一種用於監測漆酶構象變化的免標記紫外吸收光譜法

2023-12-09 20:13:56 1

一種用於監測漆酶構象變化的免標記紫外吸收光譜法
【專利摘要】本發明公開了一種用於監測漆酶構象變化的免標記紫外吸收光譜法。首先將3-疊氮-7-羥基香豆素與漆酶一起加入到九種不同濃度的尿素溶液中，經充分反應後再用紫外光譜儀在400~700nm範圍內採集上述含有3-疊氮-7-羥基香豆素、漆酶和尿素的混合溶液的吸收光譜，最後繪製漆酶在不同尿素濃度條件下的紫外吸收光譜變化趨勢圖，根據該紫外吸收光譜變化趨勢圖就能監測漆酶構象變化。本發明在操作過程中僅需要將漆酶、3-疊氮-7-羥基香豆素在尿素溶液中進行簡單混合，不需要任何的標記過程就能達到監測漆酶構象變化的目的，大大降低了操作的複雜性，減少了監測時間。此外，本發明用於對漆酶構象變化的監測取得了較為滿意的結果，顯示出高效、專一、及時、簡單的優勢。
【專利說明】一種用於監測漆酶構象變化的免標記紫外吸收光譜法
【技術領域】
[0001]本發明屬於分析化學領域，尤其是涉及一種用於監測漆酶構象變化的免標記紫外吸收光譜法。
【背景技術】
[0002]漆酶(EC 1.10.3.2)主要分布在大部分植物和真菌中。由於漆酶能有效催化大量有機和無機化合物，將化合物中分子氧還原為水，例如酚類化合物和有機胺類，因此被廣泛用於免疫檢測、生物傳感、染料的合成和脫色等領域。此外，漆酶還是一種多銅蛋白，包括4個銅離子，可分為三類:分別為分布在三區的I型銅(Cul)，以及分布在一區與三區交界處的II型銅(Cu2)和III型銅(Cu3a and Cu3b)。在漆酶結構中，這些銅離子均與組氨酸和色氨酸相結合，共同作為漆酶的催化中心。
[0003]在生理條件下，許多蛋白質都以本身自然摺疊的形式存在，其中氫鍵在蛋白質摺疊過程中發揮著舉足輕重的作用。如果將蛋白質進行加熱，或暴露在酸性、鹼性環境，或與變性劑如尿素、鹽酸胍和乙醇等物質相混合時，都容易使蛋白質中的氫鍵發生斷裂，引起蛋白質產生去摺疊作用，導致蛋白質構象發生變化，例如三維結構坍塌，成為一維或者二維結構。為了更好地了解蛋白質功能與它的序列、構象之間的關係，研究者們提出很多監測方法用於研究蛋白質的摺疊和去摺疊狀態、以及構象變化過程等，例如螢光法、圓二色譜法、毛細管電泳法、質譜法、電化學法、近紅外光譜法等。紫外吸收光譜法由於成本低、操作簡單、選擇性高而受到廣泛關注，但是目前採用紫外吸收光譜法對蛋白質構象變化進行監測的報導非常少。因此，開發一種 簡單、高效的免標記紫外吸收光譜法去監測蛋白質的構象變化是十分必要的。
[0004]
【發明內容】
:
本發明的目的在於提供一種方法簡單、成本低、特異性好的用於監測漆酶構象變化的免標記紫外吸收光譜法，該方法在操作過程中僅需要將漆酶、3-疊氮-7-羥基香豆素在尿素溶液中進行簡單混合，不需要任何的標記過程，從而大大降低了操作的複雜性，減少了監測時間。
[0005]本發明的目的是按照如下方式實現的:
一種用於監測漆酶構象變化的免標記紫外吸收光譜法，特徵是:具體步驟如下:
(1)按照參考文獻(Sivakumar,K.; Xie, F.; Cash, B.M.et al., A Fluorogenic1，3—Dipolar Cycloaddition Reaction of 3-Azidocoumarins and Acetylenes.0rg.Lett., 2004, 6，4603-4606.)所示的方法，採用二羥基苯甲醛、N-乙醯甘氨酸和疊氮化鈉製備3-疊氮-7-羥基香豆素；
(2)將5.0 μ? 10 mg/mL的漆酶和5.0 μ? 0.25 mM 3-疊氮-7-羥基香豆素分別加入至九種不同濃度且均為190 PL的尿素溶液中，九種尿素溶液的具體濃度分別為0.0 MU.0Μ、2.0 Μ、3.0 Μ、4.0 Μ、5.0 Μ、6.0 Μ、7.0 Μ、8.0 Μ，在 4 °C 下培育 1.0 小時，混合後攪拌均勻，促使尿素對漆酶產生變性作用，引起漆酶構象變化；(3)在步驟(2)反應結束後，採用紫外光譜儀在40(T700nm範圍內分別採集步驟(2)中九種反應後的尿素溶液的吸收光譜；
(4)根據九種尿素溶液的尿素濃度和紫外吸收強度，繪製漆酶在不同尿素濃度條件下的紫外吸收光譜變化趨勢圖，根據該紫外吸收光譜變化趨勢圖就能監測漆酶構象變化。
[0006]在步驟(2 )中，尿素溶液是由尿素溶解在乙酸緩衝液中配製而成，並將pH值調製為 6.0。
[0007]3-疊氮-7-羥基香豆素的疊氮基團是一個給電子基團，導致該化合物的紫外吸收較弱。但是3-疊氮-7-羥基香豆素與漆酶相混合時，漆酶中與銅位點產生配位作用的組氨酸易於和疊氮基團中的氮原子通過氫鍵作用進行結合，形成疊氮香豆素一漆酶這種新型配合物，這就降低了 3-疊氮-7-羥基香豆素中疊氮基團的給電子能力，疊氮香豆素一漆酶具有產生較強的紫外吸收能力。然而漆酶在尿素溶液中易產生變性作用，漆酶的三維結構遭到破壞，尿素以更強的結合力與組氨酸相結合，破壞疊氮香豆素一漆酶配合物的結構，使上述步驟(2)中含有3-疊氮-7-羥基香豆素、漆酶和尿素的混合溶液中紫外吸收強度隨著變性強度的增加而逐漸減小，達到監測漆酶構象變化的目的。
[0008]本發明是將3-疊氮-7-羥基香豆素與漆酶一起加入到九種不同濃度的尿素溶液中，經充分反應後再用紫外光譜儀在40(T700 nm範圍內採集上述含有3-疊氮-7-羥基香豆素、漆酶和尿素的混合溶液的吸收光譜，最後繪製漆酶在不同尿素濃度條件下的紫外吸收光譜變化趨勢圖，根據該紫外吸收光譜變化趨勢圖就能監測漆酶構象變化。
[0009]本發明的顯著優點在於:
(I)本發明在操作過程中僅需要將漆酶、3-疊氮-7-羥基香豆素在尿素溶液中進行簡單混合，不需要任何的標記過程就能達到監測漆酶構象變化的目的，大大降低了操作的複雜性，減少了監測時間。
[0010](2)本發明用於對漆酶構象變化的監測取得了較為滿意的結果，顯示出高效、專
一、及時、簡單的優勢。
[0011](3)本發明採用簡單的紫外光譜儀採集數據，具有操作簡便、靈敏、成本低的優勢。
[0012]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為本發明的用於監測漆酶構象變化的免標記紫外吸收光譜法的原理示意圖；
圖2中的A為本發明的紫外吸收光譜圖，尿素濃度從a至i分別為0.0 MU.0 M、2.0M、3.0 M、4.0 M、5.0 M、6.0 M、7.0 M、8.0 M ;B為波長在493 nm處的吸收強度與尿素濃度之間的變化關係。漆酶的濃度為250 Pg/mL (步驟(2)中為10 mg/mL，在加入的體積為5.0KL到含有5.0 μ? 3-疊氮-7-羥基香豆素和190 PL尿素溶液中，折算混合溶液中漆酶濃度為 250 M-g/mL)o
[0013]圖3為採用不同方法監測漆酶構象變化的去摺疊率與漆酶活性之間的關係:a為漆酶在不同尿素濃度中的活性變化；b為採用本發明所述的免標記紫外吸收光譜法對漆酶構象變化的監測；c為採用傳統圓二色譜(CD)法對漆酶構象變化的監測。
[0014] 【具體實施方式】:
下面結合實施例並對照附圖對本發明作進一步詳細說明。
[0015]為了更好地理解本發明的內容，下面通過具體的實施例來進一步說明本發明的技術方案，具體包括合成、性質測定等。這些實施方式只是對本發明的說明，並不限制本發明。[0016]一種用於監測漆酶構象變化的免標記紫外吸收光譜法，具體步驟如下:
1.製備3-疊氮-7羥基香豆素化合物:分別稱取1.38 g 2，4-二羥基苯甲醛和1.12 gN-乙醯甘氨酸至50 mL無水乙酸鈉中，並超聲溶解，然後回流攪拌4.0小時，反應完成後，所得混合物倒入冰水中，得到黃色沉澱，過濾取黃色沉澱，並用冰水清洗沉澱物，然後再在30mL鹽酸和乙醇的混合液(2:1)中回流I小時，反應完成後，採用冰浴將上述溶液冷卻，並用20 mL冰水稀釋上述溶液；加入20 mmol亞硝酸鈉,攪拌10分鐘後,再加入30 mmol疊氮化鈉，攪拌20分鐘。經過濾，減壓乾燥後得到的棕色固體為3-疊氮-7羥基香豆素化合物:(0.97 g, 47.8%).1H NMR (DMS0, 400 MHz) δ 6.76 (d, / = 2.13 Hz, I H), 6.80 (dd,/ = 8.47 Hz, / = 2.28 Hz, I H), 7.48 (d, / = 8.54 Hz, I H), 7.61 (s, I H), 5.23(s, I H).1R (KBr, cnT1): 3159 (s)，2117 (vs), 1688 (s)，1617 (m)，1310 (s).MS(EIS) m/z: calculated for C9H5N3O3: 203.0，found 202.5 ([MD; 238.1 ([M+ Cl] 0。
[0017]2.先將尿素溶解在乙酸緩衝液中，配製出九種不同濃度的尿素溶液，九種尿素溶液的具體濃度分別為 0.0 MU.0 Μ、2.0 Μ、3.0 Μ、4.0 Μ、5.0 Μ、6.0 Μ、7.0 Μ、8.0 Μ，並將pH值調製為6.0 ;再將5.0 μ? 10 mg/mL的漆酶、5.0 μ? 0.25 mM 3-疊氮-7-羥基香豆素分別加入至上述九種不同濃度且均為190 PL的尿素溶液中，然後在4 °C下保持1.0小時，混合後攪拌均勻，促使尿素對漆酶產生變性作用，引起漆酶構象變化。
[0018]3.在步驟(2)反應結束後，採用紫外光譜儀在40(T700 nm範圍內分別採集步驟
(2)中九種反應後的尿素溶液的吸收光譜； 4.根據九種尿素溶液的尿素濃度和紫外吸收強度，繪製漆酶在不同尿素濃度條件下的紫外吸收光譜變化趨勢圖，根據該紫外吸收光譜變化趨勢圖就能監測漆酶構象變化。
[0019]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。
【權利要求】
1.一種用於監測漆酶構象變化的免標記紫外吸收光譜法，特徵是:具體步驟如下:
(1)按照參考文獻(Sivakumar,K.; Xie, F.; Cash, B.M.et al., A FluorogenicI,3-Dipolar Cycloaddition Reaction of 3-Azidocoumarins and Acetylenes.0rg.Lett., 2004, 6，4603-4606.)所示的方法，採用二羥基苯甲醛、N-乙醯甘氨酸和疊氮化鈉製備3-疊氮-7-羥基香豆素； (2)將5.0 μ? 10 mg/mL的漆酶和5.0 μ? 0.25 mM 3-疊氮-7-羥基香豆素分別加入至九種不同濃度且均為190 PL的尿素溶液中，九種尿素溶液的具體濃度分別為0.0 MU.0Μ、2.0 Μ、3.0 Μ、4.0 Μ、5.0 Μ、6.0 Μ、7.0 Μ、8.0 Μ，在 4 °C 下培育 1.0 小時，混合後攪拌均勻，促使尿素對漆酶產生變性作用，引起漆酶構象變化； (3)在步驟(2)反應結束後，採用紫外光譜儀在40(T700nm範圍內分別採集步驟(2)中九種反應後的尿素溶液的吸收光譜； (4)根據九種尿素溶液的尿素濃度和紫外吸收強度，繪製漆酶在不同尿素濃度條件下的紫外吸收光譜變化趨勢圖，根據該紫外吸收光譜變化趨勢圖就能監測漆酶構象變化。
2.根據權利要求1所述的免標記紫外吸收光譜法，特徵在於:步驟(2)中所述的尿素溶液是由尿素溶解在乙酸緩衝液中配製而成，並將PH值調製為6.0。
3.根據權利要求1所述的免標記紫外吸收光譜法，特徵在於:採用紫外光譜儀採集的是步驟(2)中所述的含有3-疊氮-7-羥基香豆素、漆酶和尿素三種物質的混合溶液的吸收光譜。·
【文檔編號】G01N1/28GK103712934SQ201410002215
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月3日 優先權日:2014年1月3日
【發明者】邱素豔, 林振宇, 周瑤敏, 羅林廣, 陳國南 申請人:江西省農業科學院農產品質量安全與標準研究所