蛋白產品的總核苷酸測定方法
2023-12-10 07:58:52 3
蛋白產品的總核苷酸測定方法
【專利摘要】蛋白產品的總核苷酸測定方法，採用如下步驟：(1)配製鹼基混合標準液；(2)配製待測樣品的溶液，以步驟1所述的鹼基混合標準液作為參照液，採用高效液相色譜法通過出峰面積比較得到樣品中游離鹼基的含量值，並得到游離鹼基的總含量；(3)待測樣品進行完全水解處理，用高效液相色譜法定量測定完全水解後的總鹼基含量；(4)以步驟3所得的總鹼基含量減去步驟2所得的游離鹼基含量後經分子量換算得到核苷酸的含量。本發明所使用的方法測量準確，能準確反應單細胞蛋白產品中核苷酸的含量，從而衡量該產品的營養價值和質量優劣。除了單細胞蛋白以外，本發明的方法還適用於奶製品、飼料、藻類等富含核苷酸的原料。
【專利說明】蛋白產品的總核苷酸測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及核苷酸測定【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 單細胞蛋白（Single cell protein簡稱SCP)又稱微生物蛋白或菌體蛋白，是利 用工業廢水、廢氣、天然氣、石油烷烴類、農副加工產品以及有機垃圾等作為培養基，培養酵 母、非病源性細菌、微型菌、真菌等單細胞生物體，然後經過淨化乾燥處理後製成，是食品工 業和飼料工業重要的蛋白質來源。
[0003] 單細胞蛋白與其它蛋白相比的一大優點就是其較少的細胞培養時間，微生物有機 體蛋白產品的產率比其它傳統蛋白產率要高。單細胞蛋白（SCP)與傳統蛋白相比具有不受 環境和氣候的影響、原料易得、可連續生產、易於控制、汙染小等優勢。
[0004] 單細胞蛋白產品含有豐富的蛋白質,胺基酸的種類齊全，比例適當。單細胞蛋白還 含有豐富的脂肪、碳水化合物、核酸、維生素和無機鹽，並含有鈣、磷、鉀、鐵、鎂、鈉、錳等礦 物質元素，還含有多種酶。
[0005] 核苷酸是細胞組成主要成分，是組成DNA和RNA單體，在細胞結構、代謝、能量和調 節功能等方面起重要作用，其生理生化功能有：作為RNA和DNA合成的原料；作為代謝的調 節物質；作為輔酶的成分，如輔酶A ;激活糖原和糖蛋白合成的重要中介物，也是磷脂合成 的中介物，活化中間產物；參與遺傳信息傳遞;ATP是生命過程的直接能;AMP調節平滑肌的 收縮性並可調節血流量；核苷酸還可以作為甲基的供體等。因此外源核苷酸具有重要生物 學作用。
[0006] 飼料工業中單細胞蛋白是外源核苷酸的廉價且非常可靠的來源。因此，確定原料 中準確的核苷酸的含量就是一件非常重要的工作。
[0007] 目前核酸類的測定方法可以分為兩大類：核酸的定量分析及核酸水解物的測定。
[0008] 核酸的定量方法主要有：定磷法、紫外法、苔黑酚法。核酸水解物的測定包含測定 核苷酸、核苷及各種鹼基，這些水解物比較成熟的方法是使用高效液相色譜儀進行的，有些 也已經有成熟的應用，例如，嬰幼兒乳粉中游離核苷酸的測定。然而，上述方法都各有特點 及缺點，有其特定的適用範圍，在應用於測定單細胞蛋白核苷酸的測定時會產生很多問題， 從而導致測定結果出現錯誤。
[0009] 定磷法測定原理是核酸分子結構中含有一定比例的磷（RNA含磷量約為8. 9.0%)，測定其含磷量即可換算出核酸的量。但是方法無法區分核酸磷和其他有機磷，這會 導致蛋白原料中的核酸磷及其他有機磷全部計算為核酸的含磷，從而導致測定結果顯著偏 商。
[0010] 吸光度法測定核酸的原理是利用核酸中鹼基含有的共軛雙鍵的260nm紫外吸光 度的特點進行測定。該方法的缺點是：1)實質上定量的是共軛雙鍵的含量；2)含有共軛雙 鍵的物質包括：核酸、寡核苷酸、核苷酸、核苷、鹼基、1，3 - 丁二烯、環己烯等核酸及非核酸 類物質；4)共軛雙鍵的含量大小依次是：鹼基〉核苷〉核苷酸；6)分子生物學上指出了紫 外法測定只適用於純的核酸樣品，不適用於含有多種核酸水解物的樣品。因此也不適用於 酵母、酶解酵母等單細胞蛋白原料，因為它們除了有核酸也含有很多核酸的水解物。
[0011] 苔黑酚法測定核酸的原理是：核酸在酸水解後，降解形成的核糖轉變為糠醛，後者 與地衣酚（3, 5-二羥甲苯）作用生成綠色化合物，在670nm處有最大吸收。其缺點是：地衣 酚反應特異性較差，凡戊糖均有此反應，核酸水解物及糖類物質對其測定結果影響較大。因 此對於化學組分複雜多樣的單細胞蛋白類的產品測定結果會誤差很大。
[0012] 核酸水解物包括核苷酸、核苷、鹼基。核苷酸包括鳥苷酸、腺苷酸、尿苷酸、胞苷酸、 肌苷酸。核苷包括鳥苷、腺苷、尿苷、肌苷、胞苷。核糖核酸的鹼基有四種腺嘌呤、鳥嘌呤、胞 嘧啶、尿嘧啶，脫氧核糖核酸還具有胸腺嘧啶。這些水解物已有文獻報導可使用高效液相色 譜測定其含量。
[0013] 公告授權號為CN102680601B的發明專利〈乳粉中核苷酸高效液相色譜測定方法〉 公開了一種乳粉中測定核苷酸的方法，公開了使用液相色譜的液相條件、標準品、樣品前處 理方法等，很好的解決了乳粉核苷酸的測定。但是和其他液相測定核苷酸的方法類似，在應 用於單細胞蛋白的核苷酸測定時顯示了不適用的情況。不適用的原因為：1)方法多為游離 態的核苷酸；2)只測定了核苷酸沒有測定核苷，對動物營養角度來說，核酸水解物除了鹼 基以外都能發揮營養及免疫的功能；3)細胞核內的未游離態核苷酸不能測定；4)在實際的 單細胞蛋白原料中核苷酸的形態多樣，有核苷形式、核苷酸形式、二磷酸核苷酸、三磷酸核 苷酸、寡核苷酸，這些都沒有在測定方法中有所體現。
【發明內容】
[0014] 營養學意義上的核苷酸不僅僅包括單體的核苷酸，也包括其他形式的如寡核苷 酸、核苷酸、核苷。鹼基則無法提供營養及免疫功能。有研究顯示動物攝入外源鹼基（嘌呤 及嘧啶）會有以下問題：1)食物來源的嘌呤和嘧啶極少被機體利用；2)直接攝入嘌呤及嘧 啶會加重肝腎代謝的負擔；3)嘌呤的直接攝入會導致尿酸偏高；4)腺嘌呤本身有毒，會致 雄性不育和慢性腎衰，也會影響動物生長。因此，獲得除鹼基以外的所有核苷酸類物質在營 養學上具有重要的意義。相應地，檢測食物中的核苷酸類物質的含量就具有重要的醫學、食 品營養及商業價值。這也是本發明要解決的技術問題。
[0015] 本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種可測定單細胞蛋白產品中所含 總核苷酸含量的方法。
[0016] 為了實現上述目的，本發明採用了以下技術方案：蛋白產品的總核苷酸測定方法， 其特徵在於採用如下步驟：
[0017] (1)配製鹼基混合標準液；
[0018] (2)配製待測樣品的溶液，以步驟1所述的鹼基混合標準液作為參照液，採用高效 液相色譜法通過出峰面積比較得到樣品中游離鹼基的含量值，並得到游離鹼基的總含量；
[0019] (3)待測樣品進行完全水解處理，用高效液相色譜法定量測定完全水解後的總鹼 基含量；(4)以步驟3所得的總鹼基含量減去步驟2所得的游離鹼基含量後經分子量換算 得到核苷酸的含量。
[0020] 所述步驟3中待測樣品進行完全水解處理是通過以下操作實現的：
[0021] 稱取待測樣品，置於耐壓消化管中；
[0022] 在耐壓消化管中加入高氯酸消化液，使待測樣品水解；
[0023] 放入烘箱內100?IKTC消化50?70min ;
[0024] 使用10?20 %氫氧化鉀溶液調pH至6. 5?7. 5,備用。
[0025] 所述高氯酸消化液中高氯酸的質量百分比濃度為70%。
[0026] 所述步驟2中測定游離鹼基含量及步驟3中測定總鹼基含量的色譜條件為：流動 相A採用0. lmol/L磷酸二氫鉀溶液，pH = 4. 9?5. 1 ;流動相B採用25%甲醇溶液。
[0027] 測定總鹼基含量採用如下梯度洗脫程序：
[0028]
【權利要求】
1. 蛋白產品的總核苷酸測定方法，其特徵在於採用如下步驟： (1) 配製鹼基混合標準液； (2) 配製待測樣品的溶液，以步驟1所述的鹼基混合標準液作為參照液，採用高效液相 色譜法通過出峰面積比較得到樣品中游離鹼基的含量值，並得到游離鹼基的總含量； (3) 待測樣品進行完全水解處理，用高效液相色譜法定量測定完全水解後的總鹼基含 量； (4) 以步驟3所得的總鹼基含量減去步驟2所得的游離鹼基含量後經分子量換算得到 核苷酸的含量。
2. 根據權利要求1所述的蛋白產品的總核苷酸測定方法，其特徵在於：所述步驟3中 待測樣品進行完全水解處理是通過以下操作實現的： 稱取待測樣品，置於耐壓消化管中； 在耐壓消化管中加入高氯酸消化液，使待測樣品水解； 放入烘箱內100?110°C消化50?70min; 使用10?20 %氫氧化鉀溶液調pH至6. 5?7. 5,備用。
3. 根據權利要求2所述的蛋白產品的總核苷酸測定方法，其特徵在於：所述高氯酸消 化液中高氯酸的質量百分比濃度為70%。
4. 根據權利要求1所述的蛋白產品的總核苷酸測定方法，其特徵在於：所述步驟2中 測定游離鹼基含量及步驟3中測定總鹼基含量的色譜條件為：流動相A採用0.lmol/L磷酸 二氫鉀溶液，pH= 4. 9?5. 1 ;流動相B採用25%甲醇溶液。
5. 根據權利要求4所述的蛋白產品的總核苷酸測定方法，其特徵在於：測定總鹼基含 量採用如下梯度洗脫程序： 時間(min) 流動相A% 流動相B% 0.00 100 0 15.00 100 0 25.00 0 100 35.00 0 100 35.01 100 0 50.00 100 0 〇
6. 根據權利要求4所述的蛋白產品的總核苷酸測定方法，其特徵在於：測定游離鹼基 含量採用如下梯度洗脫程序：
O
【文檔編號】G01N30/02GK104316621SQ201410654423
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月17日 優先權日:2014年11月17日
【發明者】許建剛, 高會玲 申請人:上海徵泰飼料有限公司