一種棒狀桿菌啟動子探測載體及其構建方法和應用的製作方法

2023-12-10 06:20:32

專利名稱：一種棒狀桿菌啟動子探測載體及其構建方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種啟動子探測載體及其構建方法和應用，特別是一種棒狀桿菌啟動 子探測載體以及應用該載體篩選到的強啟動子，屬於微生物基因工程領域。
背景技術：
棒狀桿菌是一類革蘭氏陽性菌，屬於具有中度到高GC含量的放線菌。自人們首次 分離穀氨酸棒狀桿菌生產L-穀氨酸以來(Kinoshita等，1957年)，棒狀桿菌的三個主要代 表穀氨酸棒狀桿菌，黃色短桿菌，和乳糖發酵短桿菌，已經被廣泛用於生產胺基酸。這裡 特別指出，通過DNA-DNA雜交實驗發現，這三個不同物種之間只有很小的差別(Liebl等， 1991)。由於已累計了大量的關於穀氨酸棒狀桿菌生理學，生物化學和遺傳學知識 (Eggeling andBott,2005 ；Burkovski，2008)，代謝工程已經取代經典的隨機突變，成為棒 狀桿菌菌種改良的主要策略。應用表達載體對胺基酸生物合成途徑中的限速酶編碼基因的 過表達，是代謝工程最常用的策略之一。目前幾乎所有的現存棒狀桿菌表達載體都使用大 腸桿菌啟動子如lacUV5、trp、tac、λ PkP1和araBAD啟動子來表達外源基因(Srivastava and Deb, 2005)；然而，在棒狀桿菌中，這些啟動子的活性較弱，外源基因在他們的控制下的 表達水平通常不高，這會限制胺基酸的產量。因此，應用探測載體尋找用於棒狀桿菌代謝工 程改造的強啟動子，具有重要的意義。在本發明中，我們首先構建了一個新的棒狀桿菌啟動子探測載體pDXW-11，應用該 載體探測了四種已知的啟動子PilvA，Pkan, PF104, tac以及兩種我們設計tac衍生物，即 tac-Ml, tac-M啟動子在黃色短桿菌中的活性。我們發現tac_M啟動子在黃色短桿菌中能 高水平表達報告基因cat編碼的氯黴素醯基轉移酶CAT。tac-M啟動子是一個適用於棒狀 桿菌代謝工程研究的強啟動子，它的發現具有如下的重要意義目前棒狀桿菌中存在的使 用tac啟動子控制外源基因表達的弱表達載體，可以通過定點突變技術，轉變成使用tac-M 啟動子的強表達載體。

發明內容
本發明提供了一種棒狀桿菌啟動子探測載體及其構建方案，通過此探測載體篩選 到一個強啟動子。一種本發明所要解決的技術問題是提供一種棒狀桿菌啟動子探測載體pDXW-11。本發明所述的探測載體包括篩選標記、複製子片段及多克隆位點，其特徵在於含 有用於檢測外源DNA片段啟動子活性的氯黴素醯基轉移酶基因(cat)；用於控制報告基因 上遊啟動子轉錄通讀的rrnBTlT2終止子序列。探測載體pDXW-11含有使質粒能在棒狀桿菌宿主中複製並穩定存在的rep片段， 從4786位到2010位。探測載體pDXW-11含有用於棒狀桿菌轉化子選擇的抗性標記卡那黴素標記抗性基因kan，從5789位到6604位。探測載體PDXW-Il含有用於檢測外源DNA片段啟動子活性報告基因cat，從823位 到164位。探測載體PDXW-Il含有用於控制報告基因上遊啟動子轉錄通讀的rrnBTlT2終止 子序列，其中rrnBTl從1121位到1080位，rrnBT2從947位到940位。本發明提供的表達載體pDXW-11，{Escherichia coli DH5 α (pDXff-11)}已保 藏於中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏編號CCTCC NO =M 2010006保藏日期 2010-1-13。本發明所要解決的另一個技術問題是提供表達載體pDXW-11的構建方法。為解決上述問題，所採用的技術方案是第一步用限制酶XbaI和BglI雙酶切載體pET28a，去除含IacI基因及T7啟動 子的DNA片段，將大片段自身環化，構建成的重組質粒命名為pDXW-Ι ；第二步以質粒大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭質粒pC2為模板，rep-F和r印-R為引 物，通過PCR擴增2686bp的棒狀桿菌複製子片段r印，PCR產物用SmaI酶切，並連接到用 BstZ17I酶切，且用CIAP去磷酸化後的pDXW-Ι上，構建的穿梭載體命名為為pDXW_2 ；第三步以含有cat基因的載體為模板，cat-F和cat-R為引物，通過PCR擴增 686bp報告基因cat的開放閱讀框，在擴增產物的5'和3'末端分別引入限制酶內切酶 酶切位點，PCR產物用引入的限制性內切酶雙切，並連接到用同樣限制性內切酶雙切後的 pDXff-2上，構建的重組質粒命名為pDXW-2-cat ；第四步以含有終止子rrnBTlT2的載體為模板，rrnBTlT2_F和rrnBTlT2_R為引 物，通過PCR擴增294bp的終止子π·ηΒΤ1Τ2，在擴增產物的5'和3'末端分別引入限制酶 內切酶酶切位點，PCR產物用引入的限制性內切酶雙切，並連接到同樣用同樣限制性內切酶 雙切後的pDXW-2-cat上，構建的重組質粒命名為pDXW-11。本發明所要解決的另一個技術問題是提供一個應用棒狀桿菌啟動子探測載體篩 選得到的強啟動子tac-M，該啟動子根據雜合性啟動子tac進行人工改造後得到，其核苷酸 序列為 SEQ ID NO :2ο所述啟動子通過寡核苷酸鏈退火法獲得。本發明的有益效果本發明的探測載體pDXW-11在大腸桿菌及棒狀桿菌中皆能穩定存在，可用於檢測 DNA片段在棒狀桿菌中有無啟動子活性及活性的相對大小；應用本發明構建的探測載體， 篩選到一種在棒狀桿菌中能高效表達外源基因的強啟動子tac-M，解決了目前棒狀桿菌啟 動子普遍較弱的問題，尤其適用於棒狀桿菌生產次生代謝產物的研究和生產。


圖1表達載體pDXW-11的構建。圖2表達載體pDXW-11的構建。圖3不同黃色短桿菌菌株全蛋白SDS-PAGE圖。圖4不同黃色短桿菌菌株CAT活性圖。圖5啟動子探測載體pDXW-11的物理圖譜。
具體實施例方式實施例1表達載體pDXW-11的構建表達載體pDXW-10的構建過程如圖1，2所示。第一步，以表達載體pET28a(NOVagen，USA)為基礎，去除IacI基因及T7啟動子， 構建質粒PDXW-I (圖1)。用限制酶XbaI和BglI雙酶切載體pET28a，將獲得的大片段純化， 用T4連接酶將大片段自身環化，構建成的重組質粒大小為3524bp，命名為pDXW-Ι (圖1)；第二步，構建穿梭載體pDXW_2(圖1).以質粒大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭質粒 pC2 (Goyal etal.，1996Plasmid. 36 :62_66)為模板，r印-F 和 r印-R 為引物，通過 PCR 擴增 2686bp的棒狀桿菌複製子片段r印，在擴增產物的5』和3』末端引入限制酶SmaI酶切位點。 PCR 擴增反應體系為 50 μ 1，包括 10 μ 15 X PrimerSTAR buffer (Mg2+plus)，4 μ 1 dNTP 混合 物(各2. 5mM)，ly 1質粒模板pC2(100ng/y 1)，1μ 1正向引物r印-F (20 μ Μ)，1 μ 1反向引 物 r印-R (20 μ Μ), 0. 5 μ 1 PrimeSTAR HS DNA Polymerase ；反應程序94°C預變性分鐘； 94°C變性30秒，60°C退火15秒，72°C延伸2分45秒，35個循環；72°C再延伸10分鐘；10°C 保存。PCR產物用SmaI酶切，並連接到用BstZ17I酶切，且用CIAP去磷酸化後的pDXW_l， 由此產生的穿梭載體大小為6216bp，命名為為pDXW-2。第三步，向質粒pDXW-2引入將報告基因cat，cat編碼氯黴素醯基轉移酶(CAT) (圖 2)。以質粒 pDXW-10-cat (Xu et al. ,2010FEMS Microbiology letters. In review) 為模板，帶有三個串聯終止密碼子和SD序列的引物cat-F和cat-R為引物，通過PCR擴增 686bp報告基因cat的開放閱讀框，在擴增產物的5'和3'末端分別引入限制酶NotI和 XhoI 酶切位點。PCR擴增反應體系為 50 μ 1，包括 10 μ 1 5 X PrimerSTAR buffer (Mg2+plus)， 4 μ 1 dNTP 混合物(各 2. 5mM)，1 μ 1 質粒模板 pDXff-10-cat (IOOng/ μ 1)，1 μ 1 正向引物 cat-F(20yM)，ly 1 反向引物 cat-R(20yM)，0. 5μ 1 PrimeSTAR HS DNA Polymerase ；反 應程序94°C預變性分鐘；94°C變性30秒，54°C退火15秒，72°C延伸45秒，35個循環；72°C 再延伸10分鐘；10°C保存。PCR產物用NotI和XhoI雙切，並連接到同樣用NotI和XhoI雙 切後的pDXW-2，構建的重組質粒大小為6901bp，命名為pDXW-2-cat (圖2)。第四步，為了消除報告基因上遊pDXW-2自身序列對報告基因轉錄的幹擾，在cat 上遊的多克隆位點前面引入轉錄終止子rrnBTlT2(圖2)。以質粒pKK223_3 (Pharmacia， Sweden)為模板，rrnBTlT2_F和rrnBTlT2_R為引物，通過PCR擴增294bp的終止子 rrnBTlT2，在擴增產物的5'和3'末端分別引入限制酶NheI和BamHI酶切位點。PCR擴 增反應體系為 50μ 1，包括 10μ 1 5 X PrimerSTAR buffer (Mg2+plus), 4 μ 1 dNTP 混合物 (各 2. 5mM), 1 μ 1 質粒模板 pKK223-3(100ng/y 1)，1 μ 1 正向引物 rrnBTlT2_F(20 μ Μ)， 1 μ 1 反向引物 rrnBTlT2-R(20 μ Μ)，0· 5 μ 1 PrimeSTAR HS DNA Polymerase ；反應程序 94°C預變性分鐘；94°C變性30秒，44°C退火15秒，72°C延伸20秒，35個循環；72°C再延伸 10分鐘；10°C保存。PCR產物用NheI和BamHI雙切，並連接到同樣用NheI和BamHI雙切 後的pDXW-2-cat，構建的重組質粒即為最終的啟動子探測載體，其大小為7163bp，命名為 pDXW-11，物理圖譜見圖5，構建過程中使用的引物序列如下rep-F agtacccgggcattgtcaacaacaag acccatcarep-R agtacccggggtctacgtctgatgct ttgaatcg
cat-F aactagcggccgctaactaactaagaaaggacatgaacgatggagacat-R actactcgagttacgccccgccctgccactrrnBTlT2-F :atctagctagccgatggtagtgtggggtctcrrnBTlT2-R :agttggatccagaaaaataaacaaaagagt實施例2應用探測載體pDXW-11探測啟動子為了證明pDXW-11的可用性並且尋找能在棒狀桿菌中高效表達的啟動子，在黃色 短桿菌中，我們對六個不同類型的異源啟動子PilvA，Pkan, PF104, tac,, tac-Ml和tac_M進 行了活性檢測。？…八是穀氨酸棒桿菌染色體上蘇氨酸脫氫酶基因ilvA的啟動子序列；Pkan 是來自轉座子Tn5的啟動子序列；PF104是來自穀氨酸棒桿菌噬菌體Φ GAl的啟動子序列； tac是雜合性啟動子；tac-Ml和tac_M是我們自己設計的tac啟動子的衍生物。首先，設計合成啟動子寡核苷酸單鏈序列，並且在序列中引入限制性酶切位點，應 用寡核苷酸鏈退火法獲得啟動子雙鏈DNA序列。寡核苷酸單鏈序列包括PilvA_F、PilvA_R，用 於通過寡核苷酸鏈退火法獲得PilvA啟動子雙鏈DNA序列；PF104-F、PF104-R，用於通過寡核 苷酸鏈退火法獲得PF104啟動子雙鏈DNA序列；Pkan-F、Pkan-R,用於通過寡核苷酸鏈退火法 獲得Pkan啟動子雙鏈DNA序列；tac-F、tac_R，用於通過寡核苷酸鏈退火法獲得tac啟動子 雙鏈DNA序列。為了能夠克隆到啟動子探測載體的多克隆位點，所有啟動子序列的5'和 3'末端都分別引入了限制性切點BamHI和HindIII0將PilvA，Pkan, PF104, tac啟動子雙鏈 DNA序列用BamHI和HindIII雙切，並連接到同樣用BamHI和HindIII雙切後的啟動子探測 載體 pDXW-11，獲得的重組質粒分別命名為 pDXW-1 l-PilvA，pDXff-Il-Pkan, pDXW-ll_PF104 和 pDXW-11-tac。將 pDXW-1 l-PilvA，pDXff-11-Pkan, pDXff-11-PF104 和 pDXW-ll-tac 轉化黃色短 桿菌 B. flavumATCC14067,分別形成菌株 14067/pDXff-ll-PilvA, 14067/pDXff-lI-Pkan, 14067/ pDXW-11-PF104和14067/pDXW-ll_tac。將ImL過夜培養的上述黃色短桿菌菌株分別接種 到30mL含卡那黴素的LBG培養基中，培養物生長到在600nm光密度為1. 5時，離心收穫 細胞並懸浮在 5mL Tris-HCl 緩衝液(lOOmM，ρΗ7· 8)中。用 Constant Cell Disruption Systems (Constant Systems, Daventry, UK)，在20KPSI條件下，破碎細胞，離心除去細胞碎 片，粗提物用於SDS-PAGE和CAT蛋白的生物活性分析。SDS-PAGE結果顯示所有樣品都沒 有出現與預測的分子量約為25kD特異性CAT蛋白條帶(報告基因cat的編碼產物)(圖3)， 這意味著檢測的啟動子在黃色短桿菌中活性不是很強。為了進一步證明上述檢測的啟動 子是否具有活性以及活性相對大小，我們應用Shaw(1975)等的方法，分別對上述4個菌株 粗提物進行了 CAT的生物活性檢測。結果顯示14067/pDXW-ll-PilvA，14067/pDXW-lI-Pkan, 14067/pDXff-ll-PF104 和 14067/pDXW-ll-tac 樣品的 CAT 的相對活性分別為 0. 086,0. 785、 0. 128,0. 467U(mg protein—1) (Fig. 4)。結合SDS-PAGE圖譜及CAT活性測定數值進行分析 可得出結論PilvA，Pkan, PF104, tac啟動子在黃色短桿菌中都具有活性，但活性水平不高。然後，為了發現適用於棒狀桿菌代謝工程研究的強啟動子，我們設計了兩個tac 啟動子的衍生物tac-Ml和tac-M。tac、tac-Ml和tac_M啟動子的差別僅在於其延伸 的"10區序列，他們的延伸的-10區序列分別為gctcgtataa tgt、tgtgctataa tgg禾口 tgtggtacca tgt。我們應用寡核苷酸鏈退火法獲得tac-Ml和tac_M啟動子雙鏈DNA序 列，序列的5'和3'末端都分別引入了限制性切點BamHI和Hindlll。寡核苷酸單鏈 序列包括tac-Ml-F、tac-Ml-R,用於通過寡核苷酸鏈退火法獲得tac_Ml啟動子雙鏈DNA序列；tac-M-F、tac-M-R，用於通過寡核苷酸鏈退火法獲得tac_M啟動子雙鏈DNA序 列。將tac-Ml和tac-M啟動子雙鏈DNA序列用BamHI和HindIII雙切，並連接到同樣 用BamHI和HindIII雙切後的啟動子探測載體pDXW_ll，獲得的重組質粒分別命名為 pDXff-11-tac-Ml 和 pDXW-ll-tac_M2。將 pDXW-11-tac-Ml 和 pDXW-ll-tac_M2 轉化黃色短 桿菌 B. flavumATCC14067，分別形成菌株 14067/pDXff-ll-tac-Ml 和 14067/pDXW-ll-tac-M。 將ImL過夜培養的黃色短桿菌菌株14067/pDXff-ll-tac-Ml和14067/pDXW-ll-tac-M分別 接種到30mL含卡那黴素的LBG培養基中，培養物生長到在600nm光密度為1. 5時，離心收 獲細胞並懸浮在 5mL Tris-HCl 緩衝液(lOOmM，pH7. 8)中。用 Constant Cell Disruption systems (Constant Systems, Daventry, UK)，在 20KPSI 條件下，破碎細胞，離心除去細胞 碎片，粗提物用於SDS-PAGE和CAT蛋白的生物活性分析。SDS-PAGE結果顯示14067/ pDXW-11-tac-M樣品顯示了分子量約為25kD的CAT蛋白條帶(圖3)，說明tac_M啟動子在 黃色短桿菌中能高效表達活性很強。為了進一步證明tac-Ml和tac-M啟動子活性相對大 小，我們應用Shaw(1975)等的方法，分別對上述2個菌株粗提物進行了 CAT的生物活性檢 測。結果顯示14067/pDXW-ll-tac-Ml和14067/pDXW-ll-tac-M樣品的CAT的相對活性分 別為0. 602,5. 526U(mg protein—1)(圖4)。結合SDS-PAGE圖譜及CAT活性測定數值進行 分析可得出結論tac-M啟動子在黃色短桿菌中是一個強啟動子。用於獲得啟動子雙鏈DNA的寡核苷酸單鏈序列如下PiivA-F :agcggatcccaaagtaggtgcaattctaggagaagattacactagtcaaccatgagtgaaaa gcttagcPiivA-R :gctaagcttttcactcatggttgactagtgtaatcttctcctagaattgcacctactttggg atccgctPF104-F :aataggatcccagcgtatttgaccgatccggacacctgggataatgtgtggattttgtcgg aagctttaatPF104-R :attaaagcttccgacaaaatccacacattatcccaggtgtccggatcggtcaaatacgctg ggatcctattPkan-F acttggatccccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaaa gcttaatgPkan-R cattaagcttttgcagggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccgggg atccaagt tac-F atatggatcctgagetgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgage ggataacaattaagctttaaatac-R tttaaagcttaattgttatccgctcacaattccacacattatacgagccgatgattaattg tcaacagctcaggatccatattac-Ml-F agetggatcctgagetgttgacaattaatcatcgtgtgctataatgggtggaattgtgag cggataacaattaagcttagcttac-Ml-R :agctaagcttaattgttatccgctcacaattccacccattatagcacacgatgattaatt gtcaacagctcaggatccagcttac-M-F agetggatcctgagetgttgacaattaatcatcgtgtggtaccatgtgtggaattgtgag cggataacaattaagcttagct
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tacagggcgcgtcccattcgcca7163
2
62
DNA
人工序列
2
tgagctgttg￡10￡1￡Ι ￡1￡Ι 0atcgtgtggtaccatgtgtggaattgtgagcggataacaa60
tt62
1權利要求
一種棒狀桿菌啟動子探測載體，包括篩選標記、複製子片段及多克隆位點，其特徵在於含有用於檢測啟動子活性的氯黴素醯基轉移酶報告基因(cat)；多克隆位點後為用於控制報告基因上遊啟動子轉錄通讀的rrnBT1T2終止子序列。
2.根據權利要求1所述的探測載體，其特徵在於其核苷酸序列為SEQID NO :1。
3.權利要求1，2任一所述的探測載體的構建方法，其特徵在於包括如下步驟 第一步用限制酶XbaI和BglI雙酶切載體pET28a，去除含IacI基因及T7啟動子的DNA片段，將大片段自身環化，構建成的重組質粒命名為pDXW-Ι ；第二步以質粒大腸桿菌_棒狀桿菌穿梭質粒PC2為模板，rep-F和rep-R為引物，通 過PCR擴增2686bp的棒狀桿菌複製子片段r印，PCR產物用SmaI酶切，並連接到用BstZ17I 酶切，且用CIAP去磷酸化後的pDXW-Ι上，構建的穿梭載體命名為為pDXW-2 ；第三步以含有氯黴素醯基轉移酶基因(cat)的載體為模板，cat-F和cat-R為引物， 通過PCR擴增686bp報告基因cat的開放閱讀框，在擴增產物的5'和3'末端分別引入限 制酶內切酶酶切位點，PCR產物用引入的限制性內切酶雙切，並連接到用同樣限制性內切酶 雙切後的PDXW-2上，構建的重組質粒命名為pDXW-2-cat ；第四步以含有終止子rrnBTlT2的載體為模板，rrnBTlT2_F和rrnBTlT2_R為引物，通 過PCR擴增294bp的終止子π·ηΒΤ1Τ2，在擴增產物的5'和3'末端分別引入限制酶內切酶 酶切位點，PCR產物用引入的限制性內切酶雙切，並連接到同樣用同樣限制性內切酶雙切後 的pDXW-2-cat上，構建的重組質粒命名為pDXW-11。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於第一步中的2種限制性內切酶為NotI和 Xhol，第二步中的2種限制性內切酶為NheI和BamHI。
5.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於使用下述引物對 rep-F :agtacccgggcattgtcaacaacaag acccatcarep-R :agtacccggggtctacgtctgatgct ttgaatcg cat-F :aactagcggccgctaactaactaagaaaggacatgaacgatggaga cat-R :actactcgagttacgccccgccctgccact rrnBTlT2_F :atctagctagccgatggtagtgtggggtctc rrnBTlT2-R :agttggatccagaaaaataaacaaaagagt
6.一種應用棒狀桿菌啟動子探測載體篩選得到的強啟動子tac-M，其特徵在於該啟動 子根據雜合性啟動子tac進行人工改造後得到，其核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
7.根據權利要求6所述的tac-M啟動子，其特徵在於採用寡核苷酸鏈退火法獲得。
全文摘要
本發明公開了一種棒狀桿菌啟動子探測載體及其構建方法和應用，屬於基因工程技術領域。本發明的棒狀桿菌啟動子探測載體pDXW-11，可用於篩選能在棒狀桿菌中高效表達的啟動子，通過質粒的探測，篩選到一種棒狀桿菌強啟動子tac-M，在棒狀桿菌中能高效表達，尤其適用於棒狀桿菌代謝產物的研究和生產。
文檔編號C12N15/77GK101985631SQ20101010846
公開日2011年3月16日 申請日期2010年2月10日 優先權日2010年2月10日
發明者徐大慶, 李燁, 王小元, 譚延振 申請人:江南大學