五味子蛋白及其製備方法和藥物用途的製作方法
2023-12-01 03:19:36
專利名稱：五味子蛋白及其製備方法和藥物用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於中藥領域，涉及一種從五味子果實及五味子籽中提取獲得的蛋白，該蛋白提取物對人體具有增強機體免疫力且具有一定的耐缺氧作用。
背景技術：
五味子為木蘭科植物五味子khisandra chinensis (Turcz.) Baill.及華中五味子khisandra sphenanthera Rehd. et Wils.的乾燥成熟果實。前者被中國藥典2005 及2010年版一部收載為五味子(俗稱北五味子)，後者收載為南五味子。本草考證，五味子始載於《神農本草經》，列為上品。五味子是傳統的藥用果實，性溫，味酸、甘。具有收斂固澀，益氣生津，補腎寧心之功效。臨床用於治療久咳虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、神經衰弱、肝炎等疾病。目前，對五味子的研究主要集中在木脂素類成分的研究上，現代化學及藥理研究表明，五味子中含有大量木脂素類化學成分，現已從五味子中分離出32種木脂素類化合物單體，其中的7種已發現有明確藥理作用，它們的化學結構均屬於聯苯環辛烯類，藥理研究和臨床證明1、具有降低肝炎患者血清谷丙轉氨酶水平的作用；2、通過對氧自由基進行清除，從而達到抑制脂質過氧化發生，減輕脂質過氧化物對腦細胞的損傷，對腦細胞有保護作用，使大腦具有明顯的抗疲勞和抗缺氧作用，提高記憶力；3、五味子有效成分可增加閾下睡眠劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠只數，延長閾上睡眠劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間，具有明顯改善睡眠，鎮靜安神之功效。為此對五味子中木脂素類成分的提取方法及藥理活性 (保肝護肝、鎮靜安神)的文獻報導較多，專利涉及廣。
發明內容
本發明提供一種五味子蛋白及其製備方法和藥物用途。其是將五味子或五味子籽粉碎，經提取，運用膜分離技術或加固體硫酸銨飽和沉澱後透析法，得到高純度的水溶性蛋白。蛋白含量達50%以上，以該植物蛋白為活性成分或輔料可製備出各種劑型的口服藥品及保健食品。本發明採取的技術方案是(一 )將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成80 100目細粉；( 二)將粉碎後的物質，加5 15倍量的溶劑於1°C 10°C浸泡提取12 Mh， 或超聲提取0. 5 池，或微波提取0. 5 池，採用相同方法相同溶劑用量提取1 4次，合併提取液；(三)蛋白的純化將合併的提取液經膜孔徑為0. 22 0. 65 μ m的中空纖維膜過濾後，再經截留分子量為10 IOOkDa的中空纖維膜超濾，凍幹，得五味子蛋白；或將合併的提取液，加固體硫酸銨至飽和，1 10°C靜止12 Mh，離心後取沉澱， 以Tris-HCl緩衝液溶解，離心，過濾，取續濾液，經透析，凍幹，得五味子蛋白。本發明還提供用本發明的五味子蛋白以及藥學上可接受的載體或賦形劑製備的藥物製劑。這些藥物製劑選自以下劑型軟膠囊劑、硬膠囊劑、微囊劑、微球劑、滴丸劑、片劑、口服液、散劑、凍幹製劑、注射劑等，還可以根據需要製備成緩釋或控釋製劑。本發明的五味子仁蛋白，在製備藥物製劑時可加入藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體來自抗氧劑、鏊合劑、表面活性劑、填充劑、崩解劑、溼潤劑、溶劑、緩釋材料、 腸溶材料、PH調節劑、矯味劑、色素等，常用載體如甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化鈉、矽衍生物、纖維素、纖維素衍生物、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐溫80、瓊脂、碳酸鈣、聚乙二醇、環糊精、磷脂類材料、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣等。根據權利要求3所述的提取製備工藝，其特徵在於提取溶劑是蒸餾水、pH = 7. 4 的 0. 01mol/L Tris-HCl 緩衝液、pH = 7. 4 的 0. 01mol/L 磷酸緩衝液、含 0. 1 0. 3mol/ LNaCl的pH = 7. 4的0. 01mol/L Tris-HCl緩衝液中的一種溶劑。根據權利要求3所述的提取製備工藝，其特徵在於提取方法為溶劑室溫浸提、超聲提取或微波提取的一種或幾種工藝結合。根據權利要求3所述的提取製備工藝，其特徵在於提取液以步驟三或步驟四的一種進行蛋白的純化。本發明以五味子果實及五味子籽為原料，從中提取分離出了五味子蛋白，通過研究表明該蛋白具有增強機體免疫力、抗輻射、抗氧化作用，且具有一定的抗疲勞、耐缺氧、抗炎、鎮痛作用。而製備五味子蛋白及利用五味子蛋白的產品至今未見報導和生產。該發明的有益效果填補了製備五味子蛋白的空白並擴展了其在醫藥領域的應用範圍，從而提高了該類製劑在國際市場的競爭力。
圖1是五味子蛋白不同提取方法的比較圖，圖中標低分子質量標準蛋白、I 實施例11所得蛋白、II 實施例12所得蛋白、III 實施例14所得蛋白；圖2A是17種胺基酸標準品混合物的HPLC圖，圖中l_Asp ；2-Glu ；3-Ser ；4-Ser ； 5-Arg ；6-Gly ；7-Th ；8-Pro ；9-Ala ；IO-Val ；Il-Cys ； 12-Met ；13-Ile ； 14-Leu ； 15-Phe ； 16-Lys ； 17-Try,圖2B是實施例11所得五味子蛋白HPLC圖，圖中=I-Asp ；2_Glu ；3-Ser ；4-Ser ； 5-Arg ；6-Gly ；7-Th ；8-Pro ；9-Ala ；IO-Val ；Il-Cys ； 12-Met ；13-Ile ； 14-Leu ； 15-Phe ； 16-Lys ； 17-Try ；圖2C是實施例12所得五味子蛋白HPLC圖，圖中=I-Asp ；2-Glu ；3-Ser ；4-Ser ； 5-Arg ；6-Gly ；7-Th ；8-Pro ；9-Ala ；IO-Val ；Il-Cys ； 12-Met ；13-Ile ； 14-Leu ； 15-Phe ； 16-Lys ； 17-Try ；圖2D是實施例14所得五味子蛋白HPLC圖，圖中=I-Asp ；2-Glu ；3-Ser ；4-Ser ； 5-Arg ；6-Gly ；7-Th ；8-Pro ；9-Ala ；IO-Val ；Il-Cys ； 12-Met ；13-Ile ； 14-Leu ；15-Phe ； 16-Lys ； 17-Try ；圖3是五味子蛋白對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的影響圖。
具體實施例方式實施例1 1、將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成80目細粉；2、將粉碎後的物質100g，加5倍量的pH = 7. 4的0. 01mol/L Tris-HCl緩衝液於溫度rc浸泡提取Mh，採用相同方法相同溶劑用量提取4次，合併提取液；3、將合併的浸提液經膜孔徑為0.22 μ m的中空纖維膜過濾後，以pH = 7. 4的 0. Olmol/LTris-HCl緩衝液少量衝洗中空纖維膜，合併後再經截留分子量為IOOkDa的中空纖維膜超濾，以相同溶劑少量衝洗中空纖維膜，所得內濾液凍幹，得五味子蛋白；上述步驟2中所述的操作方法第一次提取後，於5000 10000r/min離心10 60min,取上清液，然後向提取後的殘渣中加入上述提取液，如此復提取3次，合併提取液。實施例2 1、將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成90目細粉；2、將粉碎後的物質100g，加10倍量的含0. 1 0. 3mol/L NaCl的pH = 7. 4的 0. Olmol/LTris-HCl緩衝液於溫度5°C浸泡提取18h，採用相同方法相同溶劑用量提取3次， 合併提取液；3、將合併的浸提液經膜孔徑為0.45 μ m的中空纖維膜過濾後，以pH = 7. 4的 0. Olmol/LTris-HCl緩衝液少量衝洗中空纖維膜，合併後再經截留分子量為50kDa的中空纖維膜超濾，以相同溶劑少量衝洗中空纖維膜，所得內濾液凍幹，得五味子蛋白。實施例3 1、將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成100目細粉；2、將粉碎後的物質100g，加15倍量的蒸餾水於溫度10°C浸泡提取Mh，收集提取液；3、將合併的浸提液經膜孔徑為0.45 μ m的中空纖維膜過濾後，以pH = 7.4的 0. Olmol/LTris-HCl緩衝液少量衝洗中空纖維膜，合併後再經截留分子量為IOkDa的中空纖維膜超濾，以相同溶劑少量衝洗中空纖維膜，所得內濾液凍幹，得五味子蛋白。實施例4 1、將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成100目細粉；2、將粉碎後的物質100g，W 15倍量的蒸餾水於溫度1°C超聲提取池，採用相同方法相同溶劑用量提取1次，合併提取液；3、將合併的浸提液經膜孔徑為0. 65 μ m的中空纖維膜過濾後，以蒸餾水少量衝洗中空纖維膜，合併後再經截留分子量為50kDa的中空纖維膜超濾，以相同溶劑少量衝洗中空纖維膜，所得內濾液凍幹，得五味子蛋白。實施例5 1、將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成90目細粉；2、將粉碎後的物質100g，W 10倍量的蒸餾水於溫度4°C超聲提取1.池，採用相同方法相同溶劑用量提取2次，合併提取液；3、將合併的浸提液經膜孔徑為0. 22 μ m的中空纖維膜過濾後，以蒸餾水少量衝洗中空纖維膜，合併後再經截留分子量為IOkDa的中空纖維膜超濾，以相同溶劑少量衝洗中空纖維膜，所得內濾液凍幹，得五味子蛋白。
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實施例6 1、將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成80目細粉；2、將粉碎後的物質100g，W 5倍量的蒸餾水於溫度10°C超聲提取0.證，採用相同方法相同溶劑用量提取4次，合併提取液；3、將合併的浸提液經膜孔徑為0. 45 μ m的中空纖維膜過濾後，以蒸餾水少量衝洗中空纖維膜，合併後再經截留分子量為IOOkDa的中空纖維膜超濾，以相同溶劑少量衝洗中空纖維膜，所得內濾液凍幹，得五味子蛋白。實施例7 1、將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成80目細粉；2、將粉碎後的物質100g，加5倍量的pH = 7. 4的0. 01mol/L磷酸緩衝液於溫度 4°C微波提取Mh，採用相同方法相同溶劑用量提取4次，合併提取液；3、將合併的浸提液經膜孔徑為0. 22 μ m的中空纖維膜過濾後，以pH = 7. 4的 0. Olmol/L磷酸緩衝液少量衝洗中空纖維膜，合併後再經截留分子量為IOkDa的中空纖維膜超濾，以相同溶劑少量衝洗中空纖維膜，所得內濾液凍幹，得五味子蛋白。實施例8 1、將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成90目細粉；2、將粉碎後的物質100g，加10倍量的Tris-HCl緩衝液於溫度1°C微波提取18h， 採用相同方法相同溶劑用量提取3次，合併提取液；3、將合併的浸提液經膜孔徑為0.45 μ m的中空纖維膜過濾後，以pH = 7. 4的 0. Olmol/L磷酸緩衝液少量衝洗中空纖維膜，合併後再經截留分子量為50kDa的中空纖維膜超濾，以相同溶劑少量衝洗中空纖維膜，所得內濾液凍幹，得五味子蛋白。實施例9 1、將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成100目細粉；2、將粉碎後的物質100g，加15倍量的pH = 7. 4的含0. lmol/L NaCl的Tris-HCl 緩衝液於溫度10°C微波提取Mh，收集提取液；3、將合併的浸提液經膜孔徑為0.65 μ m的中空纖維膜過濾後，以pH = 7. 4的 0. 01mol/L磷酸緩衝液少量衝洗中空纖維膜，合併後再經截留分子量為IOOkDa的中空纖維膜超濾，以相同溶劑少量衝洗中空纖維膜，所得內濾液凍幹，得五味子蛋白。實施例10 1、將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成100目細粉；2、將粉碎後的物質100g，加10倍量的含0. 1 0. 3mol/L NaCl的pH = 7. 4的 O.Olmol/LTris-HCl緩衝液於溫度4°C浸泡提取12h，採用相同方法相同溶劑用量提取3次， 合併提取液；3、將合併的浸提液，加固體硫酸銨至飽和，4°C靜止12h，離心後取沉澱，以pH = 7. 4的0. 01mol/L Tris-HCl緩衝液溶解，離心，過濾，取續濾液，經透析，凍幹，得五味子蛋白。實施例11 1、將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成80目細粉；2、將粉碎後的物質100g，W 15倍量的pH = 7. 4的0. 01mol/L Tris-HCl緩衝液於溫度4°C浸泡提取Mh，採用相同方法相同溶劑用量提取2次，合併提取液；3、將合併的浸提液，加固體硫酸銨至飽和，6°C靜止Mh，離心後取沉澱，以pH = 7. 4的0. 01mol/L Tris-HCl緩衝液溶解，離心，過濾，取續濾液，經透析，凍幹，得五味子蛋白。實施例12 1、將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成100目細粉；2、將粉碎後的物質100g，加5倍量的蒸餾水於溫度4°C超聲提取lh，採用相同方法相同溶劑用量提取2次，合併提取液；3、將合併的浸提液，加固體硫酸銨至飽和，1°C靜止18h，離心後取沉澱，以蒸餾水溶解，離心，過濾，取續濾液，經透析，凍幹，得五味子蛋白。實施例13 1、將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成80目細粉；2、將粉碎後的物質100g，加10倍量的pH = 7. 4的0. 01mol/L磷酸緩衝液於溫度 4°C微波提取池，採用相同方法相同溶劑用量提取2次，合併提取液；3、將合併的浸提液，加固體硫酸銨至飽和，10°C靜止Mh，離心後取沉澱，以蒸餾水溶解，離心，過濾，取續濾液，經透析，凍幹，得五味子蛋白。實施例14 1、將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成100目細粉；2、將粉碎後的物質100g,加10倍量的含0. 1 0. 3mol/L NaCl的pH = 7. 4的 O.Olmol/LTris-HCl緩衝液於溫度4°C浸泡提取12h，採用相同方法相同溶劑用量提取3次， 合併提取液；3、將合併的浸提液經膜孔徑為0.45 μ m的中空纖維膜過濾後，以pH = 7. 4的 0. Olmol/LTris-HCl緩衝液少量衝洗中空纖維膜，合併後再經截留分子量為IOkDa的中空纖維膜超濾，以相同溶劑少量衝洗中空纖維膜，所得內濾液凍幹，得五味子蛋白。實驗例1 五味子總蛋白的定性及含量測定選取實施例11所得蛋白、實施例12所得蛋白、實施例14所得蛋白。(1) SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)採用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法。低分子質量標準蛋白(1. 2 μ g · μ L—1)、樣品上樣量μΓ1)均為20yL。分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。濃縮膠電壓為70mv，分離膠電壓140mv。電泳結束後用考馬斯亮藍R250染色(甲醇水冰乙酸= 4.5 4.5 1)，最後用7. 5%甲醇和5%冰乙酸的水溶液脫色至背景清晰。(2)五味子總蛋白的含量測定精密稱取牛血清白蛋白對照品，配成1. 37mg · mL—1溶液。精密稱取3種蛋白提取物，配成1. 5mg/mL溶液。按Lowry法，對五味子蛋白進行含量測定。分別精確量取白蛋白對照溶液0，0. 1， 0.2，0.4，0.6，0.8，置IOmL量瓶中，加試劑甲5mL，混勻，室溫放置lOmin，快速加入試劑乙 0. 5mL，混勻後室溫放置lh，以第1管為空白，採用分光光度法於765nm處測定其吸收度，測量結果為0.095,0. 170,0. 322,0. 462,0. 602o以蛋白質含量(m, μ g)為橫坐標，吸收度(A) 為縱坐標進行相關分析，得出回歸方程為Y = 0. 7246X+0. 0259，r = 0. 9998。
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分別量取上述蛋白樣品溶液lmL，用直線回歸法計算蛋白含量。見下表1.表1五味子總蛋白含量測定結果
權利要求
1.一種五味子蛋白，其特徵在於它是由下列方法製得的(一)將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成80 100目細粉；(二)將粉碎後的物質，加5 15倍量的溶劑於1°C 10°C浸泡提取12 Mh，或超聲提取0. 5 池，或微波提取0. 5 池，採用相同方法相同溶劑用量提取1 4次，合併提取液；(三)蛋白的純化將合併的提取液經膜孔徑為0. 22 0. 65 μ m的中空纖維膜過濾後，再經截留分子量為 10 IOOkDa的中空纖維膜超濾，凍幹，得五味子蛋白；或將合併的提取液，加固體硫酸銨至飽和，1 10°c靜止12 Mh，離心後取沉澱，以 Tris-HCl緩衝液溶解，離心，過濾，取續濾液，經透析，凍幹，得五味子蛋白。
2.根據權利要求1所述的五味子蛋白，其特徵在於提取溶劑是蒸餾水、Tris-HCl緩衝液、磷酸緩衝液、含0. 1 0. 3mol/L NaCl的1Tris-HCl緩衝液中的一種溶劑。
3.如權利要求1所述的五味子蛋白的製備方法，其特徵在於包括下列步驟(一)將五味子果實或五味子籽洗淨、乾燥、粉碎成80 100目細粉；(二)將粉碎後的物質，加5 15倍量的溶劑於1°C 10°C浸泡提取12 Mh，或超聲提取0. 5 池，或微波提取0. 5 池，採用相同方法相同溶劑用量提取1 4次，合併提取液；(三)蛋白的純化將合併的提取液經膜孔徑為0. 22 0. 65 μ m的中空纖維膜過濾後，再經截留分子量為 10 IOOkDa的中空纖維膜超濾，凍幹，得五味子蛋白；或將合併的提取液，加固體硫酸銨至飽和，1 10°c靜止12 Mh，離心後取沉澱，以 Tris-HCl緩衝液溶解，離心，過濾，取續濾液，經透析，凍幹，得五味子蛋白。
4.根據權利要求3所述的五味子蛋白的製備方法，其特徵在於提取溶劑是蒸餾水、 Tris-HCl緩衝液、磷酸緩衝液、含0. 1 0. 3mol/L NaCl的1Tris-HCl緩衝液中的一種溶劑。
5.如權利要求1所述的五味子蛋白在製備用於增強機體免疫力的藥物中的應用。
6.如權利要求1所述的五味子蛋白在製備用於具有耐缺氧作用的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供一種五味子蛋白及其製備方法和藥物用途，屬於中藥領域。其提取方法是將五味子果實或五味子籽粉碎成細粉後直接加入溶劑提取，過濾，濾液採用膜過濾法或加固體硫酸銨飽和沉澱法進行處理，膜過濾法以所獲得溶液直接凍幹或加固體硫酸銨飽和沉澱法以獲得溶液經透析後凍幹，從而獲得五味子蛋白。該蛋白含量在50%以上。以該蛋白及以該蛋白為主要活性成分，並輔以醫學上可接受的載體或輔料製成的相應製劑，具有增強機體免疫力，且具有一定的耐缺氧作用。
文檔編號C07K1/14GK102260340SQ201110164998
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月20日 優先權日2011年6月20日
發明者萬志強, 嚴銘銘, 吳巖, 周媛, 孫永嘉, 展月, 趙大慶, 閆向竹 申請人:長春中醫藥大學