一種快速測定葡萄糖氧化酶活力的方法

2023-12-10 02:25:41

一種快速測定葡萄糖氧化酶活力的方法
【專利摘要】本發明涉及分析化學領域，具體涉及一種快速測定葡萄糖氧化酶活力的方法。所述方法包括以下步驟：(1)繪製過氧化氫濃度-鄰聯茴香胺顯色劑吸光值標準曲線；(2)對待測葡萄糖氧化酶樣品進行預處理；(3)利用過氧化氫濃度-吸光值標準曲線計算試驗樣品中葡萄糖氧化酶活力。該方法快速可靠，操作簡單，靈敏準確。該檢測方法原理是在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖和氧反應，生成葡萄糖酸和過氧化氫，過氧化氫和無色的還原型鄰聯茴香胺在過氧化物酶的作用下，生成水和棕色的氧化型鄰聯茴香胺，棕色的氧化型鄰聯茴香胺與硫酸溶液反應變為粉紅色，可於最大吸收波長540nm處快速比色測定。
【專利說明】一種快速測定葡萄糖氧化酶活力的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及分析化學領域，具體涉及一種快速測定葡萄糖氧化酶活力的方法。

【背景技術】
[0002] 甸萄糖氧化酶（Glucose oxidase，E. C. I. 1. 3. 4,簡稱G0D)是一種需氧脫氧酶，其 系統命名為β-D-葡萄糖氧化還原酶。該酶最早於1928年由Mflller從黑麴黴中分離並報 道，Pazur於1965年獲得了純的葡萄糖氧化酶。在有氧氣存在的情況下，葡萄糖氧化酶能 專一性地氧化β -D-葡萄糖，生成葡萄糖酸和過氧化氫，在葡萄糖酸鹽生產工業、食品添加 齊U、動物飼料添加劑、生化檢測和生物傳感器等方面具有廣泛的應用。
[0003] 目前，葡萄糖氧化酶活力主要的檢測方法有滴定法、電化學法和分光光度法。滴定 法的原理是葡萄糖氧化酶酶催化葡萄糖生成葡萄糖醛酸，再通過酸鹼滴定可以間接測定出 葡萄糖醛酸的產量，然後根據葡萄糖醛酸的產生量計算出GOD的酶活力。此方法雖然簡單 易行，成本低，但是該方法存在檢測誤差大和靈敏度低的缺點，而且需要進行繁複的移液滴 定操作，工作量較大。電化學法的原理是根據酶促反應中的電壓或電流的變化來測量氧化 還原性酶活力，以氧電極進行測定，然而這個方法容易受到檢測液中溶氧和其他電化學活 性物質的幹擾，從而影響實驗結果。分光光度法的原理是在有氧的情況下，葡萄糖氧化酶催 化β -D-葡萄糖產生葡萄糖酸和過氧化氫。隨後，辣根過氧化物酶（HRP)催化過氧化氫與顯 色底物發生反應，然後採用分光光度計檢測生成的有色物質。目前利用此原理進行GOD酶 活力檢測的方法主要有靛紅褪色法、醌亞胺法、鄰苯二胺法和鄰聯茴香胺法等。雖然分光光 度法非常靈敏，但遺憾的是以上的方法在已報導的文獻中存在著顯色物質不穩定，數據重 復性不好，標準曲線線性範圍較窄以及檢測GOD酶活力結果較低的情況，尚停留在定性分 析的基礎上，不適合進行推廣和制定標準。因此，建立快速、準確、靈敏和檢測成本低的GOD 酶活力檢測方法一直是研究工作者努力追求的目標。
[0004] 為了克服GOD酶活力檢測體系的缺點，設計出快速可靠，操作簡單，靈敏準確的檢 測方法，拓寬檢測體系的適用範圍，改正不合理的因素，本發明提供一種定性和定量測定葡 萄糖氧化酶活力的方法，通過反覆驗證，建立了較為實用可靠的酶活力檢測體系。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種定性和定量測定葡萄糖氧化酶活力的方法。
[0006] 根據本發明的快速測定葡萄糖氧化酶活力的方法包括以下步驟：
[0007] (1)繪製過氧化氫濃度-鄰聯茴香胺顯色劑吸光值標準曲線，先分別吸取過氧化 氫標準溶液0. 25mL、0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0. 6mL、0. 7mL和0. 75mL，分別用磷酸鹽緩衝液定 容至25mL，配成終濃度分別為24μ g/mL?72μ g/mL的過氧化氫濃度梯度系列，在試管中依 次加入2. 5mL鄰聯茴香胺稀釋液、0. 3mL葡萄糖溶液、0. ImL辣根過氧化物酶溶液，混勻後再 分別加入上述不同濃度過氧化氫標準溶液各〇. lmL，混勻後加入2mL 2mol/L的硫酸溶液， 振蕩均勻後在540nm處用Icm杯測定吸光值。以吸光值為橫坐標，過氧化氫濃度為縱坐標 繪製標準曲線；
[0008] (2)對待測葡萄糖氧化酶樣品進行預處理，以磷酸緩衝液稀釋樣品，稀釋後的樣品 中葡萄糖氧化酶活力控制在〇. 8?2. 8U/mL之間；
[0009] (3)反應時，在試管中依次加入2. 5mL鄰聯茴香胺稀釋液、0.3mL葡萄糖溶液、 0. ImL辣根過氧化物酶溶液，振蕩均勻後在規定溫度水浴5min後，測定管加入已稀釋的酶 樣品溶液〇. lmL，在規定溫度反應3min後，加入2mol/L的硫酸溶液2mL終止反應，振蕩均勻 並冷卻至室溫後，在540nm處用Icm杯測定吸光值，以熱失活的酶液做空白對照，利用過氧 化氫濃度-吸光值標準曲線計算試驗樣品中葡萄糖氧化酶活力。
[0010] GOD酶活力的檢測原理如下所示：
[0011] 整個過程包括三個步驟：
[0012] 第一步，在水溶液中，在GOD的存在下，Imol β -D-葡萄糖和Imol分子氧反應生成 Imol葡萄糖酸和Imol的過氧化氫；
[0013] 第二步，過氧化氫和無色的還原型鄰聯茴香胺在辣根過氧化物酶的作用下，生成 水和棕色的氧化型鄰聯茴香胺；
[0014] 第三步，棕色的氧化型鄰聯茴香胺與硫酸溶液反應生成粉紅色的氧化型鄰聯茴香 胺。
[0015]

【權利要求】
1. 一種快速測定葡萄糖氧化酶活力的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟： (1) 繪製過氧化氫濃度-鄰聯茴香胺顯色劑吸光值標準曲線，先分別吸取過氧化氫標 準溶液0. 25mL、0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0. 6mL、0. 7mL和0. 75mL，分別用磷酸鹽緩衝液定容至 25mL，配成終濃度分別為24 μ g/mL?72 μ g/mL的過氧化氫濃度梯度系列，在試管中依次加 入2. 5mL鄰聯茴香胺稀釋液、0. 3mL葡萄糖溶液、0. lmL辣根過氧化物酶溶液，混勻後再分別 加入上述不同濃度過氧化氫標準溶液各〇. lmL，混勻後加入2mL 2mol/L的硫酸溶液，振蕩 均勻後在540nm處用lcm杯測定吸光值。以吸光值為橫坐標，過氧化氫濃度為縱坐標繪製 標準曲線； (2) 對待測葡萄糖氧化酶樣品進行預處理，以磷酸緩衝液稀釋樣品，稀釋後的樣品中葡 萄糖氧化酶活力控制在〇· 8?2. 8U/mL之間； (3) 反應時，在試管中依次加入2. 5mL鄰聯茴香胺稀釋液、0. 3mL葡萄糖溶液、0. lmL辣 根過氧化物酶溶液，振蕩均勻後在規定溫度水浴5min後，測定管加入已稀釋的酶樣品溶液 0. lmL，在規定溫度反應3min後，加入2mol/L的硫酸溶液2mL終止反應，振蕩均勻並冷卻 至室溫後，在540nm處用lcm杯測定吸光值，以熱失活的酶液做空白對照，利用過氧化氫濃 度-吸光值標準曲線計算試驗樣品中葡萄糖氧化酶活力。
【文檔編號】G01N21/31GK104237145SQ201410409560
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月19日 優先權日:2014年8月19日
【發明者】郭盧雲, 詹志春, 周櫻, 顧愛玲, 王大春, 黃小森 申請人:武漢新華揚生物股份有限公司