加強了toyG表達的重組澱粉酶產色鏈黴菌及構建方法與用途
2023-12-10 06:20:07 1
加強了toyG表達的重組澱粉酶產色鏈黴菌及構建方法與用途
【專利摘要】本發明公開了一種加強了toyG表達的重組澱粉酶產色鏈黴菌及構建方法與用途。它過量表達了生物合成豐加黴素的關鍵酶-腺苷琥珀酸合成酶編碼基因toyG，具有比澱粉酶產色鏈黴菌(Streptomycesdiastatochromogenes)1628更高的豐加黴素合成能力。構建過程如下：1）構建表達載體pIB139-toyG；?2）利用接合轉移法將所述的表達載體整合入澱粉酶產色鏈黴菌染色體，獲得所述的工程菌。利用pIB139載體上的啟動子permE*啟動toyG基因的表達，利用接合轉移法將載體pIB139-toyG特異性的整合入澱粉酶產色鏈黴菌(Streptomycesdiastatochromogenes)1628的染色體，獲得了遺傳穩定的工程菌。與原始菌株相比，重組菌腺苷琥珀酸合成酶酶活提高了至少1.2倍，豐加黴素產量至少提高27.1%。
【專利說明】加強了 toyG表達的重組澱粉酶產色鏈黴菌及構建方法與
用途【技術領域】
[0001]本發明涉及通過加強toyG基因在澱粉酶產色鏈黴菌的表達提高豐加黴素產量，屬於基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]豐加黴素是一種新型核苷類抗生素，分子式為C12H13N5O4,核糖C1連接類似鳥嘌呤的脫氮雜嘌呤環，核心結構為吡咯嘧啶核苷類似物。作用機理主要是通過抑制微生物的轉錄而影響菌體的生長，其生物活性研究報導主要集中在臨床醫學領域。近期有研究發現豐加黴素對多種植物疫病具有良好的防治效果，長期使用不會造成環境汙染，而且對植物生長也具有一定的調節作用。因此，豐加黴素在農業植物病害防治領域具有的應用潛力。相對於化學合成法，生物法合成豐加黴素以可再生資源為原料，具有反應條件溫和、汙染少以及成本低廉等優點，因此，生物合成法是目前豐加黴素工業化生產比較經濟有效的方法。
[0003]豐加黴素屬於次級代謝產物，合成途徑複雜，受到多種因素的限制與調控，導致豐加黴素合成水平較低，難以規模化生產。解決該問題的現有辦法一般都是通過傳統的誘變育種作為主要手段篩選高產優質的生產菌株，但篩選到高效菌株的不確定因素多、周期長。
[0004]如何利用分子生物學等先進的技術手段改良微生物進一步提高豐加黴素的產量成為一條可行的思路。McCarty等人以一株合成豐加黴素菌株Streptomyces rimosus(ATCC14673)為起始研究對象，克隆了生物合成豐加黴素基因簇，闡明了豐加黴素的合成過程及調控機制，研究發現豐加黴素由GTP為前體，經多步反應合成豐加黴素，其中由toyG基因編碼的腺苷琥珀酸合成酶是代謝途徑的關鍵酶之一。但是利用代謝工程技術通過增加豐加黴素代謝通量而進一步提高豐加黴素產量因為涉及表達體系的建立等複雜問題未見相關報導。
【發明內容】
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[0005]為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種加強了 toyG表達的重組澱粉酶產色鏈黴菌及構建方法與用途。
[0006]澱粉酶產色鏈黴菌iStreptomyces dias ta tochromogenes) 1628 是一株拮抗放線菌，其發酵液對多種植物病原真菌具有較強的抑制作用，經分離提取，確定其主要有效成分為豐加黴素，尚未見澱粉酶產色鏈黴菌的代謝工程分子改造方面的的研究報導。
[0007]本發明首先從以澱粉酶產色鏈黴菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628(菌株的保藏編號為CGMCC N0.2060)中克隆出編碼腺苷琥珀酸合成酶的toyG基因，並將該基因與鏈黴菌整合型質粒PIB139連接，成功構建了攜帶基因的重組載體pIB139-1o_FG，並利用接合轉移法將其特異性的整合在澱粉酶產色鏈黴菌1628染色體上。
[0008]一種澱粉酶產色鏈黴菌的toyG基因，他的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]一種加強了 toyG表達的重組澱粉酶產色鏈黴菌，它表達了生物合成豐加黴素的關鍵酶一腺苷琥拍酸合成酶編碼基因io_FG,具有比澱粉酶產色鏈黴菌i^treptomycesdi as ta tochromogenes) 1628更高的豐加黴素表達能力。
[0010]所述的原始菌為澱粉酶產色鏈黴菌(Streptomyces diastatochromogenes) 16280
[0011]所述的腺苷琥珀酸合成酶編碼基因toyG來自於待重組的原始菌澱粉酶產色鏈黴菌(S trep tomyces di as ta tochromogenes)。
[0012]所述的腺苷琥珀酸合成酶編碼基因toyG整合入原始菌澱粉酶產色鏈黴菌染色體。
[0013]所述的加強了 toyG表達的重組澱粉酶產色鏈黴菌的構建方法，過程如下:
1)構建表達載體pIB139-toyG；
2)利用接合轉移法將所述的表達載體整合入澱粉酶產色鏈黴菌染色體，獲得所述的工程菌。
[0014]利用PIB139載體上的啟動子permE*啟動toyG基因的表達，利用接合轉移法將載體pIB139_toyG特異性的整合入澱粉酶產色鏈黴菌^Streptomycesdi as ta tochromogenes) 1628的染色體，獲得了遺傳穩定的工程菌。
[0015]所述的加強了 toyG表達的重組澱粉酶產色鏈黴菌的用途，與原始菌株相比，重組菌腺苷琥珀酸合成酶酶活至少提高了 1.2倍，豐加黴素產量至少提高了 27.1%。
[0016]本發明的有益 效果:
本發明加強豐加黴素生物合成途徑關鍵酶基因toyG在澱粉酶產色鏈黴菌中過量表達後，重組菌腺苷琥珀酸合成酶酶活提高了 1.2倍，合成豐加黴素的能力比原始菌提高了
27.1%。為進一步提高豐加黴素產量，早日實現工業化生產奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1是重組質粒pIB139-toyG的構建示意圖。
[0018]圖2是重組質粒pMD18-T_toyG的酶切驗證圖。
[0019]1.toyG 基因；2.pMD18-T_toyG/M/e l+Not I ；3.DNA Marker DL2000。
[0020]圖3是toyG基因在厶coli BL21的SDS-PAGE分析圖。
[0021]1.\>K[2Sa-toyG/E.coli BL21 誘導；2.Protein Marker ;3.pET28a-1oj^6,/￡'.coliBL21未誘導。
[0022]圖4是重組穿梭表達質粒pIB139_toyG的酶切電泳驗證圖。
[0023]1.toyG gene ；2.pIB139-toyG/M/e l+Not I ；3.pIB139/M/e l+Not I ；4.λ DNA/Η?η? III Marker。
[0024]圖5是重組菌1628-T0YG的PCR電泳驗證圖。
[0025]1.原始菌株；2-5.基因工程菌株；6.DL2000 Marker。
[0026]具體實施方法
以下結合附圖和【具體實施方式】對本發明做進一步的說明。
[0027]實施例1:目的基因的擴增及重組澱粉酶產色鏈黴菌的構建
以 51 di as ta tochromogenes 1628 染色體基因組為模板，以 PtoyG F Nde I 和 PtoyGR Not I為引物，PCR擴增獲得含有Λ汝I和Afoi I兩個酶切位點的toyG基因，與pMD18_TVector 連接，構建克隆載體pMD18-T-toyG0We I + Not I )，將克隆載體pMD18-T_toyG0WeI + Not I)轉化至受體大腸桿菌中，塗布於含氨苄抗性的LB瓊脂平板上，37 1:培養過夜後，隨機挑取陽性轉化子酶切鑑定後送上海生工測序並進行序列分析，用I和Not I雙酶切得到含有I和Not I兩個酶切位點的toyG基因，與同樣雙酶切的鏈黴菌整合型穿梭表達載體PIB139連接，得到重組穿梭表達載體pIB139-toyG經酶切驗證後，將其轉XE.co7iET12567(pUZ8002)，在卡那抗性和阿泊拉黴素抗性的LB平板上篩選陽性轉化子B.co7iET12567(pUZ8002, pIB139_toyG)，VX B.co7iET12567 (pUZ8002, pIB139-toyG)為供體，澱粉酶產色鏈黴菌為受體，利用接合轉移法將pIB139-toyG特異性的整合在澱粉酶產色鏈黴菌X diastatochromogenes 1628染色體上,在阿泊拉黴素抗性MS平板上篩選陽性轉化子，即得到重組澱粉酶產色鏈黴菌1628-T0YG。
[0028]以51 di as ta tochromogenes 1628染色體為模板，設計兩條引物，PCR擴增toyG,引物設計如下:
toyG F Nde 1:5』 -CGCCATATGGTGCCCGCACTTGTGCTG -3』
toyG R Not 1:5』 -CGCGCGGCCGCCTACAGGAAGGAGTTGATC-3>
重組質粒pMD18-T-toyG以限制性內切酶I和Not I雙酶切驗證如圖2所示，重組質粒pMD18-T- toyG雙酶切獲得約1.3kb和2.7kb的DNA片段，分別與toyG基因片段和質粒pMD18-T的大小一致，說明重組克隆載體連接正確。對重組質粒pMD18-T-toyG進行測序，序列分析表明插入片段為1284 bp的序列，編碼427個胺基酸，相對分子量大小分別約為47 kDa，與已報導的許多鏈黴菌屬的腺苷琥珀酸合成酶基因具有較高的同源性，其中最高為89%。toyG核酸序列如SEQ ID NO:1所示。將toyG基因連入pET28a載體，構建pET28a-toyG重組載體，並將重組載體轉入大腸桿菌BL21，挑取陽性轉化子於IOmL的LB培養基中，37°C振蕩培養過夜，次日轉接，IPTG誘導表達，如圖3所示，誘導後重組菌有明顯的特徵性條帶出現，測得腺苷琥珀酸合成酶酶活力為23 U/mg總蛋白，表明toyG基因在大腸桿菌中成功表達。
[0029]整合型重組穿梭 表達質粒pIB139_toyG的酶切驗證結果如圖4所示，重組質粒pIB139-toyG經Λ汝I和Not I雙酶切釋放1.3 kb的片段與toyG基因大小一致，說明質粒pIB139-toyG構建正確，以接合轉移法將其特異性的整合在澱粉酶產色鏈黴菌5:di as ta tochromogenes 1628染色體上,在阿泊拉黴素抗性平板上隨機挑取若干單菌落於CP培養基中培養多次後，提取染色體。PCR實驗均能擴增出阿泊拉黴素抗性基因a/ττ (圖
5)，證明重組澱粉酶產色鏈黴菌1628-T0YG構建成功，且遺傳穩定。
[0030]實施例2:澱粉酶產色鏈黴菌原始菌及重組菌的發酵性能驗證
與原始菌株相比，重組菌的腺苷琥珀酸合成酶酶活提高了 1.2倍；對重組菌1628-T0YG以及原始菌di as ta tochromogenes 1628進行250 mL搖瓶發酵實驗,從發酵角度對澱粉酶產色鏈黴菌中腺苷琥珀酸合成酶酶活的增強對豐加黴素產量的提高作用進行驗證。往復式搖床轉速為200 r/min, 28°C，發酵96h，對照組為澱粉酶產色鏈黴菌出發株。如表1所示，重組菌豐加黴素的產量高於原始菌，重組菌豐加黴素最終產量達到171.54 mg/L，較原始菌提高了約27.1%,且重複性良好。說明在豐加黴素生產菌株51 di as ta tochromogenes 1628中增強生物合成途徑的關鍵酶腺苷琥珀酸合成酶一ToyG的表達有助於提高發酵過程中豐加黴素的產量。
[0031]表1重組菌與原始菌最終豐加黴素產量的比較
【權利要求】
1.一種澱粉酶產色鏈黴菌的toyG基因，其特徵在於:他的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一種加強了 toyG表達的重組澱粉酶產色鏈黴菌，其特徵在於:它表達了生物合成豐加黴素的關鍵酶一腺苷琥珀酸合成酶編碼基因to_FG，具有比澱粉酶產色鏈黴菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628 更高的豐加黴素表達能力。
3.如權利要求2所述的加強了toyG表達的重組澱粉酶產色鏈黴菌，其特徵在於:所述的原始菌為澱粉酶產色鏈黴菌iStreptomyces diastatochromogenes) \<62私。
4.如權利要求2所述的加強了toyG表達的重組澱粉酶產色鏈黴菌，其特徵在於:所述的腺苷琥珀酸合成酶編碼基因toyG來自於待重組的原始菌澱粉酶產色鏈黴菌(S trep tomyces di as ta tochromogenes)。
5.如權利要求2所述的加強了toyG表達的重組澱粉酶產色鏈黴菌，其特徵在於:所述的腺苷琥珀酸合成酶編碼基因toyG整合入原始菌澱粉酶產色鏈黴菌染色體。
6.一種如權利要求2所述的加強了 toyG表達的重組澱粉酶產色鏈黴菌的構建方法，其特徵在於，過程如下: 1)構建表達載體pIB139-toyG； 2)利用接合轉移法將所述的表達載體整合入澱粉酶產色鏈黴菌染色體，獲得所述的工程菌。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，利用PIB139載體上的啟動子permE*啟動toyG基因的表達，利用接合轉移法將載體pIB139-toyG特異性的整合入澱粉酶產色鏈黴菌{Streptomyces di as ta tochromogenes) 1628的染色體，獲得了遺傳穩定的工程菌。
8.一種利用 如權利要求2所述的加強了 toyG表達的重組澱粉酶產色鏈黴菌的用途，其特徵在於，與原始菌株相比，重組菌腺苷琥珀酸合成酶酶活至少提高了 1.2倍，豐加黴素產量至少提高了 27.1%。
【文檔編號】C12P19/40GK103820473SQ201310168048
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年5月8日 優先權日:2013年5月8日
【發明者】馬正, 俞曉平, 陶立彬, 申屠旭萍, 邊亞琳, 郝培應, 許益鵬 申請人:中國計量學院