與腫瘤轉移細胞特異性結合的多肽及其應用的製作方法

2023-11-06 22:09:32

專利名稱：與腫瘤轉移細胞特異性結合的多肽及其應用的製作方法
與腫,移細胞特異性結合的多皿其JOT駄領域本發明屬於生物工程與生物醫藥技術領域，涉及禾,噬菌體展示技術篩選能與腫瘤轉移細胞 表面抗原特異性結合的多肽，具體地說，^Zffl原創中瘤和腫瘤轉移細M^差異鵬隨機12肽噬 菌體際文庫，得到可以用作腫瘤轉移標誌物的特異12月遊列。 背景駄腫瘤細l^人原有部位侵入淋巴管、血管或體腔，遷徙到它處而繼續生長，形成與原發瘤同樣 類型的腫瘤，稱為轉移[楊光華等《病理學》(第適)，人民衛生出版社，2001年，P87)。從肝7jC平發測中瘤細臓面各種肝的非正常駄，對於鑑另鵬瘤的轉移和發展有重要意 義，VEGFR (血管內皮生長因子受體)在很多惡性癌細胞，如惡14fF癌細胞和頭頸部扁平上皮癌 細胞的表面高表達(鄧靖宇，何生，等.VEGF在肝癌中的作用，世界華人消化雜誌，2004， 12(2) :454-458);內源血凝集素在對肺部有高轉移性的惡性腫瘤細胞表面含量較高[Raz ^ Meromsky L， Lotan R，等.內源;驢素在正常細胞、腫瘤細胞和腫瘤轉移細胞表面的差異就， Cancer Researcia986年7月，46 (7) :3667-3672]。,細胞表面W有可能作為腫瘤轉移發生的標誌物，在腫瘤診斷、判 後、轉歸和iWr療效以及高危人群隨訪觀察等方面，具W^的實用價值c現有,體展示技術通常，純化了的蛋白進filf選，得到與該蛋白特異結合的寡肽或抗體。
礎上我們運用噬菌體展示技術對細胞表面!)!^進行 ， fflil^種方法可以得到對細胞表 面特異結合的寡肽好。我們的方案克服了以往細胞篩選中的一些問題，主要是細胞表面成分復 雜而戰知，細胞篩選糊辨異性默，背景值高，而且轉移與一瞎移腫瘤細胞間細胞表面差異 小。發明內容本發明的目的是克服現有技術，的，不足，,一種與腫瘤轉移細胞特異性結合的多肽 及其鵬c因為趨細胞的表面有大量的糖類、蛋白靴原成分與腫瘤轉移相關，所以它們是潛在糊中 瘤標誌物。本發明應用原創中瘤細胞和腫瘤轉移細鵬，鵬菌體文庫進行差異離從而獲得 能與腫瘤轉移細l^系特異性結合的12肽。本發明自SW480 (原創中瘤細皿)和SW620 (腫瘤轉移細皿)差異 噬菌體月婢， 獲得選擇性鵬合腫瘤轉移細胞的12肽，其錢,列如下 Leu-PrO"Trp-Lys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-PrO"Pro 。在f機移細鵬MCF7 (ATCC臓號HTB—22)和T47D (ATCC臓號HTB—133)， 以及高轉移細M MD—MB—231 (ATCC皿號HTB—26)和MD—MB—435 (ATCC保藏號 HTB—129)等4個細胞系中，證實了上述12肽與腫瘤的轉移能力呈正相關。本發明的有 ^是本發明提供的12肽可以用作腫瘤轉移診斷的標誌物，並可作為開發 抑制腫瘤轉移藥物的前體。


圖1.是噬菌體展示中各輪對SW620細胞牛寺異性結合噬菌體的回收率，圖2.體過四輪篩選得至啲,體以及原始庫噬菌粘SW620和SW480細胞結合能力的比較，圖3.是105個噬菌,克隆均與SW480和SW620細胞以及空白孔作ELISA檢測，圖4.是測序後得到的表達四種多肽的噬菌體對SW480、 SW620、 MCF7、 T47D、 MD—MB—231和MD一MB—435的結合能力，圖5.歡U痕i微檢測12 M腫瘤轉移細胞SW620運動能力的影響。實施例l: ^1四,選獲得能與SW620細胞表面選擇性結合的重組HW體 第一輪將RPMI1640培養S^末(Gibico公司)10.4g，碳MiL鈉2.0g溶於800ml雙蒸水中， 力口入10ml lmol/LHEPES溶液，再用雙蒸7jC將總柳定容到1000ml， 0.22(jm濾鵬濾除菌後4°C 保存；^hM培養基中力口入胎牛血清(FBS，購自天津血液病研頓)和青黴素- 素 :，使 其含量分別超U 10°/通1%, 4'C保存;將戰@#基2ml加入到6孑L板的每一個孔中，接入SW620細胞(ATCC 號CCL-228),使細胞密度為106個/孔，在化碳細胞培^中培養約48 小時；棄去培養基，細鵬lxPBS洗滌(10xPBS:氯化鈉肌0g，氯化鉀2,0g，磷體二鈉14.4g， 磷酸二氫鈉2.48，溶於800ml去離子水中，調pH輕7.4，再用去離子水定容至1升。lxPBS: 將戰10xPBS用去離子水糖10倍，{頓 121 。C下高壓滅菌20併中)；加5ml封閉液(含 10mg/ml BSA的PBS)室翻睜育1小時；與此同時，將1X1011原始文庫噬菌體(隨機12肽M13 噬菌體展示文庫試劑盒，購自New England Biolabs公司)加入到2ml封閉液中，4'C封閉1小時； 棄去i^lffl胞孔中的封閉液，將封閉好的麟#^液加入到孔中，室翻睜育2小時；棄去孔中噬 菌鵬液，力口入PBST(含0.1% Tween的PBS )洗10次，PBS洗兩次，然後加入lml M液(O. 2mol/L Glycine-Cl，pH 2.2)，洗脫10併中；取出上清，立即加入150^1中和液(lmol/LTris-Cl,pH9. 0); 取5(^1 tt噬菌體，用瓊脂4M法測定滴度(具#^"法見本實施例的後部)；同時將噬菌體加入 培養到對數中期的規桿菌ER2738中[F， lacf1 A(lacZ)M15 pioA+B+ zzf::Tn10 (Tef)/fhuA2 supE thi A(lac-proAB) A(hsdMS-mcrB)5 (rk"imTMcrBC)菌株保存在含50%甘油的LB培養基中，存於一70 。C]， 250轉/射中，37。C培養擴增4. 5小時；擴增產物10000轉/射中離心10射中；將80%的上 清吸到新的離心管中，加入1/6上清體積的PEG溶液，4'C沉澱過夜；10000轉/射中離心15粥中， 棄上清；用20(^1 PBS重懸沉澱，10000轉/辦中離心5胸(除去剩鄉菌沉澱)，上清轉移到 新的0，5mL離心管中，這就是擴增了的噬菌體。用瓊脂4M法測定噬菌,度。第二輪分別將SW480 (ATCC臓號CCL-228)和SW620細胞以106細^/孑匕鋪到6孑L板 中，培養2天；按照第一輪的方法加入第一輪擴增的噬菌體(滴度約為1X1010)，與SW480細胞 結合，室 育1小時；取出孔中噬菌鵬液，加入到另一個SW480孔中，室翻睜育l小時；取 出第二個SW480細胞i歸孔中的,條液，加入到SW620孔中，室翻桴育2小時； ，擴增 等步驟與第一輪完全相同；用同樣方法進行第三輪和第四輪篩選，每一輪篩i^f用的噬菌體數量 約為1X1010。瓊脂觀法測定滴度的具體織接種 桿菌ER2738單 到5ml含有鹽酸四環素的LB培養基中培養，至ODeoo約為0.5; 取一隻^W3ml上層固體LB培養基(含有0.7%瓊月謝的13培養基)的體，置於沸7K浴中加熱至完全融化，再置於45。C水浴中保溫；取10^1待測噬菌鵬液，在lxPBS中進行10倍系列稀 釋，至大約10^1,鵬液中含有100個,體；取200W^M桿菌ER2738培鎌，在i歸液 中力口入10Ml糖好的噬菌鵬液，輕輕振蕩混勻後^^溫下靜置5辦中；將加有噬菌體的鄉杆 菌培^J口入至'J戰45i:保溫的3ml固體LB培養基中，混勻後倒在37。C預保溫的IPTG/X-gal 平社，待戰固體LB培養基完全凝固後，將平板倒置於37'C培鎌中培糊夜。第二天檢查平板，對平肚的藍色噬0^璡^i十數，再相iSZi頓以稀釋度，就得到原噬菌體 溶液中每10pl戶膽的噬菌體pfU (噬斑形fiP^位)M。結果進行4輪富集篩選，每輪對從SW620細臓面M^下來的,體量與加入B鶴體的量 的比值逐漸升高，實現了特異性的富集(見表l)。表l中四輪的Mft/加入量用圖l表示。 圖l中回收率= 的噬菌體*/加入的曖菌體量，Y軸的單位是X10"6。表l fimSW620特異性結合的噬菌體輪數(pfil)加入噬菌體量 (pfii)回收率(X10力第一輪1.1X1051.1X10111第J3.2X1041. 1X10103第三輪6.0X1051. 1X101055第四輪8.9X1051. 1X101080實施例2:噬菌體對SW480和SW620結合能力的測定SW480和SW620分別以106細醇孔鋪到6孑L板中，在二氧化碳細胞培鎌中37。C培養約48 小時(培養基用RPMI1640， 10%FBS， 1%青黴素-鏈黴素艦)，棄去培養基，PBS洗滌，加A^寸 閉液(含10mg/mlBSA的PBS)室翻浮育l小時；同時，將IX 1UpfU第四輪擴增得到麟體加 入到2ml封閉液中，4'C封閉1小時;，棄去細胞培養 L中封閉液，向SW480和SW620孔中各加 入2ml封閉好的噬菌體(滴度約為1X1011 )，室翻瞎育2小時；棄去,體，PBST (含0.1% Tween 的PBS)洗滌10次，再用PBS洗滌兩次，艦，觀i澱各自的滴度；原始文庫噬菌體作對照，也 同時進行Jd^^。第四輪得到的噬菌體混合庫與SW620結合能力較原始Hm體庫提高了 IOO倍， 第四輪得到的噬菌體混合庫與SW620結合能力是其與SW480結合的100倍，即第四輪得到的噬結合，見圖2。圖2中。表示從SW480細|&± 下來的噬菌體數； □表示從SW620細Hi:W^下來的噬菌體數； l:^^對照，翻原始文庫噬菌體分別加入SW620和SW480中； 2:表示用第四輪擴增的噬菌體分別加入SW620和SW480中。實施例3:單克隆的噬菌體的分離製備隨lnj陬105個篩選4輪後的單克隆噬菌體，加AP樹數中期的鄉桿菌ER2738中，37°C， 搖床(250轉/併中)培養4. 5 5小時；擴增,10000轉/溯離心10溯，^Jl清加入1/6 ^!R的PEG/NaCl溶液，4'C沉^3l夜；10000轉/倂中離心15倂中，棄上清；用200^1 PBS重懸 沉澱，10000轉/併中離心5射中，除去剩餘細菌沉澱；用瓊脂ftM法測^i:清液中的M,度， 加入等mR甘油，保存於一20°C。用105 ，菌,克隆對，細胞SW480或SW620進行ELISA檢測。在96孑L板中分別力口 入105SW480或SW620細lfi/ L，培養兩天後每孔中加入200pl封閉液[5X(w/v)BSA溶於PBS]， 封閉l小時；加入單克隆噬菌體1>Met-Glu-PrO"Ala-Tyr-Gln-Aig-Phe-Leu(3)Ser-Val-Ser-Val-Gly-Met-Lys-Pro-Ser-Pro-Aig-Pro (4)實施例5:對12tt34行多重tmiSS^:b ^^aBlalW猴施例4f泰l酌4個12ttmffi,瀏，發現12月遊列(1) (2) (3) 的相似性很高，它們的高度保守的序列是Pro-TrpOd-Glu-Pro-X2-Tyr,其中&和X2 ^f樣ftf可氨 基酸，該保守序列對維持12肽的結構和功S誕關鍵作用。實施例6:對^S細lfiiS行ELISA測定在96孑L板中分別加入l5sW480或SW620細IS/孔，培養兩天；5X104MCF7， T47D， MD— MB—231或MD—MB—435細lfi/孔，培f天。每孔中加入200^1封閉液[5% (w/v)BSA溶於PBS], 封閉1小時。加入單個克隆的噬菌體1X1010 50^1/孔，孵育2小時。PBST洗滌5次後用HRP-抗M13抗體(PhamiaciaBiotech公司)檢測結合的麟體顆粒，四氨基麟胺(1MB)為底物， 顯色約5射中，加入100^1 H2S04中lbS應。領啶450nm的光吸收值。替艦照為對各細胞系均 沒有特異性的原始文庫Ht0體。測序得到的四種多肽對多種高轉移能力的腫瘤細胞有高結合，而對多種i鵬移/不轉移的腫瘤細胞結合很弱。進一頻實本發明的12月遊列對轉移腫瘤細胞的特 異結合具有廣i皆性，見圖4。圖4中 邁^^,多肽1噬菌體對各種細胞系的結合□ ^^ii多肽2噬菌體對各種細,的結合■ ^^,多肽3噬菌體對各種細J^的結合H表示,多肽4噬菌體對各種細iam的結合□，原始文庫噬菌體對各種細皿的結合 實施例7:劃痕^i正明12月i^f腫瘤細皿動能力的影響在24孑版#^孔的底面作標己(如用賴什字， 點和十字可用於後續微中的定位比較， 赫用記號筆作禾斜己定位)。在24孑L板的齡孔中分另咖入3X15SW620細胞，培養2—3超 形成的單細鵬驢90—100%針孔的底面積。用黃色吸絲在單層細!Tbl定位點劃直線劃 痕。用培養難輕洗去劃掉的細胞。敏L加入107超多肽1的噬菌體，這種噬菌體就的12肽 序列為Leu-Pro-Trpiys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-Pro-Pra。加107對轉移腫瘤細胞沒有特異性結合的 原始庫,體作為對照。用 清培養基(培養基用RPMI1640， 1%青黴素-鏈黴素 )培養， 並在O、 5和24小,照(圖像放大倍數為40)。以24孑L鵬的fei己將同一個孔不同時間點的圖 像錢，觀察腫瘤細胞的運動能力，證明這種12肽在體外可以抑制離移月中瘤細胞的運動能力， 見圖5。圖5中上面一行g向SW620細胞中力口入原始文庫噬菌體，TM—行圖^^示向SW620中加入了特異結合轉移腫瘤細胞的噬菌體，糊n^的時間^^帳後不同的拍照時間。SEQUENCE LISTING<藩南開大學〈120〉與腫瘤轉移細胞特異性結合的多船其細<歸4〈210〉 1〈211〉 12〈212〉 PRT〈213〉 A!i^列〈220〉〈221〉 PEPTIDE〈222〉 (1)..(12) 〈400〉 1Leu Pro Tip Lys Glu Pro Tyr Tyr Leu Met Pro Pro1 5 10〈210〉 2〈211〉 12〈212〉 PRT〈213〉 AX序列 〈220〉〈221〉 PEPTIDE〈222〉 (1)..(12) 〈223〉〈400〉 2Ser Pro Tip Ser Glu Pro Ala Tyr Tyr Leu Ala Pro1 5 10<210〉 3〈211〉 12〈212〉 PRT〈213〉 AI)^列〈220〉〈221〉 PEPTIDE〈222〉 (1)..(12) 〈223〉〈400〉 3Val Pro Trp Met Glu Pro Ala Trp Gin Aig Phe Leu1 5 10〈210〉 4<211〉 12〈212〉 PRT〈213〉 AX/^列 〈220〉〈221〉 PEPTIDE 〈222〉 (1)..(12) 〈223〉〈400〉 4Ser Val Ser Val Gly Nfct Lys Pro Ser Pro Aig Pro1 5 10
權利要求
1.與腫瘤轉移細胞特異性結合的多肽，其胺基酸序列如下Leu-Pro-Trp-Lys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-Pro-Pro。
2. 權利要求l戶艦的多肽在製備檢測腫瘤轉移試劑中的鵬。
3. 權利要求l戶做的多肽在開發抑制腫瘤轉移藥物中的細。
全文摘要
本發明涉及與腫瘤轉移細胞特異性結合的多肽及其應用。本發明所述與腫瘤轉移細胞表面抗原特異性結合的多肽的胺基酸序列為Leu-Pro-Trp-Lys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-Pro-Pro。該多肽具有與腫瘤轉移細胞特異性結合和抑制腫瘤轉移細胞運動的特性。因此，該多肽可以用作腫瘤轉移診斷的標誌物，並可應用於開發抑制腫瘤轉移藥物的前體。
文檔編號G01N33/574GK101319008SQ20081012863
公開日2008年12月10日 申請日期2005年9月27日 優先權日2005年9月27日
發明者張宏愷, 張翠竹, 曹又佳, 鑫 李 申請人:南開大學