利用ube3基因構建核苷酸分子式鑑定植物品種的方法

2023-12-10 04:09:51

利用ube3基因構建核苷酸分子式鑑定植物品種的方法
【專利摘要】本發明公開了一種鑑定植物品種的方法。本發明提供了鑑定紫薇品種的方法，包括如下步驟：1)以待測紫薇的基因組DNA為模板，用由序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR產物；2)將所述PCR產物測序，根據測序結果列出所述待測紫薇的核苷酸分子式；3)將步驟2)所得的核苷酸分子式與對應的若干個紫薇品種的核苷酸分子式進行比對，從而確定所述待測紫薇的品種。實驗證明，該方法精確、操作簡捷，可以提高相關產業的生產效率和質量監控水平，有效彌補以往方法的不足；另外，該方法同時實現了非花期(如苗期)的鑑定。本方法對於促進紫薇的新品種選育、紫薇花木產業與城市園林綠化事業的發展以及環境保護具有重要意義。
【專利說明】利用UBE3基因構建核苷酸分子式鑑定植物品種的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，涉及一種鑑定或輔助鑑定植物品種的方法，特別涉及 一種利用泛素連接酶基因 （Nuclear DNA E3 ubiquitin ligase gene, UBE3)構建核苷酸分 子式鑑定植物品種的方法。

【背景技術】
[0002] 植物品種是指經過人工選育而形成的種性基本一致、遺傳性比較穩定、具有人類 需要的某些經濟性狀：如觀賞性狀、藥用性狀或其它經濟性狀，作為特殊生產資料用的栽培 植物群體。如牡丹品種、核桃品種、蘋果品種、紫薇品種等。
[0003] 植物品種一般利用表型性狀進行鑑定和識別。但是，植物品種在特徵表現上存在 季節差異，在有的季節可能表現不出品種間有差異的性狀。例如，紫薇品種通常按照花型和 花色進行分類，花期以外的時間存在品種鑑定難的問題。
[0004] 品種的準確鑑定和純度分析一直是經濟植物和資源植物（如花卉）產業發展上的 重要課題。在規模化生產領域，以某種具體植物品種為生產資料和/或產品進行大規模生 產的企業等，需要藉助靈敏度高的DNA分子分形檢測技術進行精確鑑定和分析。
[0005] 紫薇（Lagerstroemia indica L.)又名百日紅、滿堂紅等，為千屈菜科 (Lythraceae)紫薇屬的灌木或喬木，是中國有名的盛夏觀賞花木。紫薇的葉能吸附空氣中 的煙塵，是優良的環保樹種，在城市園林綠化和荒山綠化中應用前景廣闊。
[0006] 全世界紫薇栽培品種約500多個，以美國、中國及日本的品種最多，其中美國有 200多個品種，中國有100多個品種，日本有80多個品種。紫薇在中國已有1500多年的栽 培歷史，唐代就已經盛栽紫薇作為觀賞花木。目前，紫薇在北京、天津、上海、重慶、廣東、海 南、廣西、福建、湖南、湖北、四川、雲南、浙江、山東、陝西、吉林及香港、澳門、臺灣均有生長 或栽培。紫薇種質資源的精確鑑定對於新品種培育、生理學、生態學等眾多領域開展科學研 究以及對推動紫薇在園林綠化中的應用是至關重要的基礎工作。


【發明內容】

[0007] 本發明的一個目的是提供一種鑑定或輔助鑑定待測紫薇品種的方法。
[0008] 本發明所提供的用於鑑定或輔助鑑定待測紫薇品種的方法，是利用泛素連接酶基 因序列中的變異位點構建核苷酸分子式進而鑑定或輔助鑑定待測紫薇品種的方法，具體包 括如下步驟：
[0009] (1)以待測紫薇的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單 鏈DNA分子組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR產物；
[0010] (2)將所述PCR產物測序後截掉所述PCR產物的核苷酸序列自5'末端起的前76 個核苷酸（所述76個核苷酸為PCR產物5'端的保守序列；當然也可以同時截掉PCR產物 3'端的保守序列），剩餘序列作為待比對序列（非保守區）；
[0011] (3)將所述待比對序列與DNA序列資料庫中的全部序列放在一起，利用ClustalX 或Mega等軟體進行比對，自動生成一個DNA比對序列矩陣；
[0012] 所述DNA比對序列矩陣是根據特定的計分規則，將兩個或多個序列按位置比較排 列後產生的數據集，最大限度地反映了序列間的相似性（如圖1所示）。其中涉及到的特定 的計分規則和算法等相關常識和原理在"生物序列分析"方面的專著中均有記載。所述DNA 比對序列矩陣可直接反映在同一核苷酸位點上各序列之間是否存在差異，以及存在怎樣的 差異。找到核苷酸字母有差異的列在所述DNA比對序列矩陣中的位置，核准該位置位於所 述DNA比對序列矩陣5'端起的位置順序編號，即確定了一個多態位點。
[0013] 所述DNA序列庫為如下（al)或（a2):
[0014] (al)由序列表中序列3和/或序列4組成；
[0015] (a2)由序列表中序列3和序列4中的至少一種，和序列5至序列10中的至少一種 組成；
[0016] 其中，序列3和序列4為長度620bp的序列；序列5至序列10為長度61 lbp或 614bp的序列。
[0017] (4)根據所述DNA比對序列矩陣列出所述待測紫薇的核苷酸分子式；
[0018] 所述待測紫薇的核苷酸分子式的通式為：
[0019] B152B161B173B215B221B 245B294B299B426B431B 440B462B527B551B557 ;
[0020] 在所述通式中，所述b152、所述b161、所述b 173、所述b215、所述b221、所述b245、所述b 294、 所述b299、所述b426、所述b431、所述b 44(i、所述b462、所述b527、所述b551和所述b 557，依次表示在所 述 DNA 比對序列矩陣中的第 152、161、173、215、221、245、294、299、426、431、440、462、527、 551和557個位點（即多態核苷酸位點的位置順序編號以比對序列為基礎進行確定，才合 理，符合科學，否則沒有規律可循）；
[0021] 在所述通式中，每一個B為A、T、C和G中的任一種或兩種；
[0022] 當所述待測紫薇為純合型時，在所述通式中，每一個B為A、T、C和G中的任一種， 在測序時顯示單一峰；當所述待測紫薇為雜合型時，在所述通式中，每一個B可能為A、T、C 和G中的兩種，在測序時會得到明顯的疊加雙峰。
[0023] (5)將步驟（4)所得所述待測紫薇的核苷酸分子式與核苷酸分子式組I進行比 對；
[0024] 所述核苷酸分子式組I由如下al)_a8)共8種核苷酸分子式組成：
[0025] al) Y152G161C173Y215R221G 245R294C299C426C431A 44(IA462C527A551G557 ;
[0026] a2) Y152K161Y173Y215G221G 245G294C299C426Y431R 44(IA462Y527A551G557 ;
[0027] a3) T152G161C173C215A221G 245G294C299C426C431A 44(IG462C527A551A557 ;
[0028] a4) Y152K161Y173C215R221G 245G294C299C426Y431R 44(IR462T527A551G557 ;
[0029] a5) Y152G161C173C215R221G 245G294C299C426C431R 44(IR462C527A551R557 ;
[0030] a6) Y152K161Y173C215R221G 245G294C299C426Y431R 44(IR462Y527A551R557 ;
[0031] a7) C152G161C173C215G221G 245G294C299C426C431G 44(IA462C527A551G557 ;
[0032] a8) C152K161Y173C215G221G 245G294C299C426Y431G 44(IA462Y527A551G557 ;
[0033] 在al) _a8)中，M表示A和C ;K表示G和T ;Y表示T和C ;R表示A和G ;W表示A 和T (即所述待測紫薇的相應位點為雜合型）；
[0034] (6)根據步驟（5)的比對結果，按照如下方法對所述待測紫薇進行品種鑑定：
[0035] 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為al)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為 或候選為紫薇品種'翠盤紅粉'；
[0036] 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為a2)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為 或候選為紫薇品種'紅環直枝紫'；
[0037] 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為a3)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為 或候選為紫薇品種'小花雜種粉'；
[0038] 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為a4)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為 或候選為紫薇品種'寶慶淡紫'；
[0039] 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為a5)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為 或候選為紫薇品種'大白花'；
[0040] 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為a6)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為 或候選為紫薇品種'芙蓉面'；
[0041] 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為a7)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為 或候選為紫薇品種'建民粉'；
[0042] 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為a8)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為 或候選為紫薇品種'多花紫雲'。
[0043] 當然，所述方法中，步驟（1)中採用的引物對不限於序列表中序列1和序列2組成 的引物對，位於保守區的其他的引物對也可以，只要能夠擴增得到步驟（2)中的所述待比 對序列（非保守區）即可。
[0044] 再有，在所述方法中，進行比對的所述待比對序列（非保守區），其兩端保守區序 列的去除不限於以上步驟（2)中所述，只要能夠涵蓋用於供試樣品（如紫薇品種）鑑定的 核苷酸分子式中的多態位點即可；相應的，步驟（4)中通式中B的右下角的編號也會因為 5'端保守區序列取捨的多少而相應地發生變化，但是，多態位點之間的相對位置不變。
[0045] 進一步，以上本發明所提供的鑑定或輔助鑑定待測紫薇品種的方法，其操作步驟 可轉化為如下 ：
[0046] (1)以待測紫薇的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單 鏈DNA分子組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR產物；
[0047] (2)將所述PCR產物測序，將測序結果與核苷酸序列組I進行比對；
[0048] 所述核苷酸序列組I由序列表中序列3-10共8個序列組成；
[0049] (3)根據步驟（2)的比對結果，按照如下方法對所述待測紫薇進行鑑定：
[0050] 若所述PCR產物的核苷酸序列中含有序列3,則所述待測紫薇為或候選為紫薇品 種'寶慶淡紫'；
[0051] 若所述PCR產物的核苷酸序列中含有序列4,則所述待測紫薇為或候選為紫薇品 種'芙蓉面'；
[0052] 若所述PCR產物的核苷酸序列中含有序列5,則所述待測紫薇為或候選為紫薇品 種'翠盤紅粉'；
[0053] 若所述PCR產物的核苷酸序列中含有序列6,則所述待測紫薇為或候選為紫薇品 種'小花雜種粉'；
[0054] 若所述PCR產物的核苷酸序列中含有序列7,則所述待測紫薇為或候選為紫薇品 種'大白花'；
[0055] 若所述PCR產物的核苷酸序列中含有序列8,則所述待測紫薇為或候選為紫薇品 種'多花紫雲'；
[0056] 若所述PCR產物的核苷酸序列中含有序列9,則所述待測紫薇為或候選為紫薇品 種'紅環直枝紫'；
[0057] 若所述PCR產物的核苷酸序列中含有序列10,則所述待測紫薇為或候選為紫薇品 種'建民粉'。
[0058] 在上述方法中，所述待測紫薇為如下8個品種中的任一種：'寶慶淡紫'、'芙蓉 面'、'翠盤紅粉'、'小花雜種粉'、'大白花'、'多花紫雲'、'紅環直枝紫'、'建民粉'。
[0059] 本發明的另一個目的是提供一種用於鑑定或輔助鑑定待測紫薇品種的試劑盒。
[0060] 本發明所提供的用於鑑定或輔助鑑定待測紫薇品種的試劑盒，具體可包括引物 對、記載有核苷酸分子式組I的對比卡；
[0061] 所述引物對具體由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成；
[0062] 所述核苷酸分子式組I具體由如下al)_a8)共8種核苷酸分子式組成：
[0063] al) Y152G161C173Y215R221G 245R294C299C426C431A 44(IA462C527A551G557 ;
[0064] a2) Y152K161Y173Y215G221G 245G294C299C426Y431R 44(IA462Y527A551G557 ;
[0065] a3) T152G161C173C215A221G 245G294C299C4 26^431-^-440^462^527-^-551-^-557 ?
[0066] a4) Y152K161Y173C215R221G 245G294C299C4 26^431^440^462^527-^-551^557 ；
[0067] a5) Y152G161C173C215R221G 245G294C299C4 26^431^440^462^527-^-551^557 ?
[0068] a6) Y152K161Y173C215R221G 245G294C299C 426^431^440^462^527-^-551^557 ?
[0069] a7) C152G161C173C215G221G 245G294C299C4 26〇431〇44〇Α462〇527Α5516557 ;
[0070] a8) C152K161Y173C215G221G 245G294C299C426Y431G 44(IA462Y527A551G557 ;
[0071] 在al)_a8)中，M表示A和C;K表示G和T ;Y表示T和C;R表示A和G;W表示A 和T (即所述待測紫薇的相應位點為雜合型）；
[0072] 所述待測紫薇可為如下8個品種中的任一種：'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'翠盤紅粉'、 '小花雜種粉'、'大白花'、'多花紫雲'、'紅環直枝紫'、'建民粉'。
[0073] 所述試劑盒在鑑定或輔助鑑定待測紫薇品種中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0074] 所述待測紫薇為如下8個品種中的任一種：'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'翠盤紅粉'、 '小花雜種粉'、'大白花'、'多花紫雲'、'紅環直枝紫'、'建民粉'。
[0075] 本發明的再一個目的是提供一種鑑定或輔助鑑定待測植物品種的方法。
[0076] 本發明所提供的鑑定或輔助鑑定待測植物品種的方法，具體可包括如下步驟：
[0077] (1)通過比對屬於同一植物的多個品種的泛素連接酶基因序列，選取所述多個品 種的泛素連接酶基因序列中存在單核苷酸多態位點的區域作為目的DNA區域；
[0078] (2)利用所述目的DNA區域兩側保守區域的序列，設計能夠擴增得到含有所述目 的DNA區域的DNA片段的引物；
[0079] (3)用所述引物對所述多個品種中的每個品種的基因組DNA分別進行PCR擴增，從 每個品種中得到含有所述目的DNA區域的DNA片段；
[0080] (4)對步驟（3)從每個品種中獲得的含有所述目的DNA區域的DNA片段進行測序， 從而獲得每個品種的所述目的DNA區域的核苷酸序列；
[0081] (5)將所述多個品種的所述目的DNA區域的核苷酸序列放在一起進行比對，得到 DNA比對序列矩陣，根據所述DNA比對序列矩陣確定單核苷酸多態位點，列出每個品種的鑑 定用核苷酸分子式；
[0082] 所述核苷酸分子式由根據所述DNA比對序列矩陣從5'末端到3'末端或從3'末 端到5'末端依次列出所有的所述單核苷酸多態位點的核苷酸種類及其在所述DNA比對序 列矩陣中的位置順序編號組成；所述核苷酸分子式通式為Bx1Bx2Bx3……B xn，通式中，B為單核 苷酸多態位點上的核苷酸種類，為A、T、C、G四種中的任一種或兩種；xl為第1個單核苷酸多 態位點在所述DNA比對序列矩陣中從5'末端或3'末端起的位置順序編號， x2為第2個單 核苷酸多態位點在所述DNA比對序列矩陣中從5'末端或3'末端起的位置順序編號，x3為 第3個單核苷酸多態位點在所述DNA比對序列矩陣中從5'末端或3'末端起的位置順序編 號，類推， xn為第η個單核苷酸多態位點在所述DNA比對序列矩陣中從5'末端或3'末端起 的位置順序編號；
[0083] 所述Βχ1Βχ2Βχ3……Β χη為將所有的所述單核苷酸多態位點按照在所述DNA比對序列 矩陣中從5'末端或3'末端起依次列出；當然在實際操作中，區分效果相同的位點，可以只 保留一個，用於構建核苷酸分子式；
[0084] (6)將具有相同所述核苷酸分子式的品種組成一個譜系，具有不同核苷酸分子式 的品種作為不同的譜系，所有譜系構成核苷酸分子式譜系表；
[0085] 所述核苷酸分子式譜系表中，每一種核苷酸分子式對應來自一個譜系的植物品 種；
[0086] (7)將屬於步驟⑴中所述同一植物的待測植物品種按照步驟（3)-(5)重複操作， 用所述待測植物品種替代步驟（3)-(5)中的所述每個品種，得到所述待測植物品種的核苷 酸分子式；將所述待測植物品種的核苷酸分子式與所述核苷酸分子式譜系表中的所有核苷 酸分子式進行比較，按照如下方法確定所述待測植物品種的名稱及其隸屬的譜系：若所述 待測植物品種的核苷酸分子式與所述核苷酸分子式譜系表中的一個核苷酸分子式相同，則 所述待測植物品種為或候選為所述一個核苷酸分子式對應的所述譜系中的任意一個品種。 [0087] 所述方法靈敏度高，適用於鑑定某一種植物的不同品種。
[0088] 在本發明中，所述植物具體為紫薇的不同品種。
[0089] 在所述方法中，所述目的DNA區域具體可來自於所述植物的基因組內的泛素連接 酶基因區。
[0090] 在本發明中，步驟（2)中，所述引物具體為由序列表中序列1和序列2所示的兩條 單鏈DNA分子組成的引物對；所述目的DNA區域具體來自於採用所述引物對對所述植物的 基因組DNA進行PCR擴增所得的PCR產物。
[0091] 進一步，所述紫薇的多個品種及其對應的所述目的DNA區域為如下：
[0092] 所述紫薇的多個品種為如下8個品種中的至少兩種：'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'翠 盤紅粉'、'小花雜種粉'、'大白花'、'多花紫雲'、'紅環直枝紫'、'建民粉'。
[0093] 所述紫薇品種'寶慶淡紫'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列3 ;
[0094] 所述紫薇品種'芙蓉面'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列4 ;
[0095] 所述紫薇品種'翠盤紅粉'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列5 ;
[0096] 所述紫薇品種'小花雜種粉'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列6 ;
[0097] 所述紫薇品種'大白花'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列7 ;
[0098] 所述紫薇品種'多花紫雲'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列8 ;
[0099] 所述紫薇品種'紅環直枝紫'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列9 ; [0100] 所述紫薇品種'建民粉'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列10。
[0101] 更加具體的，所述紫薇品種'翠盤紅粉'的所述DNA區域的核苷酸分子式為Y152G 161 C173Y215R221G245R294C299C426C431A440A462C527A551G557 ;
[0102] 所述紫薇品種'紅環直枝紫'的所述DNA區域的核苷酸分子式為Y152K 161Y173Y215G221 G245G294C299C426Y431R440A462Y527A551G557 ;
[0103] 所述紫薇品種'小花雜種粉'的所述DNA區域的核苷酸分子式為T152G 161C173C215A221 G245G294C299C426C431A440G462C527A551A557 ;
[0104] 所述紫薇品種'寶慶淡紫'的所述DNA區域的核苷酸分子式為Y152K161Y 173C215R221G245 G294C299C426Y431R440R462T527A551G557 ;
[0105] 所述紫微品種'大白花'的所述DNA區域的核昔酸分子式為Y152G161C 173C215R221G245G2 94C299C426C431R440R462C527A551R557 ;
[0106] 所述紫微品種'芙容面'的所述DNA區域的核昔酸分子式為Y152K161Y 173C215R221G245G2 94C299C426Y431R440R462Y527A551R557 ;
[0107] 所述紫薇品種'建民粉'的所述DNA區域的核苷酸分子式為C152G161C 173C215G221G245G2 94C299C426C431G440A462C527A551G557 ;
[0108] 所述紫微品種'多花紫z?'的所述DNA區域的核昔酸分子式為C152K 161Y173C215G221G245 G294C299C426Y431G440A462Y527A551G557 ;
[0109] 其中，Μ表示A和C ;K表示G和T ;Y表示T和C ;R表示A和G ;W表示A和T (即 所述待測紫薇的相應位點為雜合型）。
[0110] 本發明以紫薇品種的鑑定過程為例，實驗證明，本發明所提供的利用該分子式鑑 定植物（如紫薇）品種的方法較為精確、操作簡捷，可以提高相關產業的生產效率和質量監 控水平，有效彌補以往方法的不足；另外，該方法同時實現了非花期（如苗期）的精準鑑定。 本方法對於促進紫薇的新品種選育、紫薇花木產業和城市園林綠化事業的發展以及環境保 護具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0111] 圖1為將8個紫薇品種的zw_UBE3序列進行序列比對後得到的DNA比對序列矩陣 的局部示意圖。其中，數字"397"和"502"即表示相應核苷酸位點在該DNA比對序列矩陣中 的位置順序編號；有*標註的列即表示8個紫薇品種在該位點的核苷酸種類完全相同；-表 示相應位點處核苷酸缺失。由於品種間實際測序得到的DNA序列長度略有差異，比對後，有 的品種的序列內會出現核苷酸位點缺失。

【具體實施方式】
[0112] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0113] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0114] 紫薇（Lagerstroemia indica L.)品種'翠盤紅粉'、'紅環直枝紫'、'小花雜種 粉'、'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'大白花'、'建民粉'、'多花紫雲'和'紅爪深紫'的幼葉採自湖 南省邵陽市紫薇花木研究所的紫薇品種資源圃。
[0115] 實施例1、利用核苷酸分子式鑑定紫薇品種的方法的建立及其應用
[0116] 為了構建能夠用於有效鑑定紫薇品種的核苷酸分子式，本發明的發明人從以下紫 薇品種系列中獲得泛素連接酶基因的一段非保守區DNA序列，並對其中的多態位點進行了 統計分析。作為供試材料的紫薇品種共8種，具體如下：'翠盤紅粉'、'紅環直枝紫'、'小花 雜種粉'、'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'大白花'、'建民粉'和'多花紫雲'。
[0117] 一、引物設計
[0118] 根據泛素連接酶基因的一段非保守區DNA序列兩端的保守區，設計如下引物：
[0119] 正向引物：5' -GTCCCCGTGATGTTTGA-3'（序列 1);
[0120] 反向引物：5 ' -GGTCCTTTGCCCGTAG-3 '（序列 2)。
[0121] 二、PCR擴增及PCR產物的序列測定
[0122] 以作為供試材料的8個紫薇品種的幼嫩葉片為實驗材料，採用植物基因組DNA提 取試劑盒（中國天根生物技術（北京）有限公司產品，其產品目錄號為DP305)提取各樣品 材料的基因組DNA。以所得基因組DNA為模板，採用步驟一設計的引物對進行PCR擴增。結 果顯示，每個紫薇品種均可得到一條長度為771-780bp的PCR產物。
[0123] 對純化後的各PCR產物進行測序，獲得了含有若干多態位點的長度為620bp的DNA 序列（記為zw_UBE3)。根據供試的8個紫薇品種的測序結果，將zw_UBE3序列定義為所述 PCR產物的核苷酸序列自5'端起的第77-696位^20bp)或為所述PCR產物的核苷酸序列 自5'端起的第77-687位（611bp)或為所述PCR產物的核苷酸序列自5'端起的第77-690 位（614bp)。將所述PCR產物的核苷酸序列自5'端起的第77個核苷酸記為第1位，當第 468-488位的這21個核苷酸為7個GGC重複單元時，所述zw_UBE3序列為所述PCR產物的 核苷酸序列自5'端起的第77-696位（記為zw_UBE3序列A);當第468-488位的這21個 核苷酸為4個GGC重複單元和9個缺失鹼基位點時（即與上述zw_UBE3序列A相比缺失3 個GGC重複單元），所述zw_UBE3序列為所述PCR產物的核苷酸序列自5'端起的第77-687 位；當第468-488位這21個核苷酸為5個GGC重複單元和6個缺失鹼基位點時（即與上述 zw_UBE3序列A相比缺失2個GGC重複單元），所述zw_UBE3序列為所述PCR產物的核苷酸 序列自5'端起的第77-690位。（這個第468-488位的GGC重複單元屬於變異的高頻率發 生區域，未來的待測紫薇品種的測序結果中也可能出現較長或較短的序列變化，可能會因 待測樣品的不同而略有變化，屆時可根據實際情況獲得比對序列矩陣，確定後面的多態位 點的位置順序編號。）
[0124] 結果顯示，紫薇品種'寶慶淡紫'的zw_UBE3序列為序列表中序列3 ;
[0125] 紫薇品種'芙蓉面'的zw_UBE3序列為序列表中序列4 ;
[0126] 紫薇品種'翠盤紅粉'的zw_UBE3序列為序列表中序列5 ;
[0127] 紫薇品種'小花雜種粉'的zw_UBE3序列為序列表中序列6 ;
[0128] 紫薇品種'大白花'的zw_UBE3序列為序列表中序列7 ;
[0129] 紫薇品種'多花紫雲'的zw_UBE3序列為序列表中序列8 ;
[0130] 紫薇品種'紅環直枝紫'的zw_UBE3序列為序列表中序列9 ;
[0131] 紫薇品種'建民粉'的zw_UBE3序列為序列表中序列10。
[0132] 三、序列比對
[0133] 將步驟二所得的8個紫薇品種的zw_UBE3序列進行比對，獲得DNA比對序列矩陣 (aligned sequence matrix)。進而獲得如表1中的紫薇品種鑑定用15個單核苷酸多態位 點。
[0134] 表1 8個紫薇品種的zw_UBE3序列中的單核苷酸多態位點
[0135]

【權利要求】
1. 一種鑑定或輔助鑑定待測紫薇品種的方法，包括如下步驟： (1) 以待測紫薇的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈 DNA分子組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR產物； (2) 將所述PCR產物測序後，截掉所述PCR產物的核苷酸序列自5'末端起的前76個核 苷酸，剩餘序列作為待比對序列； (3) 將所述待比對序列與DNA序列庫中的全部序列放在一起進行比對，得到DNA比對序 列矩陣； 所述DNA序列庫為如下（al)或（a2): (al)由序列表中序列3和/或序列4組成； (a2)由序列表中序列3和序列4中的至少一種，和序列5至序列10中的至少一種組 成； (4) 根據所述DNA比對序列矩陣列出所述待測紫薇的核苷酸分子式； 所述待測紫薇的核苷酸分子式的通式為： B152B161B173B215B221B245B294B299B426B431B440B462B527B551B557 ; 在所述通式中，所述B152、所述B161、所述B173、所述B 215、所述B221、所述B245、所述B294、所 述B299、所述B426、所述B431、所述B44Q、所述B 462、所述B527、所述B551和所述B557，依次表示在所 述 DNA 比對序列矩陣中的第 152、161、173、215、221、245、294、299、426、431、440、462、527、 551和557個位點； 在所述通式中，每一個B為A、T、C和G中的任一種或兩種； (5) 將步驟（4)所得所述待測紫薇的核苷酸分子式與核苷酸分子式組I進行比對； 所述核苷酸分子式組I由如下al) _a8)共8種核苷酸分子式組成： a!) Y152G161C173Y215R221G245R294C299C426C431A440A462C527A551G557; a2) Y152K161Y173Y215G221G245G294C299C426Y431R440A462Y527A551G557 ; a3) T152G161C173C215A221G 245G294C299C426C431A 440G462C527A551A557 ; a4) Yl52Ki6lYl73C2i5R22lG245G294C299C426Y431R 440R462T527A551G557 ; a5) Y152G161C173C215R221G245G294C299C426C431R440R462C527A551R557 ; a6) Y152K161Y173C215R221G245G294C299C426Y431R440R462Y527A551R557 ; a?) Ci52G161C173C215G221G 245G294C299C426C431G 440A462C527A551G557 ; a8)。152〖161丫173。215〇221〇245〇294。299。426丫431〇44〇八462丫527八 5516557 ; 在al)-a8)中，M表示A和C ;K表示G和T ;Y表示T和C ;R表示A和G ;W表示A和T ; (6) 根據步驟（5)的比對結果，按照如下方法對所述待測紫薇進行品種鑑定： 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為al)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為或候 選為紫薇品種'翠盤紅粉'； 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為a2)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為或候 選為紫微品種'紅環直枝紫'； 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為a3)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為或候 選為紫薇品種'小花雜種粉'； 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為a4)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為或候 選為紫薇品種'寶慶淡紫'； 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為a5)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為或候 選為紫微品種'大白花'； 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為a6)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為或候 選為紫微品種'芙容面'； 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為a7)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為或候 選為紫薇品種'建民粉'； 若所述待測紫薇的核苷酸分子式為a8)所示的核苷酸分子式，則所述待測紫薇為或候 選為紫薇品種'多花紫雲'。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：所述待測紫薇為如下8個品種中的任一 種：'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'翠盤紅粉'、'小花雜種粉'、'大白花'、'多花紫雲'、'紅環直枝 紫'、'建民粉'。
3. -種用於鑑定或輔助鑑定待測紫薇品種的試劑盒，包括引物對、記載有核苷酸分子 式組I的對比卡； 所述引物對由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成； 所述核苷酸分子式組I由如下al) _a8)共8種核苷酸分子式組成： a!) Y152G161C173Y215R221G245R294C299C426C431A440A462C527A551G557; a2) Y152K161Y173Y215G221G245G294C299C426Y431R440A462Y527A551G557 ; a3) T152G161C173C215A221G 245G294C299C426C431A 440G462C527A551A557 ; a4) Yl52Ki6lYl73C2i5R22lG245G294C299C426Y431R 440R462T527A551G557 ; a5) Y152G161C173C215R221G245G294C299C426C431R440R462C527A551R557 ; a6) Y152K161Y173C215R221G245G294C299C426Y431R440R462Y527A551R557 ; a?) Ci52G161C173C215G221G 245G294C299C426C431G 440A462C527A551G557 ; a8)。152〖161丫173。215〇221〇245〇294。299。426丫431〇44〇八462丫527八 5516557 ; 在al)-a8)中，M表示A和C ;K表示G和T ;Y表示T和C ;R表示A和G ;W表示A和T ; 所述待測紫薇為如下8個品種中的任一種：'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'翠盤紅粉'、'小花 雜種粉'、'大白花'、'多花紫雲'、'紅環直枝紫'、'建民粉'。
4. 權利要求3所述試劑盒在鑑定或輔助鑑定待測紫薇品種中的應用； 所述待測紫薇為如下8個品種中的任一種：'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'翠盤紅粉'、'小花 雜種粉'、'大白花'、'多花紫雲'、'紅環直枝紫'、'建民粉'。
5. -種鑑定或輔助鑑定待測植物品種的方法，包括如下步驟： (1)通過比對屬於同一植物的多個品種的泛素連接酶基因序列，選取所述多個品種的 泛素連接酶基因序列中存在單核苷酸多態位點的區域作為目的DNA區域； ⑵利用所述目的DNA區域兩側保守區域的序列，設計能夠擴增得到含有所述目的DNA 區域的DNA片段的引物； ⑶用所述引物對所述多個品種中的每個品種的基因組DNA分別進行PCR擴增，從每個 品種中得到含有所述目的DNA區域的DNA片段； (4) 對步驟（3)從每個品種中獲得的含有所述目的DNA區域的DNA片段進行測序，從而 獲得每個品種的所述目的DNA區域的核苷酸序列； (5) 將所述多個品種的所述目的DNA區域的核苷酸序列放在一起進行比對，得到DNA比 對序列矩陣，根據所述DNA比對序列矩陣確定單核苷酸多態位點，列出每個品種的核苷酸 分子式； 所述核苷酸分子式由根據所述DNA比對序列矩陣從5'末端到3'末端或從3'末端到 5'末端依次列出所有的所述單核苷酸多態位點的核苷酸種類及其在所述DNA比對序列矩 陣中的位置順序編號組成；所述核苷酸分子式通式為B x1Bx2Bx3……Bxn，通式中，B為單核苷酸 多態位點上的核苷酸種類，為A、T、C、G四種中的任一種或兩種 ；xl為第1個單核苷酸多態 位點在所述DNA比對序列矩陣中從5'末端或3'末端起的位置順序編號，x2為第2個單核 苷酸多態位點在所述DNA比對序列矩陣中從5'末端或3'末端起的位置順序編號， x3為第3 個單核苷酸多態位點在所述DNA比對序列矩陣中從5'末端或3'末端起的位置順序編號， 類推， xn為第η個單核苷酸多態位點在所述DNA比對序列矩陣中從5'末端或3'末端起的 位置順序編號； 所述Βχ1Βχ2Βχ3……Βχη為將所有的所述單核苷酸多態位點按照在所述DNA比對序列矩陣 中從5'末端或3'末端起依次列出； (6) 將具有相同所述核苷酸分子式的品種組成一個譜系，具有不同核苷酸分子式的品 種為不同的譜系，所有譜系構成核苷酸分子式譜系表； 所述核苷酸分子式譜系表中，每一種核苷酸分子式對應來自一個譜系的植物品種； (7) 將屬於步驟（1)中所述同一植物的待測植物品種按照步驟（3)-(5)重複操作，用所 述待測植物品種替代步驟（3)-(5)中的所述每個品種，得到所述待測植物品種的核苷酸分 子式；將所述待測植物品種的核苷酸分子式與所述核苷酸分子式譜系表中的所有核苷酸分 子式進行比較，按照如下方法確定所述待測植物品種的名稱及其隸屬的譜系：若所述待測 植物品種的核苷酸分子式與所述核苷酸分子式譜系表中的一個核苷酸分子式相同，則所述 待測植物品種為或候選為所述一個核苷酸分子式對應的所述譜系中的任意一個品種。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特徵在於：所述植物為紫薇。
7. 根據權利要求5或6所述的方法，其特徵在於：所述目的DNA區域來自於所述植物 的基因組內的泛素連接酶基因區。
8. 根據權利要求5-7中任一所述的方法，其特徵在於： 步驟⑵中，所述引物具體為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組 成的引物對； 所述目的DNA區域來自於採用所述引物對對所述植物的基因組DNA進行PCR擴增所得 的PCR產物。
9. 根據權利要求6-8中任一所述的方法，其特徵在於：所述紫薇的多個品種及其對應 的所述目的DNA區域為如下： 所述紫薇的多個品種為如下8個品種中的至少兩種：'寶慶淡紫'、'芙蓉面'、'翠盤紅 粉'、'小花雜種粉'、'大白花'、'多花紫雲'、'紅環直枝紫'、'建民粉'； 所述紫薇品種'寶慶淡紫'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列3 ; 所述紫薇品種'芙蓉面'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列4 ; 所述紫薇品種'翠盤紅粉'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列5 ; 所述紫薇品種'小花雜種粉'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列6 ; 所述紫薇品種'大白花'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列7 ; 所述紫薇品種'多花紫雲'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列8 ; 所述紫薇品種'紅環直枝紫'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列9 ; 所述紫薇品種'建民粉'的所述DNA區域的核苷酸序列為序列表中序列10。
10.根據權利要求5-8中任一所述方法，其特徵在於： 所述紫薇品種'翠盤紅粉'的所述DNA區域的核苷酸分子式為Y152G161C173Y 215R221G245R294C 299。426。431八44〇八462。527八551〇557 ; 所述紫薇品種'紅環直枝紫'的所述DNA區域的核苷酸分子式為Y152K161Y173Y 215G221G245G2 94C299C426Y431R440A462Y527A551G557 ; 所述紫微品種'小花雜種粉'的所述DNA區域的核昔酸分子式為T152G161C173C 215A221G245G2 94C299C426C431A440G462C527A551A557 ; 所述紫薇品種'寶慶淡紫'的所述DNA區域的核苷酸分子式為Y152K161Y173C 215R221G245G294C 299C426Y431R440R462T527A551G557 ; 所述紫薇品種'大白花'的所述DNA區域的核苷酸分子式為Y152G161C173C 215R221G245G294C299 C426C431R440R462C527A551R557 ; 所述紫薇品種'芙蓉面'的所述DNA區域的核苷酸分子式為Y152K161Y173C 215R221G245G294C299 C426Y431R440R462Y527A551R557 ; 所述紫薇品種'建民粉'的所述DNA區域的核苷酸分子式為C152G161C173C 215G221G245G294C299 C426C431G440A462C527A551G557 ; 所述紫薇品種'多花紫雲'的所述DNA區域的核苷酸分子式為C152K161Y173C 215G221G245G294C 299^426^431^440-^462^527-^551^557 ； 其中，Μ表示A和C ;K表示G和T ;Y表示T和C ;R表示A和G ;W表示A和T。
【文檔編號】C12Q1/68GK104195243SQ201410418156
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月22日 優先權日:2014年7月2日
【發明者】索志立, 黃建民, 黃磊, 侯伯鑫, 林道銀 申請人:中國科學院植物研究所, 湖南省紫薇花木研究所