一種測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法
2023-12-10 00:39:31 1
專利名稱：一種測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法
一種測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法技術領域
本發明是涉及一種測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法，屬於中藥分析技術領域。
背景技術：
中藥板藍根，又稱北板藍根，自首載於《中國藥典》1977年版，此後歷版藥典均有收載，為十字花科植物菘藍Isatis indigotica Fort.的乾燥根，具有清熱解毒、涼血利咽之功效。十字花科植物中富含芥子苷類化合物，板藍根中含有的主要芥子苷類化合物為R， S-告依春、原告依春、表原告依等，其中R，S-告依春為板藍根的主要活性成分之一，且為板藍根的特徵性成分。目前對板藍根的質量主要是根據R，S-告依春含量高低進行控制(2010 版《中國藥典》(一部)，國家醫藥科技出版社191)。
南板藍根為爵床科植物馬蘭Baphicacanthus eusia (Nees) Bremek.乾燥根(2010 版《中國藥典》(一部)，國家醫藥科技出版社229)。自《中國藥典》1995年版將南板藍根單列品種開始，便有北板藍根、南板藍根兩種。南板藍根中不含有R，S-告依春等芥子苷類化合物，不作為板藍根使用，但目前市場上仍有南、北板藍根混用的現象。
板藍根顆粒和複方板籃根顆粒為常用的非處方藥品，是以板藍根為原料的最具代表性的製劑。板藍根顆粒是由板藍根經水煎醇沉加工製成，複方板藍根顆粒是由板藍根和大青葉經水煎醇沉加工製成，均具有清熱解毒、涼血利咽、消腫之功效。但迄今為止，板藍根顆粒以亮氨酸、精氨酸對照品作為TLC鑑別依據，無含量測定項O010版《中國藥典》(一部)，國家醫藥科技出版社800)；複方板藍根顆粒以胺基酸為對照進行TLC鑑別，以靛玉紅、靛藍為指標成分進行定量控制。上述質量控制方法缺乏專屬性，且與現行板藍根藥材和飲片的標準不一致，無法保證板藍根製劑的質量。
目前對板藍根及其製劑的指紋圖譜已有文獻報導(參見閆峻等，複方板藍根顆粒抗病毒成分HPLC-UV指紋圖譜及LC-ESI-MSn研究[J]，化學學報，2011年，69 (2) :204 ；肖雪等，中藥板藍根高效液相色譜法指紋圖譜研究[J]，江西中醫學院學報，2010年，22C3) 67； 柏健等，板藍根顆粒的HPLC指紋圖譜研究[J]，中草藥，2006年，37(1) :72)，但這些方法均為獨立的指紋圖譜研究方法，無法體現板藍根藥材與製劑的相關性，且不能與南板藍根相區別。目前尚無在同一高效液相色譜條件下針對板藍根、板藍根顆粒、複方板藍根顆粒和南板藍根進行指紋圖譜研究的方法。發明內容
為了克服現有技術的不足，本發明提供一種測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法。
本發明提供的測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法，包括如下步驟3
a)對待測的板藍根及其製劑樣品進行預處理向待測樣品中加入水，加熱，搖勻， 濾過，取續濾液；
b)採用高效液相色譜法，測定經預處理後的待測的板藍根及其製劑樣品，獲得特徵指紋圖譜；所述的高效液相色譜法的色譜條件是採用反相十八烷基鍵合相矽膠色譜柱， 流動相由A相和B相組成，A相為pH = 3. 0,0. 02%的磷酸水溶液，B相為乙腈，按照以下條件進行梯度洗脫
0至10分鐘，流動相A與流動相B的體積比由99 1勻速變化至95 5 ；
10至15分鐘，流動相A與流動相B的體積比由95 5勻速變化至93 7 ；
15至30分鐘，流動相A與流動相B的體積比為93 7。
所述的待測的板藍根樣品是指板藍根藥材和板藍根飲片，包括南板藍根藥材；待測的板藍根製劑樣品是指板藍根顆粒和複方板藍根顆粒，包括含蔗糖型和無蔗糖型。
進一步，待測的板藍根樣品的預處理方法如下精密稱取待測樣品粉末，精密加入 50倍重量的水，稱重，煎煮2小時，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
進一步，待測的板藍根製劑樣品的預處理方法如下取製劑待測樣品，研細，混勻， 精密稱取，加入含蔗糖製劑樣品的10倍重量的水，或加入無蔗糖製劑樣品的20倍重量的水，水浴加熱並振搖使其溶解，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
進一步，所述的高效液相色譜方法採用紫外檢測器，採集範圍為190 400nm，檢測波長為245nm ；反相十八烷基鍵合相矽膠色譜柱為Siiseido C18MG (4. 6mmX 250mm, 5 μ m) 色譜柱；混合流動相的流速為1. OmL/min ；進樣量為10 μ 1 ；柱溫為30°C。
所述的特徵指紋圖譜是指高效液相色譜圖中保留時間tK為5. 2分鐘的1號胞苷峰，保留時間tK為8. 2分鐘的2號尿苷峰，保留時間tK為10. 1分鐘的3號腺苷峰，保留時間tK為11. 6分鐘的4號鳥苷峰，保留時間tK為18. 4分鐘的5號R，S-告依春峰。
板藍根、板藍根顆粒和複方板藍根顆粒的特徵峰是5號R，S-告依春峰，南板藍根的高效液相色譜圖中不含5號R，S-告依春峰。
本發明的優點是
(1)本發明方法為首次應用同一高效液相色譜條件對板藍根、板藍根顆粒和複方板藍根顆粒進行特徵指紋圖譜的檢測與分析。該方法能夠較全面體現整體化學信息，對板藍根及其製劑進行品質評價具有重要指導意義，可應用於新藥研發質控等多個方面。
(2)本發明方法為首次應用同一高效液相色譜條件對板藍根和南板藍根進行特徵指紋圖譜的檢測與分析，對板藍根和南板藍根的鑑別和品質評價具有重要指導意義，可應用於新藥研發質控等多個方面。
(3)本發明方法簡便快速、重複性好，通過高效液相色譜法對板藍根及其製劑進樣分析，測定特徵指紋圖譜，分析成本低，有較強的實用性。
圖1為板藍根藥材的高效液相特徵色譜圖。
圖2為板藍根飲片的高效液相特徵色譜圖。
圖3板藍根顆粒(無蔗糖)的高效液相特徵色譜圖。
圖4為板藍根顆粒(含蔗糖)的高效液相特徵色譜圖。
圖5為複方板藍根顆粒(無蔗糖)的高效液相特徵色譜圖。
圖6為複方板藍根顆粒(含蔗糖)的高效液相特徵色譜圖。
圖7為板藍根和南板藍根高效液相特徵色譜比較圖。
其中1為胞苷峰，2為尿苷峰，3為腺苷峰，4為鳥苷峰，5為R，S-告依春峰；A為板藍根，B為南板藍根。
具體實施方式
下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本發明。這些實施例應理解為僅用於說明本發明而不是用於限制本發明的保護範圍。在閱讀了本發明記載的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發明權利要求書所限定的範圍。
實施例1 測定板藍根藥材的高效液相色譜特徵指紋圖譜
(1)供試品溶液的製備取板藍根藥材粉末約lg，精密稱定，置IOOml圓底瓶中， 精密加入水50ml，稱定重量，煎煮2小時，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
(2)高效液相色譜條件Shiseido C18MG6mmX 250mm，5 μ m)色譜柱，流動相 0. 02%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0-10min，99%-95%A ;10-15min，95%-93%A ； 15-30min,93% A ；流速1. OmL/min ；進樣量10 μ 1 ；柱溫30°C ;DAD檢測器採集範圍為190 400nm ；檢測波長M5nm。
(3)板藍根藥材供試品溶液的高效液相色譜特徵指紋圖譜測定將板藍根藥材供試品溶液進行高效液相色譜法測定，獲得高效液相色譜指紋圖譜，通過對照品對照，確認共有峰1-5，分別為胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷和R，S-告依春，保留時間分別為5. 239分鐘，8. 224 分鐘，10. 157分鐘，11. 636分鐘和18. 459分鐘，完成板藍根藥材的高效液相色譜特徵指紋圖譜測定，見圖1所示圖譜。
實施例2 測定板藍根飲片的高效液相色譜特徵指紋圖譜
(1)供試品溶液的製備取板藍根飲片粉末約lg，精密稱定，置IOOml圓底瓶中， 精密加入水50ml，稱定重量，煎煮2小時，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
(2)高效液相色譜條件Shiseido C18MG6mmX 250mm，5 μ m)色譜柱，流動相 0. 02%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0-10min，99%-95%A ;10-15min，95%-93%A ； 15-30min,93% A ；流速1. OmL/min ；進樣量10 μ 1 ；柱溫30°C ;DAD檢測器採集範圍為190 400nm ；檢測波長M5nm。
(3)板藍根飲片供試品溶液的高效液相色譜特徵指紋圖譜測定將板藍根飲片供試品溶液進行高效液相色譜法測定，獲得高效液相色譜指紋圖譜，通過對照品對照，確認共有峰1-5，分別為胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷和R，S-告依春，保留時間分別是5. 233分鐘，8. 227 分鐘，10. 220分鐘，11. 667分鐘和18. 493分鐘，見圖2所示圖譜。
實施例3 測定板藍根顆粒(無蔗糖)高效液相色譜特徵指紋圖譜
(1)供試品溶液的製備取板藍根顆粒(無蔗糖)樣品適量，研細，混勻，取約 1. Og,精密稱定，置於具塞錐形瓶中，加入20mL水，水浴加熱並振搖使其溶解，放冷，搖勻， 濾過，取續濾液，即得。
(2)高效液相色譜條件Shiseido C18MG6mmX 250mm，5 μ m)色譜柱，流動相0.02%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0-10min，99%-95%A ;10-15min，95%-93%A ； 15-30min,93% A ；流速1. OmL/min ；進樣量10 μ 1 ；柱溫30°C ;DAD檢測器採集範圍為190 400nm ；檢測波長M5nm。
(3)板藍根顆粒(無蔗糖)供試品溶液的高效液相色譜特徵指紋圖譜測定將板藍根顆粒供試品溶液進行高效液相色譜法測定，獲得高效液相色譜指紋圖譜，通過對照品對照，確認共有峰1-5，分別為胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷和R，S-告依春，保留時間分別是 5. 169分鐘，8. 191分鐘，10. 074分鐘，11. 522分鐘和18. 388分鐘，見圖3所示圖譜。
實施例4 測定板藍根顆粒(含蔗糖)高效液相色譜特徵指紋圖譜
(1)供試品溶液的製備取板藍根顆粒(含蔗糖)樣品適量，研細，混勻，取約1.Og,精密稱定，置於具塞錐形瓶中，加入IOmL水，水浴加熱並振搖使其溶解，放冷，搖勻， 濾過，取續濾液，即得。
(2)高效液相色譜條件Shiseido C18MG6mmX 250mm，5 μ m)色譜柱，流動相0.02%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0-10min，99%-95%A ;10-15min，95%-93%A ； 15-30min,93% A ；流速1. OmL/min ；進樣量10 μ 1 ；柱溫30°C ;DAD檢測器採集範圍為190 400nm ；檢測波長M5nm。
(4)板藍根顆粒(含蔗糖)供試品溶液的高效液相色譜特徵指紋圖譜測定將板藍根顆粒供試品溶液進行高效液相色譜法測定，獲得高效液相色譜指紋圖譜，通過對照品對照，確認共有峰1-5，分別為胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷和R，S-告依春，保留時間分別是 5. 192分鐘，8. 166分鐘，10. 059分鐘，11. 562分鐘和18. 305分鐘，見圖4所示圖譜。
實施例5 測定複方板藍根顆粒(無蔗糖)高效液相色譜特徵指紋圖譜
(1)供試品溶液的製備取複方板藍根顆粒(無蔗糖)樣品適量，研細，混勻，取約1.Og,精密稱定，置於具塞錐形瓶中，加入20mL水，水浴加熱並振搖使其溶解，放冷，搖勻， 濾過，取續濾液，即得。
(2)高效液相色譜條件Shiseido C18MG6mmX 250mm，5 μ m)色譜柱，流動相0.02%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0-10min，99%-95%A ;10-15min，95%-93%A ； 15-30min，93%A ；流速l.OmL/min ；進樣量10 μ 1 ；柱溫30°C ;DAD檢測器採集範圍為190 400nm ；檢測波長M5nm。
(3)複方板藍根顆粒(無蔗糖)供試品溶液的高效液相色譜特徵指紋圖譜測定 將複方板藍根顆粒供試品溶液進行高效液相色譜法測定，獲得高效液相色譜指紋圖譜，通過對照品對照，確認共有峰1-5，分別為胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷和R，S-告依春，保留時間分別是5. 164分鐘，8. 225分鐘，10. 116分鐘，11. 547分鐘和18. 408分鐘，見圖5所示圖譜。
實施例6 測定複方板藍根顆粒(含蔗糖)高效液相色譜特徵指紋圖譜
(1)供試品溶液的製備取複方板藍根顆粒(含蔗糖)樣品適量，研細，混勻，取約1.Og,精密稱定，置於具塞錐形瓶中，加入IOmL水，水浴加熱並振搖使其溶解，放冷，搖勻， 濾過，取續濾液，即得。
(2)高效液相色譜條件Shiseido C18MG6mmX 250mm，5 μ m)色譜柱，流動相 0. 02%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0-10min，99%-95%A ;10-15min，95%-93%A ； 15-30min,93% A ；流速1. OmL/min ；進樣量10 μ 1 ；柱溫30°C ;DAD檢測器採集範圍為190 400nm ；檢測波長M5nm。
(3)複方板藍根顆粒(含蔗糖)供試品溶液的高效液相色譜特徵指紋圖譜測定 將複方板藍根顆粒供試品溶液進行高效液相色譜法測定，獲得高效液相色譜指紋圖譜，通過對照品對照，確認共有峰1-5，分別為胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷和R，S-告依春，保留時間分別是5. 141分鐘，8. 212分鐘，10. 125分鐘，11. 551分鐘和18. 396分鐘，見圖6所示圖譜。
實施例7 測定南板藍根高效液相色譜指紋圖譜
(1)供試品溶液的製備取南板藍根粉末約lg，精密稱定，置IOOml圓底瓶中，精密加入水50ml，稱定重量，煎煮2小時，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過， 取續濾液，即得。
(2)高效液相色譜條件Shiseido C18MG6mmX 250mm，5 μ m)色譜柱，流動相 0. 02%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0-10min，99%-95%A ;10-15min，95%-93%A ； 15-30min,93% A ；流速1. OmL/min ；進樣量10 μ 1 ；柱溫30°C ;DAD檢測器採集範圍為190 400nm ；檢測波長M5nm。
(3)南板藍根藥材供試品溶液的高效液相色譜指紋圖譜測定將南板藍根藥材供試品溶液進行高效液相色譜法測定，獲得高效液相色譜指紋圖譜，無R，S-告依春特徵色譜峰，且與板藍根高效液相色譜指紋圖譜相似度差，直觀觀察即可區分，見圖7所示圖譜。
權利要求
1.一種測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法，其特徵在於，包括如下步驟a)對待測的板藍根及其製劑樣品進行預處理向待測樣品中加入水，加熱，搖勻，濾過，取續濾液；b)採用高效液相色譜法，測定經預處理後的待測的板藍根及其製劑樣品，獲得特徵指紋圖譜；所述的高效液相色譜法的色譜條件是採用反相十八烷基鍵合相矽膠色譜柱，流動相由A相和B相組成，A相為pH = 3. 0,0. 02%的磷酸水溶液，B相為乙腈，按照以下條件進行梯度洗脫0至10分鐘，流動相A與流動相B的體積比由99 1勻速變化至95 5 ；10至15分鐘，流動相A與流動相B的體積比由95 5勻速變化至93 7 ；15至30分鐘，流動相A與流動相B的體積比為93 7。
2.根據權利要求1所述的測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法， 其特徵在於，所述的待測的板藍根樣品是指板藍根藥材和板藍根飲片，包括南板藍根藥材。
3.根據權利要求1或2所述的測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法，其特徵在於，所述的待測的板藍根樣品的預處理方法如下精密稱取待測樣品粉末，精密加入50倍重量的水，稱重，煎煮2小時，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液。
4.根據權利要求1所述的測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法， 其特徵在於，所述的待測的板藍根製劑樣品是指板藍根顆粒和複方板藍根顆粒，包括含蔗糖型和無蔗糖型。
5.根據權利要求1或4所述的測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法，其特徵在於，所述的待測的板藍根製劑樣品的預處理方法如下取製劑待測樣品，研細， 混勻，精密稱取，加入含蔗糖製劑樣品的10倍重量的水，或加入無蔗糖製劑樣品的20倍重量的水，水浴加熱並振搖使其溶解，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液。
6.根據權利要求1所述的測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法， 其特徵在於，所述的高效液相色譜法採用紫外檢測器，採集範圍為190 400nm ；檢測波長為 245nm。
7.根據權利要求1所述的測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法， 其特徵在於，所述的反相十八烷基鍵合相矽膠色譜柱為C18色譜柱。
8.根據權利要求1所述的測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法， 其特徵在於，流動相的流速為1. OmL/min ；進樣量為10 μ 1 ；柱溫為30°C。
9.根據權利要求1所述的測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法， 其特徵在於，所述的特徵指紋圖譜是指高效液相色譜圖中保留時間tK為5. 2分鐘的1號胞苷峰，保留時間tK為8. 2分鐘的2號尿苷峰，保留時間tK為10. 1分鐘的3號腺苷峰，保留時間tK為11. 6分鐘的4號鳥苷峰，保留時間tK為18. 4分鐘的5號R，S-告依春峰。
10.根據權利要求9所述的測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法，其特徵在於，板藍根、板藍根顆粒和複方板藍根顆粒的高效液相色譜圖中具有5號R， S-告依春峰，南板藍根的高效液相色譜圖中不含5號R，S-告依春峰。
全文摘要
本發明公開了一種測定板藍根及其製劑的高效液相色譜特徵指紋圖譜的方法，包括a)對待測的板藍根及其製劑樣品進行預處理向待測樣品中加入水，加熱，搖勻，濾過，取續濾液；b)採用高效液相色譜法，測定經預處理後的待測的板藍根及其製劑樣品，獲得特徵指紋圖譜。本發明方法首次應用同一高效液相色譜條件可對板藍根、板藍根顆粒、複方板藍根顆粒和南板藍根進行特徵指紋圖譜的檢測與分析，具有簡便快速、重複性好、分析成本低等優點，對板藍根及其製劑進行品質評價和鑑別具有重要指導意義，可應用於新藥研發質控等多個方面，有較強的實用性。
文檔編號G01N30/89GK102507832SQ201110330388
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月26日 優先權日2011年10月26日
發明者李醫明, 王崢濤, 王瑞, 石燕紅, 謝智勇, 黃山君 申請人:上海中醫藥大學