修飾的人igf-1/e肽的抗體的製作方法

2023-11-30 22:15:56

專利名稱：修飾的人igf-1/e肽的抗體的製作方法
技術領域：
此發明一般涉及免疫球蛋白、抗體和其片段。具體來說，本發明涉及與修飾的人胰島素樣生長因子1蛋白免疫特異性結合的抗體的製備和用途。
背景技術：
胰島素樣生長因子1(IGF-1，生長調節素)為小的單鏈蛋白質，其誘導肌肉肥大和阻礙骨骼肌萎縮。IGF-I在人體內最初以IGF-1/E前體合成，其中E為成熟IGF-I蛋白C-端的延伸肽。成熟IGF-I最初由3種已知的剪接變體mRNA之一編碼。每種mRNA的開放閱讀框編碼一種前體蛋白，所述前體蛋白包含70個胺基酸的IGF-I基團和C-端的特定延伸(E) 肽，取決於特定的IGF-lmRNA，E可為Ea、肪或Ec。C-端肽之後被切割為IGF-I成熟體。在公開的PCT專利申請W02007/146689中構建和描述了修飾的重組人IGF-1/E 蛋白。這些修飾的IGF-1/E肽與野生型IGF-I相比具有更長的半衰期，增加的穩定性，與抑制性胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)降低的親和性，和增加的效力。示例性修飾人 IGF-1/E蛋白為hIGF-l/Ea 3mut (見

圖1)。名稱「3mut」指hIGF-1-E-肽前體具有以下3組修飾(I)Gl, P2和E3的缺失；(2)Arg 37至Ala(R37A)的突變；和(3)R71和S72的缺失。 建議將這些hIGF-l/Ea 3mut肽作為潛在的新藥用於治療骨骼肌萎縮。然而，評估此候選藥物的藥物代謝動力學(PK)和藥效動力學(PD)有困難，因為野生型和修飾的hIGF-1/E僅在整個肽鏈長度的3個分離的位置的1或2個胺基酸上彼此有差異(圖1)。尚無市售的抗體可識別hIGF-l/Ea 3mut肽而不同時檢測內源hIGF_l。發明概述本發明提供可區分修飾的(例如hIGF-l/Ea 3mut)和內源人IGF-1蛋白的高特異性抗體。本發明的抗體與hIGF-Ι或hIGF-2具有極低的或沒有交叉反應。其與嚙齒類IGF-I 或IGF-2也具有極低的或沒有交叉反應。所述抗體對已經施用於人或動物的IGF-1/E肽的藥物代謝動力學(PK)和藥效動力學(PD)評估有用。在一個實施方案中，本發明的抗體與肽GPTLCGAELV (SEQ ID NO 1)免疫特異性結合，但不與肽GPETLCGAELV(SEQ ID NO 2)免疫特異性結合。在另一個實施方案中，本發明的抗體與肽PAKSAVRAQR(SEQ ID NO 6)免疫特異性結合，但不與肽PTKAARSIRAQR(SEQ ID NO 7)免疫特異性結合。本發明因此提供了抗體QCl，QC2，QQ2，QQ5和QQ6。抗體可為單克隆或多克隆的。其可通過免疫合適的哺乳動物，例如小鼠、兔、山羊、 馬、駱駝或鯊魚產生。在本發明範圍內還包括產生本發明抗體的雜交瘤細胞，編碼所述抗體的核酸序列，包含所述核酸序列的載體例如表達載體，以及由所述載體轉化的細胞。本發明還提供雜交瘤(保藏於DSMZ，因霍芬路7B，D_381M不倫瑞克，德國)，其可用於分別表達抗體QCl，QC2，QQ2，QQ5和QQ6。本發明還提供了用於評估修飾的重組人IGF-1/E肽的藥物代謝動力學(PK)/藥效動力學(PD)關係的生物分析測定。在一個實施方案中，所述測定為放射性免疫測定(RIA)
3或酶聯免疫吸附測定(ELISA)，例如三明治ELISA，進行測定以定量在臨床前和臨床樣品中的突變IGF-1/E蛋白，其中使用本發明的抗體作為免疫吸附劑(捕獲抗體)。在這些應用中，可使用分析法可檢測的試劑例如放射性同位素、螢光分子或酶標記抗體。此外，本發明的抗體可用於純化大量IGF-1/E 3mut肽，例如通過親和層析。本發明的抗體因此對治療肌肉萎縮的藥物的商業規模純化有用。在一個實施方案中，在上述方法中使用的抗體選自QC1，QC2，QQ2，QQ5和QQ6。發明詳述本發明的抗體定義。下面提供在此說明書中使用的某些術語的定義。其他術語的定義可在 Illustrated Dictionary of Immunology,第二版，Cruse, J. Μ.禾口 Lewis, R. Ε·,編(CRC Press, Boca Raton, Florida, 1995)中找到。對受試者施用試劑或藥物包括自我施用和通過他人施用。還應當理解描述的醫學病症的各種治療或預防模式旨在表示「基本上」，其包括完全治療或預防，但也包括不完全治療或預防，其中獲得一些生物學或醫學相關結果。術語「抗體」指包含來自免疫球蛋白基因框架區的多肽或其片段，其特異性結合和識別表位，例如在修飾的IGF-1/E肽而不是野生型IGF上發現的表位，例如肽A和肽C抗原的表位，均在下面描述。術語抗體的使用旨在包括完整抗體，包括單鏈完整抗體和其抗原結合片段。術語「抗體」包括抗原結合抗體片段，其包括單鏈抗體，其可單獨包含可變區，或包含可變區和以下多肽元件的全部或部分的組合抗體分子的鉸鏈區、CHpCH2和CH3結構域。 在本發明中還包括可變區和鉸鏈區、CHpCH2和CH3結構域的任意組合。可作為本發明的結合試劑使用的抗體相關分子包括但不限於，例如Fab，Fab，和F (ab') 2，Fd，單鏈Fv (s cFv)， 單鏈抗體，二硫鍵連接的Fv (sdFv)和包含八或Vh結構域的片段。示例包括(i) Fab片段， 由VH, Cl和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab』)2片段，包含在鉸鏈區由二硫鍵連接的2個Fab片段的雙價片段；(iii)由Vdn CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單個臂的\或Vh結構域組成的Fv片段，(ν)由Vh結構域組成的dAb片段(Ward等人，Nature 341 =544-546,1989)；和(vi)分離的互補決定區(CDR)。術語「抗體」包括單結構域抗體、 巨抗體(maxibody)、微抗體(minibody)、細胞內抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、v_NAR和雙-scFv (見，例如 Hollinger&Hudson，Nature Biotechnology, 23,9,1126-1136 (2005)) 一旦抗體已生成，其可進行嵌合或人源化。例如，為生成嵌合抗體，可將可變區連接至人恆定區，使用本領域已知的方法(見，例如屬於Cabilly等人的美國專利號4，816，567)。為生成人源化抗體，可將CDR區插入人框架，使用本領域已知的方法。見，例如屬於Winter 的美國專利號5225539，和屬於Queen等人的美國專利號5530101 ；5585089 ；5693762和 6180370。或者，可將抗體的抗原結合部分移植進基於多肽例如纖維連接蛋白III型爾舊) 的支架中(見美國專利號6，703，199，其描述了纖維連接蛋白多肽單抗體(monobody))。可將抗原結合部分插入含有一對串聯Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的單鏈分子中，其與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata等人，Protein Eng. 8(10) :1057-1062(1995)；和美國專利號5，641，870)。術語「生物樣品」指來自或與活細胞接觸的樣品材料。術語「生物樣品」旨在包括從受試者中分離的組織、細胞和生物液體，以及在受試者體內存在的組織、細胞和液體。
術語「表位」指能夠特異性結合抗體的蛋白決定簇。表位通常由化學活性的表面分子例如胺基酸或糖側鏈基團組成，並通常具有特定的三維結構特徵和特定的電荷特徵。構象和非構象表位的區別在於，在變性溶劑的存在下喪失與前者而不是後者的結合。術語「免疫反應條件」指允許針對特定抗原表位生成的抗體與該表位以下述程度結合，即相比抗體和基本上所有其他表位的結合可檢測的更多，一般至少是背景結合的 2倍，優選至少是背景結合的5倍。免疫反應條件取決於抗體結合反應的類型，所述類型一般指在免疫測定實驗方案中使用的那些。免疫測定類型和條件的描述見Harlow&Lane， AntibodiesiA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Pub1i cat ions,New York，1988)。如此處使用的術語「免疫特異性」指單個抗體結合位點僅和一個抗原決定簇反應的能力。抗體的結合位點位於分子的Fab部分，由重和輕鏈的高變區構成。抗體的結合親和力是單個抗原決定簇和抗體上的單個結合位點之間反應的強度。它是抗原決定簇和抗體結合位點之間吸引和排除力的總和。如此處使用的，對IgG抗體而言，術語「高親和力」指抗體對靶抗原具有10_8M或更低，IO-9M或更低，或ΙΟ,Μ，或10_"Μ或更低的KD。然而，「高親和力」結合對其他抗體同種型可能是不同的。例如，對IgM同種型的「高親和力」結合指抗體具有10_7Μ或更低，或10_%或更低的KD。術語「單克隆抗體」指來源於單個克隆包括任意真核、原核或噬菌體克隆的抗體，不是指產生其的方法。單克隆抗體組合物展示對特定表位的單一結合特異性和親和力。單克隆抗體可通過本領域已知的多種技術製備，包括但不限於，例如雜交瘤細胞、重組和噬菌體展示技術。術語「多克隆抗體」指來源於至少2種不同的產生抗體的細胞系的抗體製劑。此術語的使用包括至少2種抗體的製劑，其包含特異性結合抗原的不同表位或區域的抗體。術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在此處可互換使用，指包含通過肽鍵或修飾的肽鍵 (即肽等構物)彼此連接的2個或更多胺基酸的聚合物。多肽指通常被稱為肽、糖肽或寡聚物的短鏈和一般被稱為蛋白質的長鏈二者。多肽可包含基因編碼的20個胺基酸以外的胺基酸。多肽包括通過自然加工例如翻譯後加工或本領域熟知的化學修飾技術修飾的胺基酸序列。這些修飾在基礎教科書和更詳細的專著以及大量研究文獻中詳細描述了這些修飾。 具體來說，修飾的IGF-1/E蛋白可為在公開的PCT專利申請W02007/146689中描述的任意修飾的IGF-1/E蛋白，以及其任意二級修飾的(糖基化，PEG化，等等)蛋白質。當涉及例如細胞，或核酸，蛋白質，或載體使用術語「重組的」時，其表示所述細胞， 核酸，蛋白質或載體已經通過引入異源核酸或蛋白質或改變天然核酸或蛋白質而被修飾， 或者所述物質來源於被這樣修飾的細胞。具體來說，重組的IGF-1/E蛋白可為在公開的PCT 專利申請W02007/146689中描述的任意的重組IGF-1/E蛋白，以及其任意二級修飾的(糖基化，PEG化，等等)蛋白質。術語「單鏈抗體」或「單鏈Fv (scFv) 」指Fv片段的2個結構域\和Vh的抗體融合分子。儘管Fv片段的2個結構域八和Vh由分隔的基因編碼，可使用重組方法將它們連接，通過合成的接頭使它們成為單個蛋白質鏈，其中\和Vh區配對形成被稱為單鏈Fv(SCFV)的單價分子。見,例如 Bird 等人，Science 242 :423-426(1988)；和 Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 :5879-5883 (1988)。當涉及術語「抗體」片段時包括所述單鏈抗體，通過重組技術或完整抗體的酶促或化學切割可製備所述單鏈抗體。術語「特異性結合」指本發明的抗體和表位(在此處描述的肽上(肽A、肽B或肽C)或包含所述肽的蛋白質)的接觸具有至少IO-fiM的結合親和力。優選的結合物質以至少約KT7M的親和力結合，優選10、至101，ΙΟ,Μ，KT11M,或KT12M的親和力。如上面指出的，本發明的抗體可被標記。標記的抗體可在多種測定中應用，應用多種標籤。通過將可檢測的物質連接至抗體，可以使本發明抗體和目的表位之間的抗體-抗原複合物形成的檢測更容易。合適的檢測方式包括使用下述標籤，例如放射性核素、酶、輔酶、螢光劑、化學發光劑、色原體、酶底物或輔因子、酶抑制劑、輔基複合物、自由基、顆粒、染料，等等。合適酶的示例包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；合適的輔基複合物包括鏈黴抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的螢光物質示例包括傘形酮、螢光素、螢光素異硫氰酸鹽、羅丹明、二氯三嗪基胺 (dichlorotriazinylamine)螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光物質的示例為發光氨；生物發光物質的示例包括螢光素酶、螢光素和水母發光蛋白；以及合適的放射性物質的示例包括 125I，131I，35S，或 3H。多肽本發明提供分離的多肽，其包含序列GPTLCGAELV(SEQ ID NO 1), CPAKSAVRAQR(SEQ ID NO 5)或 PAKSAVRAQR(SEQ ID NO 6)或由上述序列組成。所述多肽在根據本發明生成抗體中有用。本發明的多肽還可構成更大的多肽的一部分。例如，本發明的多肽兩側可具有另外的N-端和/或C-端胺基酸。一般的，在非天然存在環境中提供本發明的多肽，即它們從其天然存在環境中被分離。在某些實施方案中，多肽在與對照相比富含該多肽的組合物中存在。本發明的多肽因此優選的以分離的或基本上分離的形式提供，即多肽在基本上不含其它被表達的多肽的組合物中存在，其中基本上不含指少於75% (以重量計)，優選少於50%，和更優選少於10% (例如5%)的組合物由其它被表達的多肽組成。核酸分子本發明的另一個方面涉及編碼本發明多肽或抗體的核酸分子。核酸可在整個細胞中、細胞裂解液中存在或為部分純化或基本上純的形式的核酸。當從其他細胞成分或其他汙染物例如其他細胞核酸或蛋白質中純化出時，核酸為「分離的」或「變為基本上純的」，所述純化通過下述標準技術進行，包括鹼/SDS處理、CsCl梯度離心、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和其他本領域熟知的技術。見，F. Ausubel，等人，編1987Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York。本發明的核酸可為例如DNA或RNA，可包含或可不包含內含子序列。在一個實施方案中，核酸為cDNA分子。核酸可在載體例如噬菌體展示載體或重組質粒載體中存在。可使用標準分子生物學技術得到本發明的核酸。對雜交瘤細胞表達的抗體例如此處描述的那些，可通過標準PCR擴增或cDNA 克隆技術得到編碼雜交瘤細胞產生的抗體輕鏈和重鏈的cDNA。產生單克隆抗體的轉染瘤的生成—旦得到編碼本發明抗體的核酸，本發明的抗體也可在宿主細胞轉染瘤中製備，使用例如重組DNA技術和基因轉染方法的組合，如本領域所熟知的(例如Morrison， S. (1985)Science 229 :1202)。例如，為表達抗體或其抗體片段，可通過標準分子生物學技術(例如，使用表達目的抗體的雜交瘤的cDNA克隆)得到編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA，可將DNA插入表達
6載體使基因與轉錄和翻譯控制序列有效連接。在此上下文中，術語「有效連接」旨在指將抗體基因連接進載體使載體內的轉錄和翻譯控制序列發揮其預期功能，即調節抗體基因的轉錄和翻譯。選擇表達載體和表達控制序列，使其與使用的表達宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因插入不同的載體或，更一般的，將2種基因插入相同的表達載體。通過標準方法(例如連接抗體基因片段和載體上的互補限制性內切位點，或者平端連接，如果沒有限制性內切位點的話)將抗體基因插入表達載體。此處描述的抗體輕鏈和重鏈可變區可用於生成任意抗體同種型的全長抗體基因，通過將其插入已經編碼預期同種型重鏈恆定區和輕鏈恆定區的表達載體中，使VH片段與載體內的CH片段有效連接，VL片段與載體內的CL片段有效連接。另外或可選的，重組表達載體可編碼信號肽使抗體鏈從宿主細胞的分泌更容易。可將抗體鏈基因克隆進載體使信號肽依讀框的連接至抗體鏈基因的N端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白的信號肽)。除了抗體鏈基因，本發明的重組表達載體攜帶控制抗體鏈基因在宿主細胞中表達的調控序列。術語「調控序列」旨在包括控制抗體鏈基因轉錄或翻譯的啟動子、增強子和其他表達控制元件(例如，多聚腺苷酸化信號)。所述調控序列在例如Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego, CA 1990)中描述。本領域技術人員將理解，表達載體的設計(包括調控序列的選擇)將取決於這些因素，如待轉化的宿主細胞的選擇，期望的蛋白質表達水平，等等。用於哺乳動物宿主細胞的調控序列包括在哺乳動物細胞中控制高水平蛋白質表達的病毒元件，例如來自巨細胞病毒(CMV)、猴病毒40 (SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動子和/或增強子。可選的，可使用非病毒調控序列，例如泛素啟動子或P-球蛋白啟動子。此外，(可使用)由不同來源的序列組成的調控元件，例如SRa啟動子系統，其包含來自SV40早期啟動子和人T細胞白血病病毒1型的長末端重複序列(Takebe，Y.等人， 1988Mol. Cell. Biol. 8 :466-472)。除了抗體鏈基因和調控序列以外，本發明的重組表達載體可攜帶另外的序列， 例如調節載體在宿主細胞中複製的序列(例如，複製起點)和可選擇的標記基因。可選擇的標記基因使已引入載體的宿主細胞的選擇更容易(見，例如美國專利號4，399，216， 4，634，665和5，179，017，都屬於Axel等人)。例如，一般可選擇的標記基因賦予已引入載體的宿主細胞對藥物例如G418、潮黴素或甲氨蝶呤的抗性。可選擇的標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於在dhfr-宿主細胞中使用甲氨蝶呤選擇/擴增)和neo基因 (用於G418選擇)。為表達輕鏈和重鏈，將編碼重和輕鏈的表達載體通過標準技術轉染至宿主細胞。 術語「轉染」的各種形式旨在包括多種通常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞的技術，例如電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖轉染等等。理論上由可以在原核或真核宿主細胞中表達本發明的抗體。考慮在真核細胞，特別是哺乳動物宿主細胞中表達抗體，因為這些真核細胞，特別是哺乳動物細胞，與原核細胞相比更有可能組裝和分泌正確摺疊和具免疫活性的抗體。已有報導抗體的原核表達對製備高產量的活性抗體是無效的(Boss，M.A.和 Wood，C. R.，1985 Immunology Today 6 :12-13)。表達本發明重組抗體的哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CH0細胞)(包括在 Urlaub 和 Chasin，1980Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 :4216-4220 中描述的 dhfr-CHO 細胞，其與 DH FR 可選擇標記一起使用，例如在 R. J. Kaufman 和 P. A. Sharp, 1982Mol. Biol. 159 601-621中所描述的)，NSO骨髓瘤細胞，COS細胞和SP2細胞。特別的，在NSO骨髓瘤細胞中可使用的另一種表達系統是在WO 87/04462，WO 89/01036和EP338，841中顯示的GS基因表達系統。當將編碼抗體基因的重組表達載體引入哺乳動物宿主細胞時，通過培養宿主細胞足夠的時間製備抗體，以允許抗體在宿主細胞中表達或將抗體分泌至培養宿主細胞的培養基中。可使用標準蛋白質純化方法將抗體從培養基中回收。診斷方法/治療方法如上面所指出的，本發明的抗體可用於多種測定以確定樣品中的修飾的IGF-1/E 濃度。因此，本發明提供了確定患者中修飾的IGF-1/E蛋白水平的方法，其包含以下步驟(i)從患者中獲得血液樣品，已對所述患者施用了所述修飾IGF-1/E，和(ii)使用本發明的抗體檢測在所述樣品中的修飾IGF-1/E。可使用標準技術定量修飾的IGF-1/E的水平，例如通過使用已知量的修飾的 IGF-1/E建立標準曲線，比較檢測樣品得到的結果和使用校準標記得到的結果(見，例如實施例)。能夠確定患者中修飾的IGF-1/E蛋白的水平也使醫師能夠確定合適的劑量以得到治療效果。因此本發明也提供了在需要其的患者中維持修飾的IGF-1/E的最優劑量的方法，其包含(i)從患者中獲得血液樣品，已對所述患者施用了所述修飾的IGF-1/E，和(ii)使用本發明的抗體檢測在所述樣品中的修飾的IGF-1/E，和(iii)當患者血液樣品中的修飾的IGF-1/E水平低於預設的水平時，對所述患者施用額外劑量的所述修飾的IGF-1/E。值得注意的是，有時血液樣品已從患者中得到。因此本發明提供了確定患者中修飾的IGF-1/E蛋白水平的方法，其包含使用本發明抗體檢測從患者中得到的血液樣品中的修飾的IGF-1/E的步驟。本發明也提供在需要其的患者中維持修飾的IGF-1/E的最優劑量的方法，其包含(i)使用本發明的抗體檢測在已施用修飾的IGF-1/E的患者血液樣品中的修飾的 IGF-1/E，禾口(ii)當患者血液樣品中的修飾的IGF-1/E水平低於預設的水平時，對所述患者施用額外劑量的所述修飾的IGF-1/E。本發明也允許操控修飾的IGF-1/E的製備。因此，可從製備植物中得到樣品並使用本發明的抗體檢測以確認正在製備正確形式的修飾的IGF-1/E。本發明也提供治療患有肌肉疾病的患者的方法，其包含(i)使用根據本發明的抗體檢測從之前已施用修飾的IGF-1/E的患者中得到的血液樣品中修飾的IGF-1/E的血清濃度，和(ii)如果hIGF-l/Ea 3mut的血清濃度低於預設的最優水平，對患者施用更多的修飾的IGF-1/E。
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在以上描述的實施方案中，修飾的IGF-1/E可為hIGF-l/Ea 3mut或在 W02007/146689中描述的之一。例如，修飾的IGF-1/E可為在W02007/146689的實施例1中描述的那些(在那裡被稱為SEQ ID NO :8，在此處為修飾的IGF-1/E No. 1)，或在 W02007/146689的實施例45中描述的那些(在那裡被稱為SEQ ID NO :53，在此處為修飾的 IGF-1/E No. 2)。蛋白質純化如上面所指出的，本發明的抗體也可用於修飾的IGF-1/E的商業規模純化(即用於治療肌肉萎縮的藥物)。例如，本發明的抗體可用於親和層析以純化修飾的IGF-1/E。重組多肽的純化是本領域熟知的，包括親和層析純化技術等等(一般的見 Scopes, Protein Purification(Springer-Verlag, N. Y. ,1982))。也見 Bailon 等人，An Overview of Affinity Chromatography, Humana Press (2000)) 用於生物治療蛋白質的商業規模純化的親和層析方法(例如基於膜的親和技術)是本領域已知的。見Brandt等人，Bio/Technology6 :779-782(1988)。優選的，通過這些方法純化的修飾的IGF-1/E可為hIGF-1/Ea 3mut,或在 W02007/146689中所描述的。例如，修飾的IGF-1/E可為在W02007/146689的實施例 1中描述的那些(在那裡被稱為SEQ ID N0:8，在此處為修飾的IGF-1/E No. 1)，或在 W02007/146689的實施例45中描述的那些(在那裡被稱為SEQ ID NO :53，在此處為修飾的 IGF-1/E No. 2)。等同物以上的說明中詳細陳述了本發明的一個或多個實施方案。儘管在本發明的實施或檢測中可使用與此處描述的這些類似或等同的任意方法和材料，現在描述優選的方法和材料。從描述和權利要求中，本發明的其他特徵、目的和優勢將是顯而易見的。一般的，酶促反應和純化步驟根據製造商的說明書進行。技術和程序一般根據本領域傳統方法和多種一般參考進行。一般的見 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第二版 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989),在此文檔通篇提供此參考。本發明不受限於在此申請中描述的具體實施方案，所述實施方案旨在單獨說明本發明的各個方面。對本領域技術人員顯而易見的，可對此發明進行多種修改和變化而不背離其精神和範圍。通過以下描述，在本發明範圍內除了此處列舉的那些以外的功能等同方法和儀器對本領域技術人員將是顯而易見的。這些修改和變化旨在落入隨附的權利要求範圍內。本發明僅受限於隨附的權利要求以及這些權利要求賦予的等同物的全部範圍。附圖簡述圖 1 是 hIGF-1, hIGF-l/Ea wt, hIGF-1/Ea 3mut 和 hIGF-2 的胺基酸序列比對。 hIGF-l/E wt和hIGF-l/E 3mut之間的胺基酸差異用粗體突出顯示。序列中的線表示缺失的殘基。下劃線的是下面描述的從hIGF-l/Ea3mut中選為抗原用於動物免疫的肽。圖2是一組圖表，其顯示了經肽A免疫生成的hIGF-l/E 3mut特異性小鼠單克隆抗體的活性。從雜交瘤細胞克隆QCl (A)和QC2(B)中收集細胞培養上清，並在用hIGF-1， hIGF-l/Ea wt, hIGF-l/Ea 3mut, hIGF-2, mIGF-1 或 mIGF_2 包被的微滴定孔中稀釋。結合在板上的抗體通過辣根過氧化物酶綴合的多克隆山羊抗小鼠IgG抗體檢測。
圖3是一組圖表，其顯示了經肽B免疫生成的hIGF-l/E 3mut反應性小鼠單克隆抗體的活性。從雜交瘤細胞克隆BPl (A，mg/ml)和BP2(B，mg/ml)中製備和純化克隆抗體，並在用 hIGF-1，hIGF-l/E wt, hIGF_l/E3mut，hIGF-2，mIGF-1 或 mIGF-2 包被的微滴定孔中以1 10-1 100，000稀釋。結合在板上的抗體通過辣根過氧化物酶綴合的多克隆山羊抗小鼠IgG抗體檢測。圖4是一組圖表，其顯示了肽C免疫生成的hIGF-l/E 3mut特異性小鼠單克隆抗體的活性。從雜交瘤細胞克隆QQ2(A)，QQ5(B)和QQ6(C)中收集細胞培養上清，並在用 hIGF-1, hIGF-l/E wt, hIGF-1/E 3mut, hIGF-2，mIGF-1 或 mIGF-2 包被的微滴定孔中稀釋。 結合在板上的抗體通過辣根過氧化物酶綴合的多克隆山羊抗小鼠IgG抗體檢測。圖5是一組圖表，其顯示了經肽C免疫生成的單克隆抗體的三明治ELISA分析。在用QQ2 (A)，QQ5 (B)和QQ6 (C)包被的微滴定板上加入不同濃度的hIGF-1/Ea 3mut，hIGF_l/ Ec 3mut，糖基化hIGF-l/Ea 3mut和hIGF-1肽。結合在板上的IGF-1肽通過辣根過氧化物酶綴合的單克隆小鼠抗-hIGF-Ι抗體檢測。
實施例針對肽A生成的抗體。通過肽A，GPTLCGAELV(IGF-1/E 3mut的1-10位胺基酸) (SEQ ID NO 1)的小鼠免疫生成2種單克隆抗體(見表1)。QCl和QC2識別的表位與野生型hIGF-Ι和mIGF-1序列GPETLCGAELV(SEQ ID NO 2)僅相差1個胺基酸。選擇此肽用於動物免疫，儘管使用Biobench和Abie Pro 3. 0的蛋白質結構分析提示其具有低表面可能性和低抗原指數。GP-TLCGAELV hIGF-1/E 3mut(SEQ ID NO :1)GP TLCGAELVGPETLCGAELV hIGF-1/E wt，hIGF-1，mIGF-1 (SEQ ID NO :2)使用(1)重組hIGF-l/E 3mut (用於陽性克隆)；(2)重組hIGF-1/Ewt蛋白(用於陰性克隆)；(3)重組hIGF-2(用於陰性克隆)，和(4)重組mIGF-2蛋白(用於陰性克隆) 篩選雜交瘤。使用肽A-KLH綴合物免疫3次的5隻小鼠的抗血清滴度範圍從1 500至 1 16，000，使用1116卩-1/^ 3mut通過ELISA測定。從最佳響應者#3小鼠中產生約1，000 個雜交瘤，發現其中4個與hIGF-l/E 3mut有強反應性，而與hIGF-l/E wt，hIGF_l，hIGF_2， mIGF-1和mIGF-2沒有或僅有弱反應性。對所有4個hIGF-l/E 3mut反應性雜交瘤細胞進行亞克隆，選出2個分別來自獨立雜交瘤細胞的最終亞克隆QCl (7B9C6)和QC2(8B7A2)，通過ELISA確認可產生特異性針對hIGF-l/E 3mut的單克隆抗體(圖2，表1)。2 種 mAb，QCl (7B9C6)和 QC2 (8B7A2)對 hIGF-1/E 3mut 具高度特異性，可作為免疫吸附劑(捕獲抗體)在三明治ELISA中使用以定量臨床前和臨床樣品中修飾的重組人 IGF-1/E肽。表達2種mAb, QCl (7B9C6)和QC2 (8B7A2)的雜交瘤細胞在DSMZ中分別以登記號和保藏。針對肽B 生成的抗體。通過肽 B，CGDRGFYFN-KPTGYGSS (IGF-1/E 3mut 的 17-33 位胺基酸)(SEQ ID NO 3)的小鼠免疫生成2種單克隆抗體(見表1)。選擇此肽因為其具有高表面可能性和高抗原指數。然而，hIGF-Ι和hIGF-l/E 3mut在此區域具有相同的序列。因此，針對此肽產生的抗體識別所有以下蛋白質hIGF-l，hIGF-l/E wt和hIGF-l/E 3mut。 此外，mIGF-1和hIGF-1在此區域展示了僅一個胺基酸的差異。C⑶RGFYFNKPTGYGSS hIGF-1/E 3mut, hIGF-1, hIGF-l/E wt(SEQ ID NO :3)CG RGFYFNKPTGYGSSCGPRGFYFNKPTGYGSS mIGF-1(SEQ ID NO :4)使用(1)重組hIGF-l/E 3mut (用於陽性克隆)；(2)重組hIGF-2 (用於陰性克隆)；(3)重組mIGF-l(用於陰性克隆)，和(4)重組mIGF_2蛋白(用於陰性克隆)篩選雜交瘤細胞。小鼠針對肽B的免疫反應很強。使用肽B-KLH綴合物免疫4次的5隻小鼠的抗血清滴度範圍從1 1，000至>1 32，000。從最佳響應者#5小鼠中產生約1，000個雜交瘤細胞，發現其中21個與hIGF-l，hIGF-l/E wt和hIGF-1/E 3mut有強反應性，而與hIGF-2， mIGF-1和mIGF-有弱反應性。對所有13個雜交瘤細胞進行亞克隆，選出2個分別來自獨立雜交瘤細胞的最終亞克隆BP1(2F11D8)和BP2 (3C5D10)，並確認產生可與hIGF_l，hIGF-1/ E wt和hIGF-l/E 3mut結合的單克隆抗體(圖3，表1)。2 種 mAb, BPl (2F11D8)和 BP2(3C5D10)均識別 hIGF-Ι 和 hIGF_l/E3mut，並與 hIGF-2、mIGF-1和mIGF_2交叉反應。不管怎樣，這些mAb可能對IGF-I的研究有用。針對肽C生成的抗體。通過肽C，CPAKSAVRAQR(IGF-1/E 3mut的65-74位胺基酸， 外加用於綴合的N-端)(SEQ ID NO 5)的小鼠免疫生成3種單克隆抗體(見表1)。選擇此hIGF-l/E 3mut肽因為其具有高表面可能性和高抗原指數。其跨越成熟hIGF_l和突變 E肽的交界區。PAKSA—VRAQR hIGF-1/E 3mut (SEQ ID NO :6)P K+A+RAQRPTKAARSIRAQR mIGF-1(SEQ ID NO :7)使用(1)重組hIGF-l/E 3mut (用於陽性克隆)；(2)重組hIGF-1 (用於陰性克隆)；⑶重組hIGF-l/E wt (用於陰性克隆)，(4)重組mIGF-l(用於陰性克隆)；和(5)重組mIGF-2蛋白(用於陰性克隆)篩選雜交瘤細胞。使用肽C-KLH綴合物免疫4次的5隻小鼠的抗血清滴度範圍從1 400至 1 3，200。從最佳響應者#4小鼠中產生約1，000個雜交瘤細胞，發現其中188個在標準ELISA中與hIGF-l/E 3mut有強反應性，而與hIGF_l無反應性。對188個雜交瘤細胞中的20個進行亞克隆，選出3個分別來自獨立雜交瘤細胞的最終亞克隆QQ2(2C10B7)， QQ5 (6H6G11)和QQ6 (7B1H12)，並確認可產生識別hIGF-l/E 3mut而不識別hIGF_l的單克隆抗體(圖4，表1)。然而，這些mAb與hIGF-l/E wt具有交叉反應。QQ2, QQ5 和 QQ6 識別的表位是 PAKSAVRAQR (aa 65-74) · (SEQ ID NO :6)。這 3 個 mAb, QQ2 (2C10B7)，QQ5 (6H6G11)和 QQ6 (7B1H12)識別 hIGF_l/E3mut，與 hIGF-1/E wt 具有交叉反應，但不結合hIGF-Ι。這些mAb各自可作為免疫吸附劑(捕獲抗體)在三明治ELISA 中使用，以定量多種修飾的重組人IGF-1/E肽。表達3種mAb, QQ2(2C10B7)，QQ5 (6H6G11) 和QQ6(7B1H12)的雜交瘤細胞在DSMZ中分別以登記號，和保藏。
結果總結
權利要求
1.抗體，其與肽GPTLCGAELV(SEQID NO 1)免疫特異性結合，而不與肽 GPETLCGAELV(SEQ ID NO 2)免疫特異性結合。
2.抗體，其與包含肽GPTLCGAELV(SEQID NO 1)的多肽免疫特異性結合，而不與包含肽GPETLCGAELV (SEQ ID NO 2)的多肽免疫特異性結合。
3.抗體，其與肽PAKSAVRAQR(SEQID NO 6)免疫特異性結合，而不與肽 PTKAARSIRAQR(SEQ ID NO 7)免疫特異性結合。
4.抗體，其與包含肽PAKSAVRAQR(SEQID NO 6)的多肽免疫特異性結合，而不與包含肽PTKAARS IRAQR (SEQ ID NO 7)的多肽免疫特異性結合。
5.根據權利要求1-4中任一項的抗體，其中所述抗體選自QCl(由雜交瘤表達)， QC2 (由雜交瘤表達)，QQ2 (由雜交瘤表達)，QQ5 (由雜交瘤表達)和QQ6 (由雜交瘤表達)。
6.選自的雜交瘤，其均在DSMZ中保藏。
7.分離的多肽，其包含序列GPTLCGAELV(SEQ ID NO 1), CPAKSAVRAQR(SEQ ID NO 5) ^PAKSAVRAQR(SEQ ID NO 6)。
8.核酸，其編碼根據權利要求5的抗體或根據權利要求7的多肽。
9.載體，其包含根據權利要求8的核酸。
10.宿主細胞，其包含根據權利要求9的載體。
11.改進的酶聯免疫吸附測定(ELISA)，用於檢測修飾的胰島素樣生長因子1/ E(IGF-I)，其包含根據權利要求1-5中任一項的抗體。
12.改進的親和層析方法，用於從溶液中純化修飾的胰島素樣生長因子1/E(IGF-1)， 其中改進包含使用根據權利要求1-5中任一項的抗體進行純化。
13.測定患者中修飾的IGF-1/E蛋白水平的方法，其包含以下步驟使用根據權利要求 1-5中任一項的抗體檢測從患者處得到的血液樣品中的修飾的IGF-1/E。
14.在有需要的患者中維持修飾的IGF-1/E的最優劑量的方法，其包含(i)使用根據權利要求1-5中任一項的抗體檢測在已施用修飾的IGF-1/E的患者血液樣品中的修飾的IGF-1/E，和( )當患者血液樣品中的修飾的IGF-1/E水平低於預設的水平時，對所述患者施用額外劑量的所述修飾的IGF-1/E。
15.治療患有肌肉疾病的患者的方法，其包含(i)使用根據權利要求1-5中任一項的抗體檢測從之前已施用修飾的IGF-1/E的患者中得到的血液樣品中修飾的IGF-1/E的血清濃度，和( )如果hIGF-l/Ea 3mut的血清濃度低於預設的最優水平，則對患者施用更多的修飾的 IGF-1/E。
16.根據權利要求11的測定或根據權利要求12-15中任一項的方法，其中所述修飾的 IGF-1/E 是 W02007/146689 中描述的之一。
17.根據權利要求13-16中任一項的方法，其中所述hIGF-l/Ea3mut選自 W02007/146689的實施例1中描述的那些(在那裡被稱為SEQ ID NO :8，在此處為修飾的 IGF-1/E No. 1)，或在W02007/146689的實施例45中描述的那些(在那裡被稱為SEQ ID NO: 53，在此處為修飾的IGF-1/E No. 2)。
全文摘要
高特異性抗體可鑑別修飾的(例如hIGF-1/Ea 3mut)和內源人IGF-1蛋白。這些抗體與hIGF-1或hIGF-2具有很低的或沒有交叉反應。它們與嚙齒類IGF-1或IGF-2具有很低的或沒有交叉反應。所述抗體可用於已施用於人或動物的IGF-1/E肽的藥物代謝動力學(PK)/藥效動力學(PD)評估。使用本發明抗體作為捕獲抗體的三明治ELISA測定可定量樣品中的突變IGF-1/E蛋白。
文檔編號C07K16/22GK102232087SQ200980144635
公開日2011年11月2日 申請日期2009年11月10日 優先權日2008年11月10日
發明者D·斯託爾納, F·勒蓋, J·徐, M·弗納羅, R·希倫布蘭德, 高媛 申請人:諾瓦提斯公司