用Bac-to-Bac系統在家蠶內表達人血管生長因子的方法
2023-12-10 04:12:31 1
專利名稱：用Bac-to-Bac系統在家蠶內表達人血管生長因子的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術、杆狀病毒基因表達系統，尤其涉及一種利用Bac-to-Bac 杆狀病毒表達系統在家蠶內表達人體內皮血管生長因子和純化的方法。
背景技術：
家蠶杆狀病毒基因表達系統是目前高效的真核表達系統之一。我們利用細 菌轉座子原理構建了專門用於家蠶的Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統。該系統的 優點在於重組杆狀病毒可以通過細菌轉座子的基因定位轉移作用，在大腸桿菌 內實現基因的轉移重組，快速獲得重組病毒，構建了可利用我國特色資源昆蟲 一家蠶的快速基因表達系統(專利已授權，名稱利用細菌轉座子構建家蠶病 毒快速基因表達系統的方法，專利號2003101087818)。該系統由供體質粒、 含有家蠶杆狀病毒Bacmid基因組的感受態細菌DH10BmBac構成，其產生重組 病毒的原理是首先將外源目的基因克隆入供體質粒，然後將供體質粒轉化入 DH10BmBac感受態細胞中，通過細菌轉座子的定點轉位作用，將啟動子和目的 基因一併轉入家蠶杆狀病毒基因組而產生重組病毒DNA，最後轉染家蠶培養細 胞而獲得含有目的基因重組病毒。我們嘗試利用該系統快速產生能夠表達人體 內皮血管生長因子的重組病毒，並利用家蠶作為寄主表達何生產重組人體內皮 血管生長因子蛋白，並利用親和層析技術建立分離該蛋白的方法。
發明內容
本發明公開了一種用Bac-to-Bac系統在家蠶內表達人血管生長因子的方法。 主要包含兩個方面的內容， 一個是利用Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統構建含有 人體內皮血管生長因子的重組病毒的方法， 一個是利用肝糖層析柱從感染的家 蠶體內分離純化重組的蛋白質方法。
為了達到上述目的，本發明採用的技術方案其步驟如下 1、利用Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統構建含有人體內皮血管生長因子的重 組病毒的方法
將人體內皮血管生長因子基因克隆入Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統配套的 供體質粒pFastBacHT多克隆位點，使該基因位於杆狀病毒多角體啟動子下遊， 然後將該質粒轉化入含有家蠶杆狀病毒Bacmid基因組的感受態細菌 DH10BmBac細胞內，在含有抗生素的培養板上培養過夜，翌日通過藍白斑篩選獲得陽性菌斑，隨後從陽性菌斑從抽提質粒DNA，該質粒DNA即為重組病毒 的基因組，將此DNA轉染入家蠶培養細胞BmN， 120小時後分離培養基上清液， 獲得含有人體內皮血管生長因子基因的重組病毒。
2、利用肝糖層析柱從感染的家蠶體內分離純化重組的蛋白質方法利用注 射法將20微升上述重組病毒注射入家蠶五齡幼蟲，120小時後收集感染的家蠶 樣品，然後加入磷酸緩衝液並勻漿樣品，高速離心後取上清液，將上清液作為 提取重組人體內皮血管生長因子蛋白的原料，利用肝糖親和層析柱分離、純化 獲得相應的蛋白質，並通過SDS-PAGE分析純化的蛋白質純度。
本發明具有的有益效果是利用Bac-to-Bac表達系統能夠快速產生含有人 體內皮血管生長因子基因的重組杆狀病毒，並在家蠶幼蟲內高效表達，利用肝 糖親和層析柱實現重組蛋白的快速分離和純化。
附圖是供體質粒pFastBacHT圖。
具體實施例方式
1、 研究材料家蠶Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統由本研究室構建(專利已 授權，名稱利用細菌轉座子構建家蠶病毒快速基因表達系統的方法，專利號 2003101087818)由本申請人自行構建。DH5a、 DH10p菌株等。供體質粒 pFastBacHT (圖l)購自美國Invitrogen公司。各種限制性內切酶、連接酶等分 子生物學操作試劑購自日本Takam公司。人體內皮血管生長因子基因購自美國 Clontech公司。肝糖親和層析柱Heparin Sepharose購於美國GE公司。
2、 工作流程
將人體內皮血管生長因子基因克隆入Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統配套的 供體質粒pFastBacHT多克隆位點BamHI和HindIII之間，使該基因位於杆狀病 毒多角體啟動子下遊，然後將該質粒轉化入含有家蠶杆狀病毒Bacmid基因組的 感受態細菌DH10BmBac細胞內，在添加了卡那黴素(濃度50微克/ML)、慶大 黴素(濃度35微克/ML)兩種抗生素以及半乳糖苷類似物X-Gal的培養板上培養 過夜，翌日通過藍白斑篩選獲得陽性菌斑(白斑，即基因發生了插入重組)，隨 後從陽性菌斑從抽提大質粒DNA，該質粒DNA即為重組病毒的基因組，將此 DNA轉染入家蠶單層培養細胞BmN內，120小時後分離培養基上清液，獲得含 有人體內皮血管生長因子基因的重組病毒。將20微升上述重組病毒通過經皮注 射的方式接種家蠶五齡幼蟲，然後觀察家蠶的發病情況，120小時後收集被病毒 感染的家蠶，然後以每頭家蠶2毫升的比例加入PH7.2d的磷酸緩衝液，並採用勻漿器對樣品精心勻漿處理，再高速離心後取上清液，將上清液作為提取重組
人體內皮血管生長因子蛋白的原料。利用肝糖親和層析柱Heparin Sepharose分 離、純化獲得相應的蛋白質，將上述原料加入層析柱使之與樹脂結合，最後用 含有1.5M的NaCl溶液一步洗脫、分離重組的人體內皮血管生長因子蛋白。純 化的樣品利用SDS-PAGE電泳分析純化的蛋白質純度。
根據實際結果，每頭家蠶幼蟲的產量估計在600微克左右。
權利要求
1、用Bac-to-Bac系統在家蠶內表達人血管生長因子的方法，其特徵在於該方法的步驟如下1)利用Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統構建含有人體內皮血管生長因子基因的重組病毒的方法將人體內皮血管生長因子基因克隆入Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統配套的供體質粒pFastBacHT多克隆位點，使該基因位於杆狀病毒多角體啟動子下遊，然後將該質粒轉化入含有家蠶杆狀病毒Bacmid基因組的感受態細菌DH10BmBac細胞內，在含有抗生素的培養板上培養過夜，翌日通過藍白斑篩選獲得陽性菌斑，隨後從陽性菌斑從抽提質粒DNA，該質粒DNA即為重組病毒的基因組，將此DNA轉染入家蠶培養細胞BmN，120小時後分離培養基上清液，獲得含有人體內皮血管生長因子基因的重組病毒；2)利用肝糖層析柱從感染的家蠶體內分離純化重組的蛋白質方法利用注射法將20微升上述重組病毒注射入家蠶五齡幼蟲，120小時後收集感染的家蠶樣品，然後加入磷酸緩衝液並勻漿樣品，高速離心後取上清液，將上清液作為提取重組人體內皮血管生長因子蛋白的原料，利用肝糖親和層析柱分離、純化獲得相應的蛋白質，並通過SDS-PAGE分析純化的蛋白質純度。
全文摘要
本發明公開了一種用Bac-to-Bac系統在家蠶內表達人血管生長因子的方法。該方法的步驟如下利用Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統構建含有人體內皮血管生長因子的重組病毒；利用肝糖層析柱從感染的家蠶體內分離純化重組的蛋白質。本發明的優點在於利用Bac-to-Bac表達系統能夠快速產生含有人體內皮血管生長因子基因的重組杆狀病毒，並在家蠶幼蟲內高效表達，利用肝糖親和層析柱實現重組蛋白的快速分離和純化。
文檔編號C07K14/515GK101307315SQ200810062858
公開日2008年11月19日 申請日期2008年6月30日 優先權日2008年6月30日
發明者吳小鋒, 相興偉 申請人:浙江大學