一株枯草芽孢桿菌及其菌劑的製備和應用的製作方法
2023-11-06 20:55:32
專利名稱：一株枯草芽孢桿菌及其菌劑的製備和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株枯草芽孢桿菌及其菌劑的製備和應用，屬於農用微生物領域。
背景技術：
化學農藥在防 治或減輕病蟲害造成的危害、保護農業生產方面起到了重大作用。但是化學農藥的毒性較高，結構穩定，難以降解，大量使用後在作物中殘留，動物食用後富集，並且會滲透到土壤、河流或地下水中，造成環境汙染，影響人類健康。而且，由於長期使用某些化學農藥，造成了害蟲和病菌的抗藥性。為控制化學汙染，保護環境，目前世界各國均把發展生態農業，減少化學農藥使用、研究和開發生物農藥，作為植物病蟲害防治的主要發展方向。生物防治以其無汙染、無生態毒性和安全性好等優點在病蟲害綜合防治體系中普遍被人們所接受和高度重視，其中微生物農藥又在生防體系中起到主導作用。目前全世界生物農藥產品已經超過100多種，其中90%以上是微生物殺蟲劑，微生物殺菌劑相對較少。蘋果樹連作障礙廣泛分布於世界各地的蘋果產區，是一種複雜的綜合病症，造成的經濟損失嚴重。生物因素是造成連作障礙的主要原因，由於單一植物的連續種植，形成了特殊的土壤環境，為病原菌和致病線蟲等根系病蟲害提供了賴以生存的寄主和繁殖場所，病原菌可利用寄主植株的根系分泌物和植株組織及其分解物作為養分來源，大量繁殖，成為優勢菌群。同時，大多土壤病原菌在缺乏寄主的條件下會寄生在殘體或土壤中形成耐久性的生存器官，一旦寄主出現，便重新侵染寄主從而造成危害。通過生物調控進行連作障礙的防治日益受到重視，從自然環境中篩選得到能夠有效抑制果樹病原菌生長的微生物來防治連作障礙是當前該領域研究的一大熱點。作為一種生防細菌，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)因其分布廣、易分離培養、能產生抗逆性較強的芽孢、儲存期長和使用方便等特點正受到人們廣泛關注。
發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了一株枯草芽孢桿菌及其菌劑的製備和應用，可用於防治蘋果樹根腐病、立枯病和輪斑病以及蘋果樹、楊樹、黃瓜、辣椒的連作障礙。一株枯草芽孢桿菌菌株Y-l(Bacillus subtilis Y-1),分離自山東省泰安市泰山蘋果園的蘋果樹中，已於2012年9月7日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6539。利用上述枯草芽孢桿菌Y-I生產的微生物菌劑，其活性成分為枯草芽孢桿菌Y-I芽孢及其胞外代謝產物。所述的微生物菌劑為液體菌劑或固體粉劑。枯草芽孢桿菌Y-I微生物菌劑的製備方法，具體包括如下步驟(I)菌種活化將低溫保存的Y-I菌株接種於LB固體培養基上，並在30°C下培養20-24h ;然後挑取單菌落接種於LB固體斜面培養基上，並在30°C下培養20_24h，再用無菌水洗滌培養基表面，其洗脫液作為接種液。
(2)種子液的製備按照O. 05%-0. 5%比例(體積百分比)向LB液體培養基中接入步驟I)製備的接種液，在30°C下震蕩培養12-16h，得種子液。(3)發酵培養將步驟2)所得種子液與發酵培養基按照1%_2%比例(體積百分比)接入含有發酵培養基的發酵罐中進行發酵，得到Y-I菌株的液體菌劑。其中所述的發酵培養基的組成成分及其重量百分比為葡萄糖O. 5%，玉米粉2%，黃豆餅粉O. 5%，硫酸銨O. 05%，磷酸二氫鉀O. 15%，碳酸鈣O. 15%，餘者為水。所述發酵罐發酵條件為培養溫度為28_32°C，通氣量為1:0. 5-1:1. 6，攪拌速度為200-400r/m，培養時間為28_36h ;所述通氣量為每分鐘通入發酵罐的空氣體積與發酵罐中發酵液的體積比值。
其中，所述培養溫度優選為28_30°C，通氣量優選為1:1-1:1. 2，攪拌速度優選為250-300r/m，培養時間優選為32h。發酵時可加入植物油作為消泡劑。所述植物油與培養基的質量體積百分比為1%_2%。所述的菌劑為液體菌劑，離心後添加適量的基質混合即得固體粉劑。所述微生物菌劑中枯草芽孢桿菌Y-I的芽孢數為2. 74X 101(lCfu/mL。上述枯草芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、層出鐮刀菌、立枯絲核菌、鏈格孢、楊樹腐爛病菌、黃瓜枯萎病菌、辣椒疫黴具有抑制作用，對9種病原菌的抑菌率在42. 34%-64. 90%之間，表現出較好的廣譜抑菌活性。本發明還提供了一種微生物菌劑在防治蘋果樹根腐病及連作障礙上的應用。上述枯草芽孢桿菌菌株Y-I可應用於防治蘋果樹根腐病、立枯病和輪斑病和蘋果樹、楊樹、黃瓜及辣椒的連作障礙。本發明具有以下優點I.枯草芽孢桿菌Y-I具有較好的廣譜抑菌活性抗，對蘋果樹根部常見的病原真菌(立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、層出鐮刀菌、串珠鐮刀菌)、蘋果樹葉部病原真菌(蘋果鏈格孢)、楊樹腐爛病菌、黃瓜枯萎病菌及辣椒疫黴等均有較好的抑制效果，2.該枯草芽孢桿菌無汙染，無生態毒性，安全性好。3.該枯草芽孢桿菌發酵性狀優良，且傳代抑菌性狀穩定。4.該種製備方法的發酵工藝簡單，發酵周期短，成本低，利於工業化生產。
圖I為根據16S rDNA序列利用Mega 4. O分析獲得的Y_1菌株到的系統進化樹結
果O圖2為Y-I菌株對多種病原菌到的抑制作用。其中A為尖孢鐮刀菌；B為串珠鐮刀菌；C為層出鐮刀菌；D為腐皮鐮刀菌；E為立枯絲核菌；F為蘋果鏈格孢菌。
具體實施例方式實施例一I、Y-I菌株的分離Y-I菌株是通過對泰安市蘋果樹中多種細菌的分離、篩選對峙等一系列試驗得到的。其具體分離方法為將採集的蘋果樹樣品用無菌水衝洗乾淨，然後分別用75%的酒精和5%次氯酸鈉浸泡3min，再用無菌水衝洗3_5次；然後將樣品研碎,加入90ml無菌水,置於三角瓶中在25° C下180r/m振蕩培養2h;將培養液進行梯度稀釋，塗布於LB平板。每處理重複3次，28° C培養3-5d，選取不同形態的單菌落反覆平板劃線純化，再對尖孢鐮刀菌與純化後的單菌落進行對峙試驗，經多次重複試驗，獲得一株對尖孢鐮刀菌具有顯著抑制作用的細菌，命名為Y-I。該菌株菌種的保存方法短期保存採用LB平板培養基保存菌種，長期保存採用甘油管保存菌種。2、Y-I菌株的鑑定(I)菌體形態特徵 Y-I菌株在LB培養基上生長12h後菌落為圓形，邊緣整齊，膿狀，白色不透明，菌落隆起。隨著培養時間增長，菌落邊緣不整齊，有皺褶狀凸起，變為淡黃色。菌體為杆狀，具鞭毛，孢子囊無明顯膨脹。(2)生理生化特徵Y-I菌株的生理生化特徵見表I。表IY-I菌株的生理生化特徵
權利要求
1.一株保藏編號為CGMCC No. 6539的枯草芽孢桿菌Y-I (Bacillus subtilisY-1)，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其核苷酸序列如SEQ I D NO. I所
2.利用如權利要求I所述的枯草芽孢桿菌Y-I生產的微生物菌劑的製備方法，其特徵在於包括如下步驟 (1)菌種活化將低溫保存的Y-I菌株接種於LB固體培養基上，30°C下培養20-24h;然後挑取單菌落接種於LB固體斜面培養基上，30°C下培養20- 24h，再用無菌水洗滌培養基表面，取洗脫液作為接種液； (2)種子液的製備按照體積百分比O.05%-0. 5 %向LB液體培養基中接入步驟I)製備的接種液，30°C震蕩培養12-16h，得種子液； (3)發酵培養將步驟2)所得種子液與發酵培養基按照體積百分比1%-2%的比例接入含有發酵培養基的發酵罐中進行發酵，培養溫度為28-32°C，通氣量為1:0. 5-1:1. 6，攪拌速度為200-400r/m，培養時間為28_36h ;得到Y-I菌株的液體微生物菌劑； 所述的發酵培養基的組成成分及其重量百分比為葡萄糖O. 5%、玉米粉2%、黃豆餅粉.O.5%、硫酸銨O. 05%、磷酸二氫鉀O. 15%和碳酸鈣O. 15%，餘者為水； 所述通氣量為每分鐘通入發酵罐的空氣體積與發酵罐中發酵液的體積比值。
3.如權利要求書2所述的枯草芽孢桿菌Y-I生產的微生物菌劑的製備方法，其特徵在於所述步驟3)中，培養溫度為28-30°C，通氣量為1:1-1:1. 2，攪拌速度為250_300r/m，培養時間為32h。
4.如權利要求書2所述的枯草芽孢桿菌Y-I生產的微生物菌劑的製備方法，其特徵在於步驟3)發酵時加入植物油作為消泡劑，所述植物油與發酵培養基的質量體積百分比為.1%-2%。
5.根據權利要求書2製備的微生物菌劑中枯草芽孢桿菌Y-I的芽孢數為.2.74X 101(lCfu/mL，其活性成分為枯草芽孢桿菌Y-I芽胞及其胞外代謝產物。
6.如權利要求I所述的枯草芽孢桿菌Y-I在防治尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、層出鐮刀菌、立枯絲核菌、鏈格孢菌、楊樹腐爛病菌、黃瓜枯萎病菌和辣椒疫黴病中的應用。
7.根據權利要求2製備的微生物菌劑在防治蘋果樹根腐病、立枯病和輪斑病以及蘋果樹、楊樹、黃瓜和辣椒連作障礙中的應用。
全文摘要
本發明提供了一株枯草芽孢桿菌及其菌劑的製備和應用，主要涉及一株枯草芽孢桿菌菌株Y-1(Bacillus subtilis Y-1)，保藏編號為CGMCC No.6539；還涉及了利用該枯草芽孢桿菌製備的菌劑及其和應用；本發明涉及的Y-1菌株能夠在蘋果樹、楊樹、黃瓜、辣椒根際及蘋果樹體內定殖，對鐮刀菌、立枯絲核菌、輪斑病菌、疫黴等具有高效、廣譜抑菌活性，其菌劑可用於防治由上述病原真菌引起的病害及蘋果樹、楊樹、黃瓜、辣椒連作障礙；菌劑的製備方法工藝簡單、發酵周期短、成本低，利於工業化生產。
文檔編號A01N63/02GK102965314SQ20121046846
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月19日 優先權日2012年11月19日
發明者劉訓理, 鞠瑞成, 毛志泉, 鮑正宗, 李金玉, 趙玉華, 楊濤, 姜紅霞 申請人:山東農業大學