白細胞分類試劑及方法

2023-12-01 05:48:51

專利名稱：白細胞分類試劑及方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞分類試劑及對細胞進行分類的方法，特別是涉及 一種用於對血液中白細胞進行四分類的試劑以及利用該試劑對血液中白細 胞進行分類檢測的方法。
背景技術：
在臨床檢驗領域中，對人全血樣本進行細胞分類檢驗和計數，在臨床 檢驗和診斷上有很重要的意義。其中涉及白細胞分類的現有技術包括以下
現有技術一介紹了一種分離、鑑定和/或分析全血樣品中的白細胞種群 的試劑系統，該系統包括一種稀釋劑和一種水溶性化合物組成的溶解劑，
在水中至少部分解離，從而產生游離質子和平衡離子，pH值範圍在2.6至4.0 內，快速溶解紅細胞同時能夠保持白細胞的天然的生理狀態和/或免疫化學 狀態，加入抑制劑後對白細胞進行分類。
現有技術二公開了使用白細胞四分類測定用試劑和嗜鹼性粒細胞測定 用試劑，將白細胞五分類的方法。白細胞四分類測定用試劑包括至少一種 離子表面活性劑、至少一種帶陰離子基團的有機化合物、 一種非離子表面 活性劑和緩衝劑，其與血樣作用，將血細胞分成淋巴細胞、單核細胞、嗜 酸細胞和嗜鹼細胞加中性粒細胞四類。檢測方法為兩角度雷射散射法。
現有技術三介紹了對白細胞進行四分類的檢測方法和試劑。試劑含有 皂角苷作為裂解劑和快速交聯試劑如戊二醛作為固定劑，溶解紅細胞並且 對白細胞進行四分類。
現有技術四提出了通過兩角度光散射使用白細胞四分類試劑和嗜鹼細 胞測定試劑將白細胞五分類和計數的方法。四分類試劑包括至少一種離子 表面活性劑用以溶解紅細胞和損傷白細胞膜，同時還有至少一種帶負電的 有機化合物用以與白細胞中帶正電荷的物質結合使白細胞形態發生變化， 一種非離子表面活性劑和用以調節pH值的緩衝液。現有技術五介紹了一種白細胞四分類的試劑。這種試劑包括至少一種 離子表面活性劑，可以是陽離子或兩性表面活性劑中的一種，用來溶解紅 細胞並且部分損傷白細胞膜；同時含有至少一種帶陰離子的有機化合物， 通過與白細胞上帶正電荷的組分結合使各類白細胞形態差異顯現；含有一 種非離子表面活性劑和用來調整pH值的緩衝劑。檢測方法採用兩角度雷射 散射法。
現有技術六同樣是關於白細胞四分類的試劑。該試劑含至少一種陰離 子或兩性表面活性劑，可以在短時間內溶解紅細胞，同時維持白細胞在一 定時間內保持或接近原始狀態，並通過收集前角光散射和側向光散射信號 對白細胞進行四分類。
現有技術七提出了一種從全血樣本中快速分離、分析白細胞的方法和 試劑系統。該項技術中的溶血劑系統由第一試劑選自甲酸、乙酸及兩者的 混合物和第二試劑抑制劑組成。試劑使紅細胞溶解並使白細胞發生微小改 變以使可通過儀器對細胞進行五分類。其優點和獨特性在於其驚人的溶血 速度並能對白細胞進行進一步修飾。溶血後加入抑制劑，防止進一步的溶 血及白細胞明顯的變化。血樣經過處理後能保持細胞的免疫化學特性。檢 測方法可為兩角度光散射法，或直流阻抗和射頻阻抗法，或直流阻抗和光 散射法。
現有技術八介紹了一種多用途的試劑用於快速分析全血樣品。該試劑 裂解紅細胞迅速，同時能夠固定白細胞，還可以保持淋巴細胞得表面抗原。 其試劑含有非季銨鹽，短鏈脂肪醛，非磷酸緩衝液，pH值範圍為5.5-7.5， 滲透度為160-310 mOsm/kgH20。
但是，以上現有技術中還有很多不足之處。
比如，現有技術一的試劑系統含有至少一種酸性物質，pH值選擇範圍 較窄，在2.6至4.0之間。現有技術七中的試劑系統包括含有第一種酸性化合 物的第一試劑和含有抑制劑的第二試劑組成，其試劑pH值也在酸性範圍內， 且必須使用兩種試劑。現有技術八的試劑含有非季銨鹽，短鏈脂肪醛，非 磷酸緩衝液，pH值範圍5.5-7.5，不但試劑成分複雜，而且pH值範圍較窄。
現有技術三所公開的試劑體系含有毒性較大的醛類。
5現有技術二的四分類試劑系統中必須使用至少一種離子表面活性劑、 至少一種帶陰離子基團的有機化合物、 一種非離子表面活性劑。現有技術 四的四分類試劑包括至少一種離子表面活性劑，至少一種帶負電的有機化
合物， 一種非離子表面活性劑和用以調pH的緩衝液。現有技術五的四分類 試劑包括至少一種離子表面活性劑，可以是陽離子或兩性表面活性劑中一 種，至少含一種帶陰離子的有機化合物， 一種非離子表面活性劑和用來調 整pH值的緩衝劑。現有技術六的試劑中含有至少一種陰離子或兩性表面活 性劑短時間內溶解紅細胞。這些試劑系統都必須使用表面活性劑，試劑成 分複雜，增加了試劑成本，而且對白細胞形態進行了一定程度的改變(皺 縮或膨脹)， 一定程度上改變了白細胞的天然的生理狀態和/或免疫化學狀 態。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種能夠快速溶解紅細 胞、有較寬pH值選擇範圍、成分簡單且能夠實現在一個通道內對白細胞 進行四分類的試劑系統。
本發明的另一目的在於提供一種利用上述試劑系統對全血中的白細 胞進行分類檢測的方法。
為實現上述目的，本發明採用了以下技術方案
本發明公開了 一種白細胞分類試劑，所述白細胞分類試劑是指將白細 胞分成淋巴細胞、單核細胞及嗜酸粒細胞相對應的3個集團以及中性粒細 胞和嗜鹼粒細胞相對應的1個集團共4個集團的四分類試劑，所述試劑的 滲透壓低於50mOsm/kgH2O。
進一步地，所述試劑的pH值為4 12。
在本發明具體的實施方式中，所述白細胞分類試劑由溶劑水以及選自 以下的至少一種物質組成i.無機鹽、ii.表面活性劑、iii.帶疏水基團及 陰離子基團的有機化合物、iv.緩衝劑。
優選的，所述無機鹽選自NaCl， KC1， LiCl， Na2S04或K2S04等中的
至少一種。
所述表面活性劑可以溶解紅細胞，並且使白細胞的細胞膜部分損傷， 所述表面活性劑為陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性表面活性劑。
所述有機物可以與白細胞內陽離子結合，使白細胞之間產生形態差異，
所述有機化合物的疏水基團選自芳香族組成的基團、C原子數6以上的烴 基形成的基團或者C原子數大於6的雜環，所述有機化合物的陰離子基團 為羧基或磺酸基。
在本發明的具體的實施方式中，所述有機化合物為酸性色素，或者所 述有機化合物為對苯二甲酸、鄰苯二甲酸、鉻變酸、萘磺酸或它們的衍生 物或鹽類。
本發明還公開了一種對全血中白細胞進行分類的方法，所述方法包括 將上述白細胞分類試劑與全血樣本混合後測定細胞的大小和形態信息。
具體地，所述方法包括在常溫至40度的溫度條件下，將所述白細胞分 類試劑與全血樣本按50:1至200:1的比例混合10 20s後，通過低角度和 高角度兩種散射光分別測定細胞的大小和形態信息，所述低角度散射光的 測定角度為2 5度，高角度散射光的測定角度為8 20度。散射光的檢 測可以由一個光電二極體傳感器完成。
由於採用了以上技術方案，使本發明具備的有益效果在於 本發明利用了低滲試劑的作用來實現對紅細胞的快速溶解，同時對白 細胞進行四分類；本發明試劑系統的成分簡單，表面活性劑不是必要條件， 可不使用或使用少量表面活性劑，並且可用的表面活性劑種類不受限制， 可選擇範圍較寬，可以是陽離子表面活性、陰離子表面活性劑、兩性表面 活性劑，或其任意組合；本發明的試劑系統對於pH值有很寬的選擇範圍， 在pH值4 12範圍內均能準確實現白細胞的四分類；本發明試劑系統能 夠很大程度上保持白細胞亞群天然的生理狀態和/或免疫化學狀態，能夠通 過簡單的兩角度散射光法對白細胞進行四分類檢測；利用本發明的試劑進 行白細胞分類檢測時，不僅能夠在常溫下進行，也能在常溫至40度的高溫 下進行，而高溫下反應有利於消除環境溫度對反應的影響，增加結果的可 靠性和穩定性。


圖l是本發明的一種白細胞分類試劑進行白細胞分類檢測的結果圖； 圖2是本發明的另 一種白細胞分類試劑進行白細胞分類檢測的結果圖; 圖3是本發明的又一種白細胞分類試劑進行白細胞分類檢測的結果圖。
具體實施例方式
本發明的白細胞分類試劑及方法主要利用了試劑低滲的物理性質以達 到對紅細胞溶解和白細胞分類的目的。本發明試劑需滿足的基本條件是滲
透壓低於50mOsm/kgH20，並且pH值範圍在4 12之間。本發明試劑的 滲透壓沒有下限值的限制，只需低於50 mOsm/kg H20即可用於本發明。 將本發明的試劑加入全血樣本中，通過測定細胞大小和形態信息，可以將 白細胞分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜鹼性粒細胞加中性粒 細胞四類。
可用於本發明來調整溶液滲透壓的物質有很多種，常用的可調節滲透 壓至合適範圍(低於50mOsm/kgH20)的物質均適用於本發明， 一般常使 用NaCl， KC1， LiCl， Na2S04, K2S04等等鹽類，同時可加入體系中的緩 衝成分、表面活性劑或含陰離子基團的有機化合物等等同時也會參與試劑 的滲透壓組成。
本發明試劑系統可以選擇性地加入表面活性劑，本發明對可以含有的 表面活性劑品種不作要求，可以是陽離子表面活性劑，陰離子表面活性劑， 也可以是兩性表面活性劑，或者是它們的任意組合。可含有的表面活性劑 可用於溶解紅細胞，並且能夠使白細胞的細胞膜部分損傷。
上述離子表面活性劑，選擇性地加入本發明的低滲試劑系統中以輔助 溶血，其用量應能夠輔助溶解紅細胞，並能造成白細胞的細胞膜部分損傷， 常規用量為50 2000mg/L，優選200 1500mg/L，最優選500 1000mg/L， 所用量也可以根據使用的表面活性劑的種類作適當調整。表面活性劑的溶 血效果和碳鏈長度是成正比的，C原子數越多，溶血能力越強，相應用量應 減少。但無論使用哪一種表面活性劑或者表面活性劑的組合，其使用量應 遠遠少於使細胞完全裸核時的用量。
本發明的試劑系統中，也可以選擇性地含有一種或多種帶陰離子基團 的有機化合物，其可以和白細胞內陽離子結合，使白細胞之間產生形態差 異。這種化合物，帶有疏水基團(如由芳香族組成的基團、由C原子數6 個以上的烴基形成的基團以及C原子數大於6的雜環等)及陰離子基團(如 羧基、磺酸基等)，在水中帶負電荷，能與白細胞結合使白細胞形態發生改變。幾乎所有酸性色素如酸性藍系列、直接藍、酸性綠、溴甲酚綠、酸 性黃、酸性橙、甲基紅、甲基橙、苯胺藍、茜素黃等都可以滿足要求。色 素以外的化合物有對苯二甲酸、鄰苯二甲酸、鉻變酸、萘磺酸及其衍生物
和鹽類等。使用量為50 3000mg/L，優選500 2000mg/L。這種化合物的 加入有助於嗜酸細胞從大小和形態上和其它粒細胞分離。
本發明的試劑系統中，也可以含有調整pH用的緩衝劑。對於緩衝劑 沒有特定的要求，可以為常用緩衝體系如甲酸、乙酸、硼酸、檸檬酸、琥 珀酸、MES、 TRIS、 HEPES、碳酸等。本發明中試劑pH值範圍在4 12 以內對白細胞四分類沒有絕對影響，緩衝劑的使用量通常為10 100mM。
實際上，本發明的試劑及方法主要利用了試劑低滲的物理性質以達到 對紅細胞溶解和白細胞分類的目的。只要滿足滲透壓低於50 mOsm/kg H20， 並且pH值範圍在4 12之間的試劑，即可用於本發明。以上所述的無機鹽類、 表面活性劑、帶疏水基團及陰離子基團的有機化合物以及緩衝劑等四類物 質，均可參與組成本發明試劑的滲透壓。在滿足滲透壓低於50 mOsm/kg H20， pH值為4 12的情況下，除溶劑水以外，本發明的試劑可以只包含以 上四類物質中的任意一類，也可以包含其中的多類。比如，在僅含有緩衝 劑的試劑系統中，若該試劑系統滲透壓低於50mOsm/kgH20、 pH值為4 12，則該試劑系統就能實現本發明的目的。同樣，常用的NaCl， KC1， LiCl， Na2S04或K2S04等無機鹽的水溶液，只要滿足上述滲透壓與pH值條件，就 能用於白細胞四分類並達到所需的效果。
將本發明的上述試劑與全血樣本以50:1至200:1的比例混合，作用時間 10 20s後，通過測定細胞大小和形態信息，可以將白細胞分成淋巴細胞、 單核細胞及嗜酸粒細胞相對應的3個集團與中性粒細胞和嗜鹼粒細胞相對 應的1個集團共4個集團，並可進行分類計數。細胞大小和形態信息的測定 方法，通過低角度和高角度兩種散射光完成。低角度散射光反應細胞大小 的信息，測定角度為2 5度；高角度散射光反應形態的信息，測定角度為 S 20度。散射光的檢測可由一個光電二極體傳感器完成。因此，利用本發 明的試劑通過一種最簡單的光學組合就可以完成白細胞的四分類檢測。
本發明的試劑與全血樣本混合時的反應溫度可以是常溫(25度)，也可以是高溫(40度)，或是常溫至高溫(40度)的任一固定溫度，通常優 選在37度條件下反應。由於在實際操作中能夠在高於室溫的溫度條件下反 應，因此可以只需加熱裝置就可以實現恆溫，而不必增加製冷裝置，大大 節約了儀器成本，而實現恆溫有利於消除環境溫度對反應的影響，增加結 果的可靠性和穩定性。
下面通過具體的實施例對本發明做進一步詳細的描述。 實施例1
一種用於白細胞四分類試劑，該試劑由以下成分組成
氯化鈉 lg
補水到 1L
pH 5,3
滲透壓 34 mOsm/kg H20
以上成分中，氯化鈉用於調節滲透壓。
將10)Ltl全血血樣加入到0.8ml的上述試劑中，37度作用10s，之後通過低 角度和高角度兩個角度的散射光進行白細胞分類檢測，低角度散射光測定 角度為2 5度；高角度散射光測定角度為8 20度。結果如圖l所示。
實例2:
一種用於白細胞四分類試劑，該試劑由以下成分組成
HEPES 2.38g 溴甲酚綠 0.5g 補水到 1L pH 7.0
滲透壓 15
以上成分中，HEPES為緩衝劑，溴甲酚綠為帶陰離子基團的有機化合物。的上述試劑中，37度作用10s，之後通過低角度和高角度兩個角度的散射光進行白細胞分類檢測，低角度散射光測定角度為2 5度；高角度散射光測定角度為8 20度。結果如圖2所示。
實例3:
一種用於白細胞四分類試劑，該試劑由以下成分組成
碳酸鈉 2.38g
癸基三甲基氯化銨 0.5g
補水到 1L
pH 9.0
滲透壓 30
以上成分中，碳酸鈉為緩衝劑，癸基三甲基氯化銨為表面活性劑。將10)Ltl全血血樣加入到1.5ml的上述試劑中，37度作用10s，之後通過低角度和高角度兩個角度的散射光進行白細胞分類檢測，低角度散射光測定角度為2 5度；高角度散射光測定角度為8 20度。結果如圖3所示。
以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限於這些說明。對於本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬於本發明的保護範圍。
ii
權利要求
1、一種白細胞分類試劑，所述白細胞分類試劑是指將白細胞分成淋巴細胞、單核細胞及嗜酸粒細胞相對應的3個集團以及中性粒細胞和嗜鹼粒細胞相對應的1個集團共4個集團的四分類試劑。其特徵在於所述試劑的滲透壓低於50mOsm/kg H2O。
2、 根據權利要求1所述的一種白細胞分類試劑，其特徵在於所述試 劑的pH值為4 12。
3、 根據權利要求2所述的一種白細胞分類試劑，其特徵在於所述白 細胞分類試劑由溶劑水以及選自以下的至少一種物質組成i.無機鹽、ii. 表面活性劑、iii.帶疏水基團及陰離子基團的有機化合物、iv.緩衝劑。
4、 根據權利要求3所述的一種白細胞分類試劑，其特徵在於所述無 機鹽選自NaCl, KC1， LiCl， Na2S04或K2S04中的至少一種。
5、 根據權利要求3所述的一種白細胞分類試劑，其特徵在於所述表 面活性劑可以溶解紅細胞，並使白細胞的細胞膜部分損傷，所述表面活性 劑為陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性表面活性劑。
6、 根據權利要求3所述的一種白細胞分類試劑，其特徵在於所述有 機物可以與白細胞內陽離子結合，使白細胞之間產生形態差異，所述有機 化合物的疏水基團選自芳香族組成的基團、C原子數6以上的烴基形成的 基團或者C原子數大於6的雜環，所述有機化合物的陰離子基團為羧基或 磺酸基。
7、 根據權利要求3所述的一種白細胞分類試劑，其特徵在於所述有 機化合物為酸性色素，或對苯二甲酸、鄰苯二甲酸、鉻變酸或萘磺酸，或 者所述有機化舍物為對苯二甲酸、鄰苯二甲酸、鉻變酸或萘磺酸的衍生物 或鹽。
8、 根據權利要求3所述的一種白細胞分類試劑，其特徵在於所述表 面活性劑為癸基三甲基氯化銨，所述有機化合物為溴甲酚綠。
9、 一種對白細胞進行分類的方法，所述方法包括將權利要求1 8中 任意一項所述的白細胞分類試劑與全血樣本混合後測定細胞的大小和形態 信息。
10、 根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述方法包括在常溫至40度的溫度條件下，將所述白細胞分類試劑與全血樣本按50:1至200:1 的比例混合10 20s後，通過低角度和高角度兩種散射光分別測定細胞的 大小和形態信息，所述低角度散射光的測定角度為2 5度，高角度散射光 的測定角度為8 20度。
全文摘要
本發明公開了一種白細胞四分類試劑，所述試劑的滲透壓低於50mOsm/kg H2O。本發明還公開了利用所述試劑對白細胞進行分類的方法。本發明可實現對紅細胞的快速溶解，同時對白細胞進行四分類；本發明試劑成分簡單，表面活性劑不是必要條件；對於pH值有很寬的選擇範圍。
文檔編號G01N33/48GK101464454SQ200710125209
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月18日 優先權日2007年12月18日
發明者喬巖梅, 兵 劉, 劉牧龍, 孟祥平, 許文娟 申請人:深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司