日本對蝦Rab蛋白及其編碼序列及用途的製作方法

2023-12-09 19:17:36

專利名稱：日本對蝦Rab蛋白及其編碼序列及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術和基因工程領域，具體的說，本發明涉及對蝦PJRab蛋白及其編 碼序列，本發明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和製備方法。具體的說，本發明的多肽是 Rab蛋白家族中的一個新成員。
背景技術：
Rab蛋白是小分子GTP結合蛋白家族(由Ras、 Rho、 Rac、 Cdc42、 Ran、 Sar、 Arf、 Rab 等亞家族組成)中最大的亞家族.最早由Novick等在芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae) 中發現(Novick P, Field C, Schekman R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast)。 Rab蛋白是一種單體形式的 GTP結合蛋白，由200個左右的胺基酸組成。Rab蛋白家族成員的胺基酸序列的相似性在 35% 80%之間,也有大於80%的。作為囊泡運輸的分子開關，Rab蛋白與其上遊調控因子和 下遊特定的效應子相互作用，在囊泡的形成、轉運、粘附、錨定、融合等過程中起重要作 用。通過對酵母、線蟲、果蠅、擬南芥和人等生物體中Rab蛋白序列的分析,發現與GTP 結合和水解有關的區域(G1-G3， PM1-PM3)高度保守,Gl的胺基酸序列為F, G2為GNKCD,而 G3為ETSAK，它們是GTP-GDP結合與水解的關鍵結構,PM區域是磷酸或Mg2+結合位點。Rab 蛋白有5個共有的胺基酸序列，可作為Rab蛋白的特徵序列，稱為RabF，分別是 RabFl (IGVDF) 、 RabF2 (KLQIW) 、 RabF3 (RFRSIT) 、 RabF4(YYRGA)和RabF5 (LVYDIT)。另外 還有4個可作為區分Rab蛋白亞家族的序列，稱為RabSF(Rab subfami-lies),它們可能與 Rab蛋白下遊因子的特異結合有關(Stenmark H， Olkkonen V M.The rab GTPase f ami ly[J]. Genome Biology, 2001， 2(5): reviews 3007.1-3007.7 ) (Moore I，Schell J， Palme Subclass-specific sequence motifs identified in Rab GTPases [J], Trends in Biochemical Science, 1995(20): 10-12) (Pereira-Leal J B, Seabra M C. Evolution of the Rab family of small GTP-binding proteins [J], Journal of Molecular Biology, 2001,313)。
Rab蛋白的N端和C端在長度和序列上是高度可變的。Rab蛋白C端均有C、 CC、 CXC
3或cxxx(x表示任意胺基酸)的結構域，該結構域是一種膜定位信號,當其中的半胱氨酸異 戊二烯化修飾後，Rab蛋白具有疏水性，通過C端與膜相連，N端的作用可能是參與指導 C端半胱氨酸進行異戊二烯化修飾。
對蝦白斑綜合症病毒(WSSV)是危害養殖對蝦的最主要病原(Zhang, X.B.,Huang，C. H., Tang， X. H. ， Zhuang， Y. and Hew， C丄Identification of structural proteins from shrimp white spot syndrome virus (WSSV) by 2DE-MS. Proteins 55(2004): 229 -235), 其致病能力強，傳播範圍廣，給世界對蝦養殖業造成了巨大的損失，然而至今仍無有效的 防治方法。有效控制病毒感染是對蝦養殖業可持續發展的關鍵。但目前對於對蝦免疫的分 子機理以及WSSV的感染機制與過程還不清楚，還有許多重大問題有待解決。對蝦類似於 其它無脊椎動物，缺乏高等動物由免疫球蛋白介導的特意性免疫，為了抵禦外界病原體的 入侵，對蝦通過自身的非特意性免疫防禦系統來識別、清除有害異物，達到抗感染和免除 疾患的目的(Roux, M. M. ， Pain, A., Klimpel, K. R., and Dhar, A. K. The Lipopolysaccharide and P -l， 3_ Glucan binding protein gene is 叩regulated in white spot virus-infected shrimp (Penaeus stylirostris) J. ViroL 76(2002): 7140-7149) (Hoffmann, J. A. ， Kafatos， F. C. ， Janeway Jr, C. A. and Ezekowitz, R. A. B. Phylogenetic perspectives in innate immunity. Science 284(1999)s 1313-1318)。
目前，有關對蝦的免疫研究發現對蝦的非特異性免疫包括一系列體液和細胞免疫因子，其 中體液免疫因子包括凝集素、酚氧化酶和抗菌肽等，細胞免疫包括吞噬和形成結節(Lavine,
M. D. ， Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem. Molec. Biol. 32 (2002) 1295-1309)。早期實驗發現，Rab蛋白在抗病蟲下中表達量上調， 可能在對蝦的抗病毒免疫反應中發揮重要作用(Pan D，He N H，Yang Z Y, et al.Differential gene expression profile in hepatopancreas of WSSV-resistant shrimp(Penaeus japonicus)by suppression subtractive hybridiza-tion[J]-Developmental and Comparative Immun- ology，2005，29:103-112)。 因此，為治療對蝦病毒病目的研究和開發對蝦rab多肽有重要意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的日本對蝦的Rab多肽以及其片段、類似物和衍生物。 本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發明的第一方面，提供新穎的分離的日本對蝦的PjRab多肽，該多肽包含 具有SEQIDN0:2胺基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽，或其活性片段，或其活性衍 生物。較佳的，該多肽是具有SEQ ID NO:2胺基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供編碼這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列， 該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列具有至少70%相同性(a)編碼權利要求1和2 所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳的，該多核苷酸編碼具 有SEQ ID NO: 2胺基酸序列的多肽，更佳的，該多核苷酸序列是選自下組的一種(a) 具有SEQ ID N0:1中65-700位的序列；(b)具有SEQ ID NO:l中1-822位的序列:
在本發明的第三方面，提供了含有上述的多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導 的宿主細胞或者上述的多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了具有PjRab活性的多肽的製備方法，該方法包含(1)、 在適合表達PjRab的條件下，培養上述的宿主細胞；(2)、從培養物中分離出具有PjRab 活性的多肽。
在本發明的第五方面，提供了與上述的PjRab多肽特異性結合的抗體，還提供了可用 於檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續的10 100個核苷酸。
在本發明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗PjRab多肽的化合物，以及抑制PjRab 多肽表達的化合物還提供了篩選和/或製備這些化合物的方法。較佳的，該化合物是PjRab 多肽的編碼序列(或片段)的反義序列。
在本發明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在PjRab蛋白的方法，它包括將樣 品與PjRab蛋白的特異性抗體相結合，觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表 示存在PjRab蛋白。
5在本發明的第八方面，提供了本發明多肽和編碼序列的用途。例如本發明的編碼序 列或其片段，可被作為引物用於PCR擴增反應，或被作為探針用於雜交反應。
在本發明的第九方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明的對蝦
Rab多肽或其編碼序列，或含該編碼序列的載體。這些藥物組合物可以用於治療對蝦病毒 病，尤其是對蟲下白斑綜合症。
本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
本發明採用RACE方法，從對蝦血淋巴中篩選得到了一種新的對蝦基因PjRab。經全 序列測定，該cDNA全長為761bp (見SEQ ID NO: 1)，編碼一個由212個胺基酸組成的 PjRab蛋白(見SEQ ID NO: 2),其分子量約23 24KD。同源性分析表明PjRab屬於Rab 基因家族，它能在對蝦的抗病毒免疫反應中發揮作用。
本發明進行了 PjRab基因的組織分布分析，表明其在血淋巴、肌肉、腮、心臟和腸中 表達，因此，PjRab基因可以應用於對蝦多種組織，具有較廣的普遍性。
本發明構建了 pjrab基因的大腸桿菌表達載體，並進行重組表達和蛋白質純化。
本發明還採用RNAi技術特異幹擾Rab基因，使Rab基因的表達受到抑制，研究對蝦 血細胞吞噬活性的變化。結果顯示，當Rab基因的表達受到抑制，會導致蝦血細胞吞噬百 分率和吞噬指數的下降。
本發明還研究了 PjRab對血細胞吞噬作用的影響。研究結果表明Rab蛋白的過量表達 可提高血細胞的吞噬活性。


下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所界定的本發 明範圍。
圖l.顯示了本發明PjRab蛋白的胺基酸序列，採用標準的胺基酸單字母縮寫，全長 蛋白是212個胺基酸；(a)效應子結構域；(b)保守域。
圖2.是對奸PjRab基因編碼的胺基酸序列和來源於不同種類的Rab蛋白的多重比較 圖，功能區(F1-F5),與磷酸鹽/鎂結合的保守位點(PM1-PM3)和鳥苷酸結合位點(G1-G3)圖3.對蟲下PjRab蛋白在大腸桿菌中的重組表達、純化和GTP結合活性實驗結果。
A. PjRab基因編碼的蛋白表達和純化的SDS-PAGE M:標準分子的蛋白Mark, 1:未經 誘導的非重組菌株pGEX-4T-2-DH5 a對照；2:經過誘導的非重組菌株pGEX-4T-2-DH5 a ; 3:未經誘導的含PjRab基因的重組大腸桿菌體；4:經誘導的含PjRab基因的重組大腸杆 菌體；5:純化的GST-PjRab結合蛋白；6:純化的GST蛋白
B. PjRab蛋白的GTP結合檢測SDS-PAGE分離出的蛋白，轉移到硝酸纖維素膜上，用 32P-GTP孵育後，放射自顯影。1,純化的GST-PjRab結合蛋白；2,純化的GST蛋白。
圖4. (A)採用基因特異引物對對蝦不同組織中的PjRab基因進行RT-PCR擴增的結果； 和(B)採用抗GST-PjRab抗體對對蝦不同組織中的PjRab內分泌蛋白的Western blot
結果
圖5.為來源於健康的,感染WSSV病毒和抗WSSV病毒的對蝦體內肝胰腺的PjRab mRNA Real-time PCR檢測結果。
圖6.顯示了 siRNA對對奸血細胞的吞噬作用的影響。
圖7.顯示了注射mRNA對對蝦血細胞的吞噬作用的影響；
具體實施例方式
本發明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式，DNA包括cDNA、基因組DNA和合成 DNA, DNA可以是雙鏈或單鏈的，且如果是單鏈，單鏈可以是編碼鏈和非編碼鏈(反義鏈)， 編碼成熟多肽的編碼序列可以與SEQ ID NO 1中所示的編碼序列相同，也可以是不同的編 碼序列，但該不同的編碼序列(由於基因密碼的重複或簡併的結果)編碼的多肽與SEQID NO 2的相同。編碼SEQ ID NO 2多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列，成 熟多肽的編碼序列和附加編碼序列(如前導序列或分泌序列或前蛋白序列)，成熟蛋白的 編碼序列(和可有可無的附加編碼序列)和非編碼序列(如成熟多肽的5'和/或3'編碼 序列的內含子或非編碼序列)。
術語"編碼多肽的多核苷酸"是指僅為多肽的編碼序列的多核苷酸，也指包括附加編 碼序列和、或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體,該變異體編碼具有本發明PJRab相同的胺基酸
7序列的多肽片斷、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是此多核苷酸的天然存在的 等效變異體或多核苷酸的非天然存在的等效變異體。因此，本發明包括編碼與PJRab同樣 的成熟多肽的多核苷酸，還包括這些多核苷酸的變異體，而這些變異體編碼本發明所述的 多肽的片斷、衍生物或類似物。這些核苷酸變異體包括缺失變異體、取代變異體和添加或 插入變異體。如上述所示，此多核苷酸可以是SEQ ID NO: 1所示編碼序列的天然存在的 等位變異體的編碼序列。
本發明還涉及這樣的多核苷酸，即當與上述的序列有至少50%，較佳地至少70%,更 佳的至少80%相同時可與之雜交的多核苷酸。特別涉及在嚴格條件下與上述多核苷酸雜交 的多核苷酸。如本文所述，"嚴格條件"這個術語是指只有當序列之間有至少95%和最好 至少97%相同時才能雜交。在一優選的實施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸所編 碼的多肽，與SEQIDN0: 1中65 700位的DNA編碼的多肽在生物功能和活性方面實質 相同。
本發明的PJRab核苷酸全長序列或其片段通常可以通過PCR擴增法、重組法或人工合 成的方法得到。對於PCR擴增法可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀 框序列來設計引物，並用本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴 增而得到有關序列。當序列較長時，常常需要進行2次或多次PCR擴增，然後再將各次擴 增出的片段按正確的順序拼接在一起。
一旦獲得了有關序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆 入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到這些序列。
此外，還可以用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，先 合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
本發明還涉及包含本發明的多核苷酸的載體,用本發明的載體製造的遺傳工程宿主細 胞和用重組技術生產的本發明的多肽的產品。通過常規的重組技術，本發明的多聚核苷酸 序列可用來表達或生產重組的PJRab多肽，其步驟一般為
(1)、用本發明的編碼PjRab多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；
(2) 、在合適的培養基中培養轉化或轉導後的宿主細胞；
(3) 、從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。 本發明的多核苷酸序列可以包含在用於表達多肽的眾多表達載體中的任一種中，這些
載體包含染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，比如SV40的衍生物、細菌質粒、噬 菌體DNA、杆狀病毒、酵母質粒、質粒和噬菌體DNA組合衍生而來的載體，病毒DNA如牛 痘病毒、腺病毒、禽痘病毒和狂犬病病毒。總之，只要能在宿主體內存活複製，任何質粒 和載體都可以用。
表達載體最好含有提供篩選轉化的宿主細胞的表型性狀的基因，例如真核細胞培養 用的二氫葉酸還原酶或新酶素抗性，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
表達載體中的DNA序列與合適的表達調控序列(啟動子)連接在一起以指導mRNA 合成，這些啟動子的一些代表性的例子有LTR和SV40啟動子，E.coli. lac或trp啟動 子，噬菌體入PL啟動子和其他一些已知的可調控基因在原核或真核細胞或其病毒細胞中 的表達啟動子。表達載體還包括有翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子，含有上述 適當DNA序列和適當啟動子或調控序列的載體可以用來轉化適當宿主細胞以使宿主細胞 表達此蛋白。
宿主細胞可以是高等真核細胞，例如哺乳動物細胞，或低等真核細胞，例如酵母細胞。 或是原核細胞，如細菌細胞。適當宿主的一些有代表性的例子有動物細胞如CHO， COS 或Bowes黑素瘤細胞；諸如酵母之類的真菌細胞；大腸桿菌、鏈黴菌等等。通過本文的講 解，適當宿主細胞的選擇是本領域熟練技術人員所公知的。
重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。適當的DNA序列可 以通過不同的方法插入載體， 一般來說，DNA序列通過本領域公知的程序被插入合適的限 制性內切酶位點，這些和其它步驟對本領域技術人員是公知的。當宿主細胞為原核細胞如 大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaC12法處理，所用步 驟在本領域內是公知的。另一種方法是使用MgC12。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿
9主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規的培養基。在適合宿主細胞的環境下培養。 當宿主細胞長到合適的細胞密度之後，選用的啟動子即可用適當的方法(如溫度轉換或化 學誘導)，細胞再培養一段時間，細胞經離心後收穫，用物理或化學方法破碎細胞，得到 的粗提物留作進一步純化用。破碎包括凍融法、超聲波法、機械破碎法等；純化包括用硫 酸銨或乙醇沉澱、陰離子或陽離子交換層析、親和層析、高效液相層析(HPLC)等等。
在本發明中，術語"Rab蛋白"、"Rab多肽"或"PjRab蛋白"、"PjRab多肽""對 蟲下蛋白Rab"可互換使用，都指具有Rab胺基酸序列(SEQ ID N0: 2)的蛋白或多肽。它 們包括含有或不含有起始甲硫氨酸的Rab蛋白。
如本文所用，"分離的"是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原 始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化 的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化 的。
如本文所用，"分離的Rab蛋白或多肽"是指Rab多肽基本上不含天然與其相關的其 它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化Rab 蛋白。
本發明中的多肽可以是天然多肽、重組多肽或合成多肽，優選是重組多肽。本發明的 多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物,或使用重組技術從原核或真核宿主(例 如。細菌、酵母、髙等植物和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本 發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的，本發明的多肽還可包括或不包括起始 的甲硫氨酸殘基。
本發明還涉及SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的多肽和這種多肽的片段、類似物和衍生物。
本發明中的多肽可以是天然多肽、重組多肽或合成多肽，優選是重組多肽。本發明的 多肽可以是天然純化的產物,或是化學合成的產物,或使用重組技術從原核或真核宿主(例 如。細菌、酵母、高等植物和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的，本發明的多肽還可包括或不包括起始 的甲硫氨酸殘基。
當指本發明的多肽時，術語"片段"、"衍生物"和"類似物"指保留與此多肽相同的 生物學功能或活性的多肽。因此，類似物包括切除部分蛋白原後能被激活以產生活性成熟 多肽的蛋白原。本發明的多肽片段、類似物和衍生物，可以是(1)、有一個或多個保守或 非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的被取代的胺基酸 殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(2)、在一個或多個胺基酸殘基中包括一個 取代基團的多肽，或(3)、成熟多肽與另一個化合物(如延長多肽半衰期的化合物，例如 聚乙二醇)融合所形成的多肽。或附加的胺基酸序列融合到此多肽序列形成的多肽(如前 導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。根據本文的教導，這些片段、 衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
一類特殊的Rab類似物是在其它生物(如酵母、果蠅、線蟲、斑馬魚和光滑爪蟾等) 中Rab的同源蛋白，這些其他物種的同源蛋白的編碼序列，可根據本發明公開的序列，通 過雜交或擴增的方法而得到，進而通過常規重組方法獲得這些同源蛋白。
在本發明中，術語"Rab蛋白"是指具有Rab蛋白活性的SEQ ID N0:2序列的多肽。 該術語還包括具有與Rab蛋白相同功能的、SEQ IDN0:2序列的變異形式。這些變異形式 包括(但不限於)若干個(通常為1—50個，較佳地1一30個，更佳地1一20個，最佳 地I一IO個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個 (通常為20個以內，較佳地為IO個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域 中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C 末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括Rab 蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導 突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與對蝦Rab基因DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及 利用抗Rab多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了對 蝦Rab多肽的可溶性片段。通常，該片段具有對蝦Rab多肽序列的至少約10個連續氨基
11酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個 連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
本發明還提供對蝦Rab蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然對蝦Rab多肽的差別 可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。 這些多肽包括天然或誘導的遺傳多變體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射 或暴露與誘變劑而產生隨機誘變，還可以通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。 類似物還包括具有不同於天然L一胺基酸的殘基(如D—胺基酸)的類似物，以及具有非 天然存在的或合成的胺基酸(如e、 Y—胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不 限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化 或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖 基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的 糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸、 磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提髙了其抗蛋白水解性能或優化了 溶解性能的多肽。
另一方面,本發明還包括對對蝦Rab基因DNA或是其片段編碼的具有特異性的多克隆 抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體，這裡，"特異性"是指抗體能結合於對蝦Rab基 因產物或其片段。較佳地，指那些能與對奸Rab基因產物或其片段結合但不認識和結合於 其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制對蝦Rab蛋白的分 子，也包括那些並不影響對蝦Rab蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經稀 釋形式的對蝦Rab基因產物結合的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的對 蟲下Rab基因產物或其具有抗原性的片段，可被施用於動物(如家兔，小鼠等)以誘導多克 隆抗體的產生。與之相似的，表達對蝦Rab蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫 動物來生產抗體。可使用多種佐劑增強免疫反應，其中包括(但不限於)弗氏佐劑等。本發明提供了一種檢測樣品中是否存在PJRab蛋白的方法，它包括將樣品與PjRab 蛋白的特異性抗體相結合，觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示存在 PjRab蛋白。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供、更佳的被純化至均質。 本發明重組的PjRab蛋白或多肽有多方面的用途，這些用途包括(但不限於)直接 作為藥物治療對蝦病毒病，和用於篩選促進或對抗PJRab蛋白功能的抗體、多肽或其它配 體。用表達的重組PjRab蛋白篩選多肽庫可用於尋找有治療價值的能抑制或刺激PjRab 蛋白功能的多肽分子。
本發明多肽和多核苷酸的其它用途，例如將本發明的多肽用途肽指紋圖譜鑑定，本發 明對蝦RAB的編碼序列或其片段，可被作為引物用於PCR擴增反應，或者作為探針用於雜 交反應，或者用於製造基因晶片或微陣列，根據本發明的教導，這些應用對於本領域技術 人員而言是顯而易見的。
在本發明的一個實施例中，採用RNAi技術抑制Rab基因的表達，用FITC標記的副溶 血弧菌檢測細胞吞噬百分率和細胞吞噬指數均顯著下降；在本發明的另一個實施例中，利 用注射mRNA的方法，發現吞噬百分率和細胞吞噬指數上調，表明對蝦Rab蛋白可通過調 控血細胞吞噬活性參與抗病毒免疫。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，應理解，這些實施例僅用於說明本發明而
不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件， 如sambook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。 實施例l:對蝦RAB基因cDNA的克隆
(1) 對蝦組織總RNA的提取對蝦組織快速剪切後，在TRIzol試劑(Invitrogen公 司，美國)中勻漿，按試劑盒說明書提取總RNA。
(2) 對!ll下PjRab基因的RACE和序列分析
13RACE (Rapid amplification of cDNA ends)採用5，、 3， RACE試劑盒(Roche公司， 美國)，按試劑盒說明書進行5'和3' cDNA末端快速擴增。3'末端採用引物5' GACCACGCGTA TCGATGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTA3，作為cDNA合成的前導鏈，正向引物(forward primer) 5' GTTCATTGAGACTAGTGCGA3'和反向引物(reverse primer ) 5' GACCACGCGTATCGATGTCGAC3' 用於之後的PCR擴增。
5， cDNA末端快速擴增以Rab基因(gi48766845)特異性引物5-1: 5' AACAACAACAGC-TACTGTAG3'按照試劑盒說明逆轉錄合成cDNA,回收cDNA後根據5' RACE試劑盒說明用5' 末端轉移酶在cDNA上加上poly A,以此cDNA為模板,加入引物5-1和dT-anchor引物(5' GACCA CGCG-TATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTA3，)進行第一輪PCR擴增，先94'C5min, 35個循環94'C45s, 52'C30s, 72'C30s,最後72'C延伸10 min。以第一輪擴增產物稀釋20 倍作為模板，加入基因特異性引物5-2: 5， GGACAGGMGTCGATGCCGA3'和anchor引物5' GACCACGCG-TATCGAT GTCGAC3，進行第二輪擴增，條件同上。常規方法回收產物，連接到 pMD-18T (TaKaRa公司，日本)載體上測序。
(3) 3， RACE末端快速擴增.以5， GACCACGCGTATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTA3， 為引物逆轉錄出cDNA後，以引物5' GACCACGCGTATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTA3'和 Rab基因特異性引物3-1:5' AGGAGCTTAATGTTATGTTC3，進行第一輪擴增，以基因特異性引 物3-2:5' TTGA CATGGACCGAAGTTGT3，和引物5' GAC CACGCGTATCGATGTCGAC3'進行第二 輪擴增，常規方法回收產物，連接到pMD-18T (TaKaRa公司，日本)載體上測序。
CDNA序列採用DNAMAN軟體(LynnonBioSoft, Vaudreuil,加拿大)分析，根據PjRab基 因推導出來的胺基酸序列在GenBank上用BLAST程序再次搜索，DNAMAN軟體自動生成序 列排列表，蛋白質圖譜採用PR0SITE分析。
結果發現了一個調控抗對蝦WSSV的Rab基因，該基因的全長序列如SEQ NO ID: 1 所示。從65 700bp包含一個長度為636 bp的開放閱讀框(叩en readingframe， 0RF),編 碼212個胺基酸，如SEQN0 ID: 2所示。我們將此基因命名為對蝦PjRab基因，所對應 的蛋白為PJRab蛋白。
本發明PJRab蛋白和巳知的rab蛋白同源性比較見圖2，應用DNAMAN軟體，將PjRab
14與酵母(S. cerevisiae)、果蠅(D. melanogaster)、線蟲(C. elegans)、人(H. sapiens)、大 猩猩(P. troglodytes)、狗(C. familiaris)、斑馬魚(Danio rerio)和光滑爪蟾 (Xenopuslaevis)進行同源比較，結果表明PjRab與它們的同源性分別是59. 2%、 87. 4%、 74%、 81%、 81%、 80.5%、 77.6%、 79.58%。
PjRab蛋白具有小G蛋白共有的與GTP結合、分解相關的6個保守區，即17 24位 的GEQSVGK, 36位的F， 43位的T， 66 71位的DTAGQE， 124 127位的NKTD, 150 156 位的FIETSAK.同時，PjRab蛋白具有Rab蛋白的5個保守區，即44 48位的IGIDF, 61~ 65位的RLQLW， 72 76位的RFRSL， 79 83位的SYIRD和90 94位的VYDIT(見圖1A, B)。 大部分Rab的C端為C、 CC、 CXC或CXXX(X表示任意胺基酸)的結構域,該結構域是一種膜 定位信號，當其中的半胱氨酸異戊二烯化修飾後,Rab蛋白具有疏水性,通過C端與膜相 連.N端的作用可能是參與指導C端半胱氨酸進行異戊二烯化修飾.分析PjRab的胺基酸序 列發現，PjRab的C端為CLLNL,與絕大多數的Rab蛋白不同.因此，PjRab是一種新的Rab 蛋白。
實施例2: pjrab基因在大腸桿菌中的重組表達和蛋白質純化
以對蟲下cDNA為模板，以引物5， AAGGATCCATGTCGGGCGMTTCGG3， (SEQN0 ID: 3)和5' AAGTC GACTTAAAGGTTMGCAAGC3' (SEQ NO ID: 4)PCR擴增特異的基因片段，擴增後的基 因片段常規方法酶切、連接載體pGEX-4T-2、轉化E.coli感受態細胞、菌落PCR初篩重 組子，挑取轉化菌若干個進行菌落PCR檢測，隨機挑取l個陽性菌落，搖培後提取質粒進 行Hiridm和BamHI雙酶切鑑定，經測序驗證，插入序列是正確的，它們都可切出預期片 段，以上鑑定說明此基因克隆成功。測序驗證插入片段的序列正確後，挑取含有重組質粒 的單菌落於5mL LB液體培養基(含氨苄青黴素100g/mL) ， 37'C搖培過夜，按1 : 100的比 例吸取菌液於新的250 mL LB液體培養基(含氨苄青黴素100g/mL), 37'C搖培至0D600為 0. 6左右時加入異丙基-e -D-硫代半苷(IPTG)至終濃度0. 25mmol/L， 37C繼續搖培4 6 h。誘導表達的菌液於5000rpm離心5 min收集菌體，加入冰冷的15mLl XPBS緩衝液，冰 浴條件下超聲裂解細菌(150WX10sX10次)，間10s。 4'C下10, OOOXg離心20rain後上清與預先用1XPBS緩衝液平衡的Glutathione S印harose 4B混勻，4"C輕搖30min,裝GST 柱。用5 10個柱床體積的洗滌緩衝液(1XPBS)洗去雜蛋白，至流出液的0D280接近於零 後用洗脫緩衝液(50mmol/L Tris-HC1 ， 10mmol/L還原型穀胱甘肽,pH8.0)洗脫目的蛋白。 SDS-PAGE鑑定純化的GST融合蛋白，Bradford法測定蛋白質濃度，蛋白質分裝後置-70 'C保存備用。
實施例3: GTP結合試驗
GST-PjRab結合蛋白和作為對照的GST蛋白樣品進行2組12%SDS-PAGE後，將其中一 組的凝膠用託馬斯藍染色，另一組蛋白樣品轉至硝酸纖維素膜，與放射性的Y32P-GTP結 合後,進行放射自顯影以檢測GST-PjRab的GTP結合能力。結果表明，純化後的目標蛋白 有一條信號帶，而對照的GST純化蛋白沒有帶(見圖3B)，說明GST-PjRab蛋白具有GTP 結合活性。
以上結果說明經表達、純化到的蛋白是典型的Rab蛋白。 實施例4: pjrab在對蝦體內表達的RT-PCR分析
反轉錄後，從肌肉，淋巴液，腮等地方所提取的1 u g的總RNA與1 " 1 oligo-d(T) 18 primer混合，加DEPC-treated水至總體積為12 u 1。混合物於70'C孵化5 min，然後冰 浴冷卻。反應混合體系為1 ulM-MLV RT (Promega)， 1 u ldNTP(10niM each; Promega), 1 y 1 RNasin頃核酸酶抑制劑(Promega), 5 y 1M-MLV 5，反應緩衝液(Promega)和5 " 1DEPC-treated水混合，然後於42。C孵化60min。最後，反應於70'C加熱15min後停止。cDNA 於-20'C保存備用。採用PjRab基因特異引物擴增。作為正對照，對蝦中的P-肌動蛋白採 用引物e -actinF (ATGTGTGACGACGMGTAGC)和引物e -actinR (GMGCACTTCCTGT GMCGA) 擴增。擴增結果見圖4A。
PjRab mRNA的RT-PCR組織分布分析表明，PjRab基因在對蝦各組織中是普遍存在的， 如淋巴液，肌肉，鰓，心臟等等。
實施例5:抗體準備
純化的GST-PjRab結合蛋白用於鼠的內皮層注射免疫，免疫期為8周，每2周注射依
16次。第一次注射採用5ug抗原和同體積的Freund， s complete adjuvant (Sigma公司) 混合物。之後的注射採用5ug抗原和同體積的Freund， s incomplete adjuvant (Sigma 公司)混合物。免疫球蛋白(IgG)片段採用protein A-S印harose (Bio-Rad公司)純化，-70 'C保存。抗體濃度採用1: 10,000 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)測定。 實施例6: Western blot
從不同對蝦組織中提取的蛋白樣品(淋巴液、肌肉、腮、心臟和腸等)在12%SDS-PAGE 中分析。然後蛋白樣品轉移到硝酸纖維素膜上，PBS緩衝液(pH7.4)清洗後，膜浸入 blocking buffer (1% BSA， PBS, pH7.4) at， 4'C過夜之後與多克隆鼠抗-GST-PjRab IgG 孵化2h。隨後，膜再與AP-conjugated goat anti-mouse IgG (Sigma)孵化lh， NBT和 BCIP solutions檢測(BBI, Canada)。實驗結果見圖4B，結果顯示GST-PjRab的抗體與淋 巴液，肌肉，鰓，心臟等處的PjRab蛋白有很強的特異結合反應。
以上結果表明重組表達的PjRab蛋白與原先組織器官中所表達的一致。
實施例7: PjRab基因在抗WSSV對蝦中的表達分析
PjRab mRNA的Real-time PCR採用基因特異引物和TaqMan螢光標記探針，對照組為 P-肌動蛋白mRNA的.TaqMan PCR擴增，其寡聚核苷酸引物和TaqMan探針採用Primer Express Program (Perkin-Elmer Applied Biosystems)設計。PjRab的正義和反義引物 分別為5' GCATGGAGTCCACCGAGAA3'和5' CGGAGTCTCGCAGCACMC3',相應的TaqMan探針 為5， FAM- AAGMGGTTGACATGGACCGA-TAMRA3， 。 P -a肌動蛋白的正向和反向引物分別為5， CGAGCACGGCATCGTTACTA3，和5， TTGTAGAMGTGTGATGCCAGATCT3，，相應的TaqMan探針為 5， R0X-CTGGGAC GACATGGA-Dabcyl3'。
Real-time PCR反應在ABI7500 (A卯lied Biosystems,美國)中進行。反應混合物(25 yl)含cDNA片段，每個引物各200nM，每個TaqMan探針各100nM，反應緩衝液中含DNA 聚合酶。PCR擴增反應先50t:2min，然後45個循環95'C45s， 52'C45s， 72'C45s。
用Real-time PCR技術分析PjRab基因在抗WSSV病對蟲下和不同時間感染WSSV病對蟲下 中的肝胰腺中的轉錄數量(0和感染後2， 4， 8, 12， 24, 48， 72h )。結果表明PjRab mRNA表達量在感染4h後開始顯著上升，在感染48h後達到最高水平(圖5)。而同時抗WSSV病 對蝦中的PjRab表達量是有限的。
以上結果表明PjRab基因與對4下抗病毒感染免疫反應密切相關。
實施例8: RNAi對Rab基因的抑制對血細胞吞噬功能的影響作用 採用RNAi技術特異幹擾Rab基因，使Rab基因的表達受到抑制，研究對蝦血細胞吞 噬活性的變化。結果顯示，在特異序列PjRab-siRNA幹擾12h後，血細胞的吞噬百分率和 吞噬指數明顯下降，且在48h和72h達到最低值(圖6A),吞噬百分率和吞噬指數分別為 的對照的30%和50%;而對照組中(分別注射突變siRNA和隨機打亂序列的siRNA)血細 胞的吞噬百分率未有明顯變化(圖6 B、 C)。說明在對蝦中RNAi具有顯著序列特意性， Rab蛋白在對蝦的血細胞吞噬過程中起了重要的調控作用，當Rab基因的表達受到抑制， 會導致蝦血細胞吞噬百分率和吞噬指數的下降。
實施例9: mRNA對血細胞吞噬功能的影響
為了進一步探討PJRab對血細胞吞噬作用的影響，將體外合成的mRNA注射入對蝦體 內。結果顯示，在注射mRNA4h後，血細胞的吞噬百分率和吞噬指數均有所上升(圖7A); 而沒有注射mRNA的對照組，血細胞的吞噬作用則沒有變化(圖7B)。本結果表明Rab蛋 白的過量表達可提高血細胞的吞噬活性。
18序列表
< 110〉國家海洋局第三海洋研究所 〈120〉日本對蝦Rab蛋白，其編碼序列及用途 <160〉4
<210〉1
〈2U〉822bp
〈212〉DNA
<213〉日本對蟲下(Peneaus japonicus)
<220〉 <221〉CDS
<222〉 (65)…(700) 1
1attaccacagactataagatatacg3ttaaccacgacattatacgcaattaactacactg
61a幼3ettgtcgggcg幼ttcgga犯cccgttg站ggiaattc犯gctcgtcttcctcggcga
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<210〉2
212bp
PRT
日本對蟲下(Peneaus japonicus) 2
MetSerGlyGluPheGlyAsnProLeuArgLysPhe Lys Leu Val15
PheLeuGlyGluGinSerValGlyLysThrSerLeu lie Thr Arg30
PheMetTyrAspSerPheAspAsnThrTyrGinAla Thr lie Gly45
lieAspPheLeuSerLysThrMetTyrLeuGluAsp Arg Thr Val60
ArgLeuGinLeuTrpAspThrAlaGlyGinGluArg Phe Arg Ser75
LeulieProSerTyrlieArgAspSerThrValAla Val Val Val90
TyrAsplieThrAsnAlaAsnSerPheHisGinThr Ser Lys Trp105
lieAspAspValArgThrGluArgGlySerAspVal lie lie Val120
LeuValGlyAsnLysThrAspLeuSerAspLysArg Gin Val Ser135
ThrGluGluGlyGluArgLysAlaLysGluLeuAsn Val Met Phe150
lieGluThrSerAlaLysAlaGlyTyrAsnValLys Gin Leu Phe165
ArgArgValAlaAlaAlaLeuProGlyMetGluSer Thr Glu Asn180
LysLysValAspMetThrGluValValLeuArgAsp Ser Glu Asn195
AlaAlaAsplieGlyArgThrAlaAspGlyGlyMet Cys Leu Leu210
AsnLeu212
203
25bp
DNA
<213〉合成的引物 3
AAGGATCCATGTCGGGCGMTTCGG
4
25bp
<212〉腿
合成的引物
4
AAGTCGACTT雄GGTTAAGCAAGC
權利要求
1、一種分離的日本對蝦Rab多肽，其特徵在於，它包含具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2、 如權利要求l所述多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQIDNO:2胺基酸序列的多肽。
3、 一種分離的多核苷酸，其特徵在於，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組 的一種核苷酸序列有至少70%的相同性(a) 、編碼權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b) 、與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4、 如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼具有SEQ ID N0:2所示 胺基酸序列的多肽。
5、 如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a) 、具有SEQ ID NO 1中65-700位的序列；(b) 、具有SEQ ID NO 1中1-822位的序列；
6、 一種載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7、 一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它是選自下組的一種宿主細胞(a) 、用權利要求6所述的載體轉化或轉導的宿主細胞(b) 、用權利要求3所述的多核苷酸轉化或轉導的宿主細胞。
8、 一種具有對蝦Rab活性的多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a) 、在適合表達對蝦Rab的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b) 、從培養物中分離出具有對蝦Rab活性的多肽。
9、 一種能與權利要求1所述的對蝦Rab多肽特異性結合的抗體。
10、 一種藥物組合物，其特徵在於，其特徵在於，它含有安全有效量的權利要求1所述的 多肽以及藥學上可以接受的載體。
全文摘要
本發明涉及一種新型Rab蛋白。採用RACE方法，從對蝦血淋巴中篩選得到了一種新的對蝦基因PjRab，該cDNA全長為761bp(見SEQ ID NO1)，編碼一個由212個胺基酸組成的PjRab蛋白(見SEQ ID NO2)。本發明還提供該蛋白和核酸序列的製備方法和用途。此外，本發明採用RNAi技術證實了PjRab蛋白在對蝦的血細胞吞噬作用中起著重要的調控作用，以及公開了PjRab蛋白用於治療對蝦病毒病的應用。
文檔編號C07K14/435GK101492501SQ200810070530
公開日2009年7月29日 申請日期2008年1月22日 優先權日2008年1月22日
發明者吳文林, 宗榮榮, 章曉波 申請人:國家海洋局第三海洋研究所