，利用芽生長，長大的苗再切成帶芽切段，再接種於芽生長繁殖培養基中，反覆扦插形成大量的試管苗，再誘導其生根，將根系發育良好的試管苗移入溫室馴化並移入土壤中，或將試管苗扦插在生根培養基之後，轉入溫室中馴化並同時生根，可大大縮短培養到成苗的時間，降低生產成本，並提高成活率。
採用上述方案，本發明具有培養速度快、繁殖率高、工藝流程短、試管苗移栽成活率高、繁殖後代不變異、易於操作、生產成本低等優點，可進行大規模生產。
經實驗證明，採用組培快繁技術比採用傳統的種子育苗方法製得的香桂產品性能指標好。如下表所示
下面結合實施例對本發明進一步詳細說明。
實施例一1.外植體製備取香桂莖尖或側芽，洗潔精清洗1～2次，流水衝洗乾淨，濾紙吸乾。將取下的莖尖或側芽在75％酒精中浸泡10-30秒，無菌水衝洗1次，置入0.1％HgCl2溶液中滅菌8分鐘，在超淨工作檯上用含有5～10mg/L的維生素C的無菌水衝洗3～5次，每次5分鐘，濾紙吸乾。
2.不定芽誘導培養在超淨工作檯上，用常規無菌操作方法將無菌水衝洗乾淨、濾紙吸乾的香桂莖尖或側芽頂部切下5～15mm。接種在下述重量配比的原料製成的不定芽誘導培養基中。
6-苄氨基嘌呤2.0mg吲哚丁酸0.2mg維生素C 5mg生物素 4mg香蕉鮮汁10g蔗糖25g1/2MS培養基基本組分 2451.43mg蒸餾水 加至1000ml在24+2℃，每日照光14小時、光照強度5000～6000lx的條件下培養1～2個月後，將生成的不定芽移入芽生長繁殖培養基中。
3.芽生長繁殖培養香桂莖尖、側芽在不定芽誘導培養基中3天後開始膨長，20-40天後開始形成多個不定芽，當不定芽長大後，將其移入在下述重量配比的芽生長繁殖培養基中6-苄氨基嘌呤 1.0mg吲哚丁酸 0.2mg生物素 4mg
香蕉鮮汁10g蔗糖35g1/2MS培養基基本組分 2451.43mg蒸餾水 加至1000ml在芽生長繁殖培養基上，經30天培養，不定芽迅速長大成為無根苗，苗高3-8cm，帶3-8片葉及多個側芽，此時將其切下，並切成帶芽切段，再轉入上述培養基中，可促進芽進一步擴大繁殖。
4.生根形成試管苗當無根試管苗長至3-5cm高，具4-6片葉片時，將其從基部剪斷並插入下述重量配比的原料製成的生根培養基中吲哚丁酸 0.5mg水解酪蛋白 500mg蔗糖 25g1/2MS培養基基本組分2451.430mg蒸餾水 加至1000ml培養室溫度及光照條件24+2℃，每日照光14小時、光照強度5000～6000lx。
5.試管苗馴化移栽當試管苗根系發育良好，具5-8片葉片時，將其移入溫室馴化2周。移栽前，打開瓶蓋2-3天，加少量水以使培養基軟化，取出試管苗，將其根系上的培養基洗乾淨，移栽於蛭石或珍珠巖、河沙、腐殖質土等組成的營養缽中。第一次澆透水，注意保溫、保溼，並置於塑料棚下，溫度為20+2℃，溫度為95～100％。兩周後，逐漸打開塑料棚，在溫室中繼續生長一個月後，定植於大田。
實施例二先進行外植體製備取香桂莖尖或側芽，洗潔精清洗1-2次，流水衝洗乾淨，濾紙吸乾。將取下的莖尖或側芽在75％酒精中浸泡10-30秒，無菌水衝洗1次，置入0.1％HgCl2溶液中滅菌10分鐘，在超淨工作檯上用含有5～10mg/L的聚乙烯吡咯烷酮的無菌水衝洗3～5次，每次5分鐘，濾紙吸乾。然後按實施例一的步聚進行製備，只是各培養基的重量配比和原料成份不同。
本實施例中不定芽誘導培養基中的不定芽誘導培養基為下述重量配比的原料製成激動素0.5mg吲哚乙酸 0.05mg0.2～0.6mg維生素C 0.5mg生物素1mg香蕉鮮汁 2g蔗糖 30gLS培養基基本組分 4696.430mg蒸餾水加至1000ml該實施例中芽生長繁殖培養過程中的芽生長繁殖培養基為下述重量配比的原料製成激動素 0.05mg吲哚乙酸 0.01mg0.2～0.6mg生物素 1mg香蕉鮮汁 2g蔗糖 30gLS培養基基本組分 4696.430mg蒸餾水 加至1000ml該實施例中生根形成試管苗培養過程中的生根培養基為下述重量配比的原料製成吲哚乙酸 0.01mg水解酪蛋白 800mg蔗糖 15g1/2MS培養基基本組分 2451.430mg蒸餾水 加至1000ml其他過程與實施例1相同。
實施例三先進行外植體製備取香桂莖尖或側芽，洗潔精清洗1-2次，流水衝洗乾淨，濾紙吸乾。將取下的莖尖或側芽在75％酒精中浸泡10-30秒，無菌水衝洗1次要入0.1％HgCl2溶液中滅菌12分鐘，在超淨工作檯上用含有5～10mg/L的生素C的無菌水衝洗3～5次，每次5分鐘，濾紙吸乾。然後按實施例一的步聚進行製備，只是各培養基的重量配比和原料成份不同。
本實施例中不定芽誘導培養基中的不定芽誘導培養基為下述重量配比的原料製成6-苄氨基嘌呤10.0mg吲哚丁酸1.0mg0.2～0.6mg聚乙烯吡咯烷酮 10mg生物素 10mg香蕉鮮汁30g蔗糖30gWhite培養基基本組分 4696.430mg蒸餾水 加至1000ml該實施例中芽生長繁殖培養過程中的芽生長繁殖培養基為下述重量配比的原料製成6-苄氨基嘌呤1.0mg吲哚丁酸1.0mg0.2～0.6mg生物素 10mg香蕉鮮汁30g蔗糖30gWhite培養基基本組分 4696.430mg蒸餾水 加至1000ml該實施例中生根形成試管苗培養過程中的生根培養基為下述重量配比的原料製成吲哚丁酸 0.2mg
奈乙酸 0.2mg水解酪蛋白 600mg蔗糖 15g1/4MS培養基基本組分 2451.430mg蒸餾水 加至1000ml其他過程與實施例1相同。
實施例四將外植體製備過程中所製備的外植體直接接種在下述重量配比的原料製成的芽生長繁殖培養基中玉米素 0.3mg奈乙酸 0.5mg生物素 5mg赤黴素 0.5mg香蕉鮮汁 10g蔗糖 45gMS培養基基本組分 4696.430mg蒸餾水 加至1000ml該實施例中生根形成試管苗培養過程中的生根培養基為下述重量配比的原料製成奈乙酸1.0mg水解酪蛋白500mg蔗糖 20g1/2MS培養基基本組分 2451.430mg蒸餾水加至1000ml外植體製備、芽生長繁殖培養、生根形成試管苗、馴化移栽過程與實施例相同。
實施例5將芽繁殖培養過程獲得的試管苗轉入生根培養基後，直接進入試管苗馴化移栽過程，試管苗在馴化、練苗的過程中生根，然後移栽於蛭石或珍珠巖、河沙、腐殖質土等組成的營養缽中。第一次澆透水，注意保溫、保溼，並置於塑料棚下，溫度為20±2℃，溼度為95～100％。兩周後，逐漸打開塑料棚，在溫室中繼續生長一個月後，可定植於大田。外植體製備、不定芽誘導培養、芽生長繁殖培養過程與實施例1相同。
為了證明本發明的有益效果，發明人採用了本發明第一個實施例方法以及培養過程中所用的不定芽誘導培養基、芽生長繁殖培養基、生根培養基，進行了實驗室和大田實驗，實驗情況如下一、組織培養實驗1.實驗材料香桂枝條。
2.材料提供單位重慶嘉頓實業股份有限公司。
3.實驗方法將香桂枝條剪成小段，保證每段上有一個芽，按本發明外植體製備過程製備外植體，把所製備的外植體插植於不定芽誘導培養基中，共接種60瓶，每瓶5個外植體，實驗方法以及所用的不定芽誘導培養基與實施例1相同，實驗結果見表1表1 不定芽誘導培養結果表
芽生長繁殖培養將不定芽誘導培養的939個誘導芽轉接於芽生長繁殖培養基中，實驗方法以及所用的芽生長繁殖培養基與實施例1相同，30天後統計實驗結果見表2。
表2 芽生長繁殖培養結果表
生根形成試管苗將芽生長繁殖培養所得的300株苗轉接於生根培養基中，共接種50瓶，每瓶接種6個苗，實驗方法以及所用的生根培養基與實施例1相同，實驗結果見表3。
表3 誘導生根結果表
4.實驗結論①.取香桂的莖尖及側芽作為外植體進行組織培養誘導出芽率達87％，每個外植體平均出芽個數達3.6個。
②.在生長繁殖培養基上香桂試管苗有效繁殖指數可達4.3以上。
③.在本發明提供的生根增減基中，香桂試管苗生根率達94％以上。
二、試管苗馴化移栽實驗當試管苗生長至根系發育良好，具5～8片葉片時，將其移入溫室中馴化2周。移栽前，打開瓶蓋2～3天，加少量水使培養基軟化，取出試管苗，將其根系上的培養基洗乾淨，移栽於蛭石或珍珠巖∶河沙∶腐殖質土＝1∶1∶1組成的營養基質中。第一次澆透水，置於塑料棚下，保持溫度為20±2℃，溼度為95～100％。兩周後，逐漸打開塑料棚，使溼度由95～100％逐漸降低至與溫室中相同，在溫室中繼續生長一個月後，可定植於大田。在所移栽的200株試管苗中，成活株數186株，成活率93％。
權利要求
1.一種香桂組織培養快速繁殖方法，其特徵在於按如下步聚進行(1)外植體製備選擇生長健壯，黃樟油素含量高的優良香桂植株，取其0.5～2.0cm長莖尖或側芽切段，或取其分生組織切塊0.2～3mm，用75％酒精浸泡10～30秒，無菌水衝洗1次，置入0.1％HgCl2溶液中滅菌3～15分鐘，在超淨工作檯上用無菌水衝洗3～5次，每次5分鐘，濾紙吸乾後，作為外植體進行培養；(2)不定芽誘導培養將外植體接種在下述重量配比的原料製成的不定芽誘導培養基中誘導愈傷組織及不定芽產生細胞分裂素0.5～10mg生長素0.05～1.0mg維生素C(或者聚乙烯吡咯烷酮)0.5～10mg生物素1～10mg香蕉鮮汁 2～30g蔗糖 30～60gMS(或1/2MS或1/4MS或LS或White或LS)培養基基本組分2000～5000mg蒸餾水加至1000ml在17～26℃、每日照光8～14小時、光照強度1000～4000lx的條件下培養1～2個月後，將生成的不定芽移入芽生長繁殖培養基中；(3)芽生長繁殖培養將上述(2)步所獲得的不定芽切下接種在下述重量配比的原料製成的芽生長繁殖培養基中細胞分裂素0.05～1.0mg生長素0.01～1.0mg生物素1～10mg赤黴素0～3.0mg香蕉鮮汁 2～30g蔗糖 30～60gMS(或1/2MS或1/4MS或LS或White或LS)培養基基本組分2000～5000mg蒸餾水 加至1000ml在17～26℃、每日照光8～14小時、光照強度1000～4000lx的條件下培養20～40天後，小芽可迅速長大，長大後將其切成帶芽切段，再接種在芽生長繁殖培養基中擴大繁殖，達到一定數量後再將其轉入生根培養基中；(4)生根形成試管苗將從基部切下的無根試管苗插入下述重量配比的原料製成的生根培養基中生長素0.01～5.0mg水解酪蛋白200～1000mg蔗糖 15～50g1/2MS(或1/4)培養基基本組分 2000～3000mg蒸餾水加至1000ml在17～26℃、每日照光8～14小時、光照強度5000～10000lx的條件下培養20～45天後，試管苗生根成苗；(5)試管苗馴化移栽將根系發育良好的試管苗移入溫室，馴化1～2周後，再打開瓶蓋加少量水，練苗2～3天；或者將試管苗直接進入試管苗馴化移栽過程，試管苗在馴化、練苗的過程中生根；把經練苗後的試管苗移栽在溫室中蛭石或珍珠巖、河沙、腐殖質土等組成的營養缽中，以塑料棚覆蓋，2周後再逐漸打開塑料棚，在溫室土壤中生長一個月後，定植於大田。
2.按照權利要求1所述的香桂組織培養快速繁殖方法，其特徵在於A.所說的不定芽誘導培養基中各原料的重量配比是細胞分裂素 1.0～5.0mg生長素 0.2～0.6mg維生素C 3～8mg生物素 3～8mg香蕉鮮汁5～15g蔗糖 30～50gMS(或1/2MS或1/4MS或LS或White)培養基基本組分2400～4700mg蒸餾水 加至1000mlB.所說的芽生長繁殖培養基中各原料的重量配比是細胞分裂素 0.1～0.8mg生長素 0.05～0.5mg生物素 3～8mg香蕉鮮汁 5～20g蔗糖 30～45gMS(或1/2MS或1/4MS或LS或White)培養基基本組分2400～4700mg蒸餾水 加至1000mlC.所說的生根培養基中各原料的重量配比是生長素 0.1～3.0mg水解酪蛋白 400～800mg蔗糖 20～30g1/2MS(或1/4MS)培養基基本組分 2000～2500mg蒸餾水 加至1000ml
3.按照權利要求1所述的香桂組織培養快速繁殖方法，其特徵在於A.所說的不定芽誘導培養基中各原料的重量配比是細胞分裂素 5.5mg生長素 0.2mg維生素C 5mg生物素 4mg香蕉鮮汁10g蔗糖45gMS培養基基本組分4696.430mg蒸餾水 加至1000mlB.所說的芽生長繁殖培養基中各原料的重量配比是細胞分裂素0.3mg生長素0.2mg生物素4mg香蕉鮮汁 10g蔗糖 45gMS培養基基本組分 4696.430mg蒸餾水加至1000mlC.所說的生根培養基中各原料的重量配比是生長素0.5mg水解酪蛋白500mg蔗糖 25g1/2MS培養基基本組分 2451.430mg蒸餾水加至1000ml
4.按照權利要求1或2或3所述的香桂組織培養快速繁殖方法，其特徵在於細胞分裂素是6-苄氨基嘌呤或激動素或玉米素或玉米素核苷。
5.按照權利要求1或2或3所述的香桂組織培養快速繁殖方法，其特徵在於生長素是吲哚丁酸或吲哚乙酸或奈乙酸。
全文摘要
一種香桂組織培養快速繁殖方法,採用香桂的莖尖、側芽及分生組織等為外植體,分別在不定芽分化誘導培養基、芽生長繁殖培養基和生根培養基中培養,快速增殖並獲得完整試管苗,將該試管苗移栽在溫室的蛭石、珍珠巖、河沙、腐殖質土中,經一個月後便可植入大田。採用本發明方法可快速大量繁殖黃樟油素含量高、材質優良的香桂樹苗,實現香桂的工廠化生產。
文檔編號A01H4/00GK1281637SQ0011316
公開日2001年1月31日 申請日期2000年9月4日 優先權日2000年9月4日
發明者張存旭, 胡仕林, 趙其中, 唐躍忠 申請人:重慶喜頓實業股份有限公司