一種用於治療眼部疾病的藥物及其組合物的製作方法

2023-12-10 07:21:57 2

本發明涉及生物化學和蛋白質工程
技術領域：
，具體地說，涉及一種能治療乾眼症候群的藥物及其組合物。
背景技術：
：乾眼症是指任何原因造成的淚液質或量異常或動力學異常，導致淚膜穩定性下降，並伴有眼部不適和(或)眼表組織病變特徵的多種疾病的總稱。又稱角結膜乾燥症。常見症狀包括眼部乾澀、容易疲倦、眼癢、有異物感、灼熱痛感、分泌物黏稠、怕風、畏光及對外界刺激敏感;有時因基本淚液不足，眼部過度乾澀，反而刺激反射性淚液分泌，而造成經常流淚;較嚴重者眼睛會出現紅腫、充血及角質化，角膜上皮剝脫而有絲狀物粘附，這種損傷日久則可造成角結膜病變，並會影響視力。國際乾眼工作組於2007年將乾眼症定義為:多種因素所致的一種淚液和眼表疾病，包括眼表不適症狀，視力變化和淚膜不穩定並且伴有潛在的眼表損害，伴隨淚液滲透壓升高和眼表炎症反應。乾眼症臨床表現為乾澀、眼紅、易疲勞、燒灼感、異物感、畏光、視疲勞及疼痛，嚴重者可引起視力下降甚至失明。乾眼症的發病機制主要有炎症、細胞凋亡、性激素水平失調等，其中炎症是導致乾眼症發病的重要因素。乾眼症治療的終極目標是保護患者的視功能，抑制眼表的炎性反應，恢復眼表面的正常結構及功能。目前的乾眼症治療方法有藥物治療和手術治療，主要以藥物治療為主。常用藥物有人工淚液或自體血清、抗炎藥物等，以滴眼液為主，如重組牛鹼性成纖維細胞生長因子滴眼液，玻璃酸鈉滴眼液等。雖然臨床上使用藥物很多，但都不能達到滿意的治療效果。胸腺素β4（以下簡稱Tβ4）是人體內天然存在的一種小肽類物質，Tβ4在人脾臟、胸腺、肺和腹膜巨噬細胞中的含量最高，其次是腦、肝、腎臟、睪丸和心臟。天然的Tβ4含有43個胺基酸，分子量約5kD，等電點為5.1。近年來胸腺素beta4（Tβ4）為藥物研究的熱點。深入研究已經證明：Tβ4是一種多功能分子，在促進創傷和角膜損傷癒合、心肌修復、促進組織再生、血管生成、抗細胞凋亡和抗炎症等方面起到重要作用。CN100360174C中公開了胸腺素β4（Tβ4）在促進眼睛退化逆轉或抑制眼睛退化的藥物中的應用。SosneG等人報導了胸腺素β4在小鼠乾眼症模型能降低乾眼症狀（ExpertOpiniononBiologicalTherapy,15:sup1,155-161），動物試驗劑量為0.1%。已有報導的胸腺素β4是採用化學合成方法合成的，其結構與天然Tβ4一致，均含有43個胺基酸。其缺點在於化學合成純度低，含有結構類似的有機雜質及無機雜質，會產生毒副作用。同時，化學合成的胸腺素β4臨床上使用劑量大，臨床效果一般。同時，化學合成的多肽產量低，工業化生產難度大，不能滿足臨床使用。本發明人採用基因工程的方法對天然胸腺素β4的N-末端加以定點修飾，易於規模化製備，成本較低，對環境不造成汙染，足以滿足臨床需求。同時，我們出乎意料地發現，獲得的重組人胸腺素β4在治療乾眼症方面活性明顯高於天然胸腺素β4。技術實現要素：本發明中的重組人胸腺素β4是通過基因工程技術生產的多肽類蛋白質藥物，其結構與天然結構不同，含有44個胺基酸，其N-端序列和天然胺基酸N-端不同，將天然胸腺素β4的N-末端的乙醯化去除，並添加一個Gly或Ala，得到的天然胸腺素β4的突變體，增加了體內生物活性。本發明所述的重組人胸腺素β4為序列1和序列2，即Gly-rhTβ4和Ala-rhTβ4。CN100582121C中公開了該衍生物及其胺基酸序列。本發明的一個目的在於，一種含有重組人胸腺素β4的藥物組合物在製備眼科疾病的藥物中的應用，優選地，是乾眼症方面的應用，其特徵在於所述的重組人胸腺素β4的濃度為1μg/mL-1000μg/mL。在一些實施方案中，所述的重組人胸腺素β4的濃度為1μg/mL-500μg/mL。在一些實施方案中，所述的重組人胸腺素β4的濃度為10μg/mL-100μg/mL。本發明的另一個目的在於，所述的藥物組合物含有藥學上可接受的載體。所述的藥物載體包括pH調節劑、滲透壓調節劑、促進吸收劑、無菌注射用水的一種或幾種。本發明中所述的pH調節劑包括鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉的一種或幾種。本發明所述的滲透壓調節劑為用於調節滲透壓的試劑，包括但不限於氯化鈉、葡萄糖、山梨醇、甘油、PEG、丙二醇、甘露醇、硼酸、硼砂、硫酸鈉的一種或幾種。本發明所述的促進吸收劑包括但不限於亞碸類，吡咯烷酮類、脂肪酸及其酯、表面活性劑、丙二醇、甘油等的一種或幾種，優選地為丙二醇，甘油，氮卓，環糊精，卵磷脂、豆磷脂、磷脂醯甘油、磷脂醯乙醇胺的一種或幾種。本發明的另一個目的在於，所述的藥物用於局部給藥。本發明的另一個目的在於，所述的藥物組合物的形式可以為滴眼液、凝膠、溶液、乳膏、軟膏、洗劑、凍乾粉，優選為滴眼液、凝膠。附圖說明圖1：rh-Tβ4對大鼠乾眼症模型治療後的眼前節照相結果圖2：rh-Tβ4對大鼠乾眼症模型治療後的角膜HE和PAS染色結果以下實施例用來說明本發明，但不用來限制本發明。實施例實施例一通過RT-PCR測定rhTβ4對MUC5AC、MUC1mRNA基因表達的影響藥物來源：本實驗中的天然β4是通過化學合成獲得，重組人胸腺素β4由北京諾思蘭德生物技術股份有限公司提供，分別為Gly-rhTβ4和Ala-rhTβ4，每種樣品各兩個規格（50,100μg/mL）。從眼庫取捐獻眼球分離結膜細胞，並進行結膜杯狀細胞體外培養及純化，培養過程中加入不同的胸腺素β4（Gly-rhTβ450μg/mL,Gly-rhTβ4100μg/mL，Ala-rhTβ450μg/mL,Ala-rhTβ4100μg/mL）,天然Tβ4即化學合成Tβ4（0.1%即1mg/mL，作為陽性對照），陰性對照組(negativecontrol)給予PBS。通過RT-PCR和Westernblot測定了胸腺素β4對黏蛋白表達相關基因MUC5AC、MUC1mRNA的影響。體外實驗結果表明：rh-Tß4能促進人杯狀細胞的增殖，促進MUC5AC和MUC1mRNA的表達，並促進MUC1黏蛋白的表達。四組試驗組與陽性對照組相比，MUC5AC的表達均有顯著性差異，P<0.05，MUC1的表達也明顯高於陽性對照組。Gly-rhTβ4組和Ala-rhTβ4組MUC5AC、MUC1基因表達結果相似。檢測結果見表1。表1RT-PCR測定MUC5AC、MUC1基因的表達分組劑量MUC5AC（2^ΔΔCT）MUC1（2^ΔΔCT）NegativeControl--1±01±0陽性對照組Tβ41mg/mL0.62±0.301.32±0.27Gly-rhTβ450ug/mL1.61±0.77*1.52±0.31Gly-rhTβ4100ug/mL1.65±0.421.57±0.43Ala-rhTβ450ug/mL1.60±0.40*1.54±0.26Ala-rhTβ4100ug/mL1.69±0.25*1.63±0.24註：與陽性對照組相比,*P<0.05。實施例二rh-Tβ4對大鼠乾眼症模型角膜螢光素鈉評分結果用0.3%苯扎氯銨製備的大鼠乾眼症模型，乾眼症動物隨機分為6組，每組6隻，分別給予rh-Tβ4（Gly-rhTβ450μg/mL,Gly-rhTβ4100μg/mL，Ala-rhTβ450μg/mL,Ala-rhTβ4100μg/mL）、天然Tβ4(0.1%即1mg/mL，陽性對照組）和PBS（陰性對照組），每日滴加3次，連續給藥7天。觀察rh-Tβ4對角膜螢光素鈉評分。結果顯示，rh-Tß4及陽性對照組同陰性對照組比較，評分有下降趨勢，且Gly-rhTβ4100µg/mL劑量組和Ala-rhTβ4100µg/mL劑量組同陰性對照組比較差異顯著（p<0.05）。Ala-rhTβ4100µg/mL劑量組、Gly-rhTβ450µg/mL劑量組和Gly-rhTβ4100µg/mL劑量組同陽性對照組比較，結果有顯著差異。結果見表2。表2角膜螢光素鈉評分註：與陰性對照組相比,*P<0.05。實施例三rh-Tβ4對大鼠乾眼症模型治療後裂隙燈眼前節照相、螢光素鈉染色評分結果用0.3%苯扎氯銨製備的大鼠乾眼症模型，乾眼症動物隨機分為6組，每組6隻，分別給予不同的rh-Tβ4（Gly-rhTβ450μg/mL,Gly-rhTβ4100μg/mL，Ala-rhTβ450μg/mL,Ala-rhTβ4100μg/mL）、天然Tβ4(0.1%即1mg/mL，陽性對照組）和PBS（陰性對照組），每日滴加3次，連續給藥7天。結果見圖1。螢光素鈉染色檢查結果可見，Gly-rhTβ4100µg/mL劑量組和Ala-rhTβ4100µg/mL劑量組角膜修復作用最明顯，與陽性對照藥有顯著差異，Gly-rhTβ450µg/mL劑量組與陽性對照組基本一致，而Ala-rhTβ450µg/mL和陰性對照組無明顯差異。實施例四病理檢查結果rh-Tβ4對大鼠乾眼症模型治療後的角膜HE和PAS染色結果即病理學檢查結果見圖2。正常組：HE染色的角膜和結膜上皮可見正常組織結構，PAS染色中杯狀細胞可見；模型組：角膜和結膜上皮脫落；陰性對照組：上皮組織有一定程度的修復，可見少量杯狀細胞；陽性對照組：上皮組織修復較好，可見杯狀細胞；Ala-rhTβ450ug/mL組：上皮組織有一定程度的修復，但不明顯；Ala-rhTβ4100ug/mL組：上皮細胞修復較完善，杯狀細胞分布均勻；Gly-rhTβ450µg/mL組：上皮組織修復較好，可見杯狀細胞；Gly-rhTβ4100µg/mL組：上皮細胞修復較完善，杯狀細胞分布均勻；結論：Gly-rhTβ4100ug/mL組和Ala-rhTβ4100µg/mL組上皮組織修復較好，基本接近正常，且優於陽性對照組。北京諾思蘭德生物技術股份有限公司一種用於治療眼部疾病的藥物及其組合物2144PRT人工序列1GlySerAspLysProAspMetAlaGluIleGluLysPheAspLys151015SerLysLeuLysLysThrGluThrGlnGluLysAsnProLeuPro202530SerLysGluThrIleGluGlnGluLysGlnAlaGlyGluSer3540244PRT人工序列2AlaSerAspLysProAspMetAlaGluIleGluLysPheAspLys151015SerLysLeuLysLysThrGluThrGlnGluLysAsnProLeuPro202530SerLysGluThrIleGluGlnGluLysGlnAlaGlyGluSer3540當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp