分枝桿菌抗原組合物的製作方法

2023-11-30 22:55:16 2

專利名稱：分枝桿菌抗原組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及包含M72相關抗原且具有低離子強度的免疫原性組合物。本發明也涉及進一步包含一種或多種免疫刺激劑的這類免疫原性組合物。還提供了用於製備這類免疫原性組合物的方法和相關的試劑盒。
背景技術：
結核病(TB)是一種由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和其他分枝桿菌種的感染引起的慢性傳染性疾病。它是世界上發展中國家的一種主要疾病，並成為發達區域日益嚴重的問題。超過20億人被認為感染了 TB桿菌，每年新增約940萬TB病例和170萬死亡病例。其中10%感染TB桿菌的人會發展活動性TB，每位患有活動性TB的人平均每年感染10-15個其他人。儘管在全球的每年發病率已經達到頂峰，但是由於人口增長，死亡數和病例數依然在上升(World Health Organisation Tuberculosis Facts 2010)。蛋白抗原Mtb72f和M72 (描述為，例如，國際專利申請W02006/117240中)或其片段或衍生物是具有用於治療或預防結核病的潛在益處的蛋白抗原。為了確保能維持免疫原性，蛋白抗原的配製極端重要。有時使用免疫刺激劑以改善針對任何給定抗原而產生的免疫應答。然而，在免疫原性組合物中包含佐劑會增加成分製備的複雜性以及組合物的分布和配製的複雜性。配製者必須考慮每種佐劑成分以及抗原性成分的製備。具體而言，應當考慮抗原性成分與佐劑成分的相容性。這尤其是在預期將凍幹抗原或抗原製劑與佐劑製劑重構的情況下。在這種情況下，重要的是，佐劑製劑的緩衝液對於抗原而言是合適的並且抗原的免疫原性或溶解度不會受到佐劑的影響。發明概述
本發明人已經首次鑑定M72相關抗原對鹽的存在特別敏感。不受理論的限制，據信M72相關抗原受被稱為「鹽析」的現象的不利影響，該現象可以被定義為通過蛋白與鹽如氯化鈉的相互作用而從其溶液中沉澱。本發明人已經發現，當氯化鈉濃度低至150mM時，這些抗原就會聚集和沉澱。因此，包含M72相關抗原的免疫原性組合物的穩定性令人驚訝地可以通過降低氯化鈉濃度而改善。因此，本發明提供包含M72相關抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物的導電率是13 mS/cm或更低。額外提供包含M72相關抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物中的鹽濃度是130 mM或更低。本發明還提供包含M72相關抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物中的氯化鈉濃度是130 mM或更低。附圖簡述


圖1.QS21裂解活性曲線
圖2.在不同ASA製劑中，每種3D-MPL同類物(congener)的百分比 圖3.儲存後具有不同 的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的DLS 圖4.儲存後具有不同的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的濁度測定圖5.儲存後具有不同的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的抗原穩定性 圖6a-6d.儲存後具有不同的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的SEC-HPLC分析 圖7.儲存後具有不同的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的抗原性 圖8.NaCl標準溶液的導電率
圖9.使用本發明的免疫原性組合物在小鼠中誘導CD4 T細胞應答 圖10.使用本發明的免疫原性組合物在小鼠中誘導CD8 T細胞應答 圖11.儲存後具有不同的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的濁度測定 圖12.儲存後具有不同的pH和NaCl濃度的免疫原性組合物的DLS 圖13.儲存後具有不同的NaCl濃度的免疫原性組合物的抗原性。序列標識符簡述
SEQ ID No:1M72蛋白的胺基酸序列
SEQ ID No: 2 編碼M72蛋白的核苷酸序列
SEQ ID No:3具有2個N-末端His殘基的M72蛋白的胺基酸序列
SEQ ID No:4 編碼具有2個N-末端His殘基的M72蛋白的核苷酸序列 SEQ ID No:5Mtb72f蛋白的胺基酸序列
SEQ ID No: 6 編碼Mtb72f蛋白的核苷酸序列
SEQ ID No:7具 有6個N-末端His殘基的Mtb72f蛋白的胺基酸序列
SEQ ID No:8編碼具有6個N-末端His殘基的Mtb72f蛋白的核苷酸序列
SEQ ID No: 9 CpG寡核苷酸I的核苷酸序列(CpG 1826)
SEQ ID No: 10 CpG寡核苷酸2的核苷酸序列(CpG 1758)
SEQ ID No: 11 CpG寡核苷酸3的核苷酸序列
SEQ ID No: 12 CpG寡核苷酸4的核苷酸序列(CpG 2006)
SEQ ID No: 13 CpG寡核苷酸5的核苷酸序列(CpG 1686)。發明詳述
在第一個方面，本發明提供包含M72相關抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物的導電率是13 mS/cm或更低。具體而言，本發明提供包含M72相關抗原的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物的導電率是12 mS/cm或更低,例如10 mS/cm或更低、8 mS/cm或更低、6 mS/cm或更低、5 mS/cm或更低、4 mS/cm或更低或3 mS/cm或更低。在特定的實施方案中，免疫原性組合物的導電率是2.5 mS/cm或更低，諸如2.25 mS/cm或更低或2.0 mS/cm或更低。在進一步特定的實施方案中，免疫原性組合物的導電率是1.5至2.5 mS/cm。在第二個方面，本發明提供包含M72相關抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物中的鹽濃度是130 mM或更低。具體而言，本發明提供包含M72相關抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物中的鹽濃度是100 mM或更低，例如90 mM或更低、80 mM或更低、70 mM或更低、60 mM或更低、50 mM或更低、或40 mM或更低。在特定的實施方案中，所述組合物中的鹽濃度是35 mM或更低，諸如30 mM或更低或25 mM或更低。在進一步特定實施方案中，所述組合物中的鹽濃度是20至40 mM，諸如25至35 mM。在第三個方面，本發明提供包含M72相關抗原的免疫原性組合物，其中氯化鈉濃度是130 mM或更低。具體而言，本發明提供包含M72相關抗原的免疫原性組合物，其中氯化鈉濃度是100 mM或更低，例如90 mM或更低、80 mM或更低、70 mM或更低、60 mM或更低、50 mM或更低、40 mM或更低、30 mM或更低、20 mM或更低或15 mM或更低。在特定的實施方案中，所述免疫原性組合物中的氯化鈉濃度是10 mM或更低，諸如7.5 mM或更低。合適地，免疫原性組合物中的氯化鈉濃度或等於或低於5 mM。在進一步特定的實施方案中，免疫原性組合物基本不含氯化鈉。基本不含是指氯化鈉濃度為或非常接近0 mM(諸如3 mM或更低、2 mM或更低或I mM或更低)。合適地，免疫原性組合物中的CaCl2濃度將是40 mM或更低、30 mM或更低、20 mM或更低、15 mM或更低或10 mM或更低。合適地，免疫原性組合物中的MgSO4濃度將是80 mM或更低、60 mM或更低、40 mM或更低、30 mM或更低、20 mM或更低或10 mM或更低。合適地，免疫原性組合物中的順4+、Mg2+和Ca2+離子總濃度將是80 mM或更低、60mM或更低、40 mM或更低、30 mM或更低、20 mM或更低或10 mM或更低。本發明的免疫原性組合物將是含水製劑。本發明的免疫原性組合物的導電率可以使用本領域中已知的技術，例如，使用專用的導電率儀或其他具有測量導電率能力的儀器來進行測量。一種合適的儀器是來自Malvern Instruments (UK)的 Zetasizer Nano ZS0使用已知技術和試劑盒，技術人員可以容易地測試鈉離子(Na+)和氯離子(CF)的濃度。例如，可以使用試劑盒諸如來自Biosupply的鈉的酶學測定試劑盒(Sodium Enzymatic Assay Kit)(目錄號:BQ011EAEL)來測定鈉。可以使用試劑盒諸如來自Biosupply的氯的酶學測定試劑盒(Chloride Enzymatic Assay Kit)(目錄號:BQ006EAEL)來測定氯。結核病(TB)是一種由結核分枝桿菌(Myco`bacterium tuberculosis)和其他分枝桿菌種的感染引起的慢性傳染性疾病。它是世界上發展中國家的一種主要疾病，並成為發達區域日益嚴重的問題。超過20億人被認為感染了 TB桿菌，每年新增約940萬TB病例和170萬死亡病例。其中10%感染TB桿菌的人會發展活動性TB，每位患有活動性TB的人平均每年感染10-15個其他人。儘管在全球的每年發病率已經達到頂峰，但是由於人口增長，死亡數和病例數依然在上升(World Health Organisation Tuberculosis Facts 2010)。結核分枝桿菌通過呼吸道途徑感染個體。肺泡巨噬細胞吞噬該細菌，但它能夠通過抑制具有酸性溶酶體的吞噬體融合而存活和增殖。隨後發生涉及⑶4+和⑶8+ T細胞的複雜免疫應答，最終導致肉芽腫的形成。結核分枝桿菌成功作為病原體的關鍵在於該分離但未根除的細菌可長期存在，使得個體容易在隨後發展為活動性TB這一事實。在感染後的第一年，少於5%的感染個體會發展活動性TB。該肉芽腫可存在數十年，並被認為在缺乏氧和營養素的休眠狀態下包含活結核分枝桿菌。然而，最近表明，大部分處於休眠狀態的細菌位於遍布體內的非巨曬細胞的細胞類型中(Locht等人，ExpertOpin.Biol.Ther.2007 7 (11): 1665-1677)。當宿主的天然免疫和病原體之間的平衡發生變化時(例如由於免疫抑制事件)則發生活動性TB的發展(Anderson P Trends inMicrobiology 2007 15(1):7-13; Ehlers S Infection 2009 37 (2):87-95)。也已提出描述潛伏TB和活動性TB之間的平衡的動力學假設(Cardana P-JInflammation & Allergy - Drug Targets 2006 6:27-39; Cardana P-J Infection 200937(2):80-86)。
儘管感染在相當長時間內可以是無症狀的，但是活動性疾病最常顯現為肺的急性炎症，從而導致疲勞、體重下降、發燒和持續咳嗽。如果未經治療，通常可導致嚴重的併發症和死亡。結核病通常可採用長期抗生素療法進行控制，儘管該種治療並不足以防止該疾病的擴散。活躍地感染的個體可以是很大程度上無症狀的，但在一定時間具有傳染性。此外，儘管對治療方案的依從性是關鍵的，但是患者的行為很難監測。一些患者並未完成治療周期，這可能導致無效治療和耐藥性的形成。多重耐藥性TB (MDR-TB)是一種對一線藥物沒有應答的形式。所有TB病例中有3.3%是MDR-TB，每年估計有440，000新MDR-TB病例發生。當耐受一線藥物之上發生耐受二線藥物時，產生廣泛耐藥TB (XDR-TB)。已經在58個國家中驗證了幾乎無法治療的XDR-TB (世界衛生組織 Tuberculosis Facts 2010)。即使完成抗生素治療的整個療程，結核分枝桿菌的感染可能無法從感染個體根除，並可保留為能夠再活化的潛伏感染。為了控制結核病擴散，對疾病的有效疫苗接種計劃和準確早期診斷是最為重要的。目前，用活菌接種是誘導保護性免疫最廣泛使用的方法。用於該目的的最常用的分枝桿菌是卡介桿菌(BCG)，這是60多年前第一個開發的牛分枝桿菌的無毒性菌株。然而，BCG的安全性和效力成為爭論的來源-儘管在兒童中顯示了對嚴重疾病的保護，但是BCG並不能預防成年人中潛伏TB的形成或者肺部疾病的再活化。此外，在一些國家，例如美國，並未用這種藥劑來給普通人群接種。有多種蛋白在分枝桿菌感染早期被強烈表達，據顯示它們可在動物接種模型中提供保護效力。然而，用感染早期高度表達的抗原接種可能無法提供處理感染後期的最佳免疫應答。對潛伏性感染的·充分控制可能需要T細胞，其特異性針對在該時期表達的特定抗原。直接靶向持續休眠菌的暴露後疫苗可能有助於保護免於TB再活化，從而強化TB控制，或者甚至能清除感染。因此，靶向潛伏TB的疫苗可以顯著和經濟地降低全球TB感染率。基於後期抗原的亞基疫苗還可與早期抗原聯合使用以提供多階段疫苗。可替代地，早期和/或後期抗原可用於補充和改善BCG接種(通過促進BCG應答或者通過形成高級重組BCG菌株)。蛋白抗原Mtb72f和M72是具有治療或預防結核病的潛在益處的蛋白抗原。Mtb72f已顯示在許多動物模型中提供保護(參見例如:Brandt等人J/7/ect Immun.200472(11):6622-6632; Skeiky 等人7； Immunol.2004 172:7618-7628; Tsenova 等k Infect.1mmun.2006 74(4):2392-2401; Reed 等人 PNAS 2009 106 (7): 2301-2306)。Mtb72f 也已經是臨床研究的主題(Von Eschen 等人 2009 /Zaaa/ Vaccines 5 (7): 475-482)。M72是改進的抗原，其相對於Mtb72f包括單一的絲氨酸至丙氨酸的突變，導致改進的穩定性特徵。M72相關抗原也已經顯示在潛伏性TB模型中是有價值的(國際專利申請W02006/117240)。如本文所用術語「M72相關抗原」指SEQ ID No:1所示M72蛋白及其免疫原性衍生物。如本文所用術語「衍生物」指相對於參考序列，修飾的抗原。免疫原性衍生物與參考序列足夠相似，足以保留參考序列的免疫原性特性，且仍然能夠允許增強針對參考序列的免疫應答。衍生物可以，例如，包含參考序列的修飾版本，或者可以由參考序列的修飾版本組成。M72相關抗原可以，例如含有小於1500個胺基酸殘基，諸如小於1200個胺基酸殘基，特別是小於1000個胺基酸殘基，特別是小於800個胺基酸殘基。T細胞表位是被T細胞(例如，⑶4+或⑶8+ T細胞)識別的胺基酸的短連續片段。T細胞表位的鑑定可通過本領域技術人員已知的表位定位實驗實現(參見例如Paul,Fundamental Immunology,第 3 版，243-247 (1993) ; Bei P barth 等人
200521 (Supp 1.1):129-137)。在不同的遠系交配群體(諸如人)中，不同的HLA類型表示該特定表位可能不被該群體所有成員所識別。由於T細胞應答在結核病中的關鍵參與，為了使識別的水平和免疫應答的規模最大化，M72的免疫原性衍生物期望地是含有完整的大多數(或適當地所有)T細胞表位的那種。技術人員將認識到改變、添加或缺失單個胺基酸或少量百分比的胺基酸的M72蛋白的單獨取代、缺失或添加是「 免疫原性衍生物」，其中一種或多種改變導致以功能類似的胺基酸取代胺基酸或者基本不影響免疫原性功能的殘基的取代/缺失/添加。提供功能類似的胺基酸的保守取代表是本領域眾所周知的。總體而言，該種保守取代將落入下文限定的胺基酸分組之一，儘管在一些情況下，也可能有其他取代而基本不影響該抗原的免疫原性特性。以下八組各包含了彼此可進行典型保守取代的胺基酸:
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G);
2)天冬氨酸(D)，穀氨酸(E);
3)天冬醯胺(N)，穀氨醯胺(Q);
4)精氨酸(R)，賴氨酸(K);
5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V);
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W);
7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);以及
8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)
(參見例如，Creighton, Proteins 1984)。合適地，該種取代不發生在表位區域，因此對該抗原的免疫原性特性不具有明顯影響。免疫原性衍生物還可包括相對於參考序列其中插入了另外胺基酸的那些免疫原性衍生物。合適地，該種插入不發生在表位區域，因此對該抗原的免疫原性特性不具有明顯影響。插入的一個實例包括一段短的組氨酸殘基(例如，2-6個殘基)以幫助目的抗原的表達和/或純化。免疫原性衍生物包括相對於參考序列胺基酸已經缺失的那些免疫原性衍生物。合適地，該種缺失不發生在表位區域，因此對該抗原的免疫原性特性不具有明顯影響。技術人員將認識到特定的免疫原性衍生物可包括取代、缺失和添加(或其任意組合)。兩個或更多多肽序列的上下文中的「相同」或百分比「同一性」指，當比較和比對得到比較窗口或指定區域的最大對應(如採用下列序列比較算法之一或通過人工比對和目視觀察所測量)時，兩個或更多個序列或子序列彼此相同或具有一定百分比的相同(即，相對指定區域70%同一性，任選地75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性)的胺基酸殘基。該定義還指測試序列的互補(compliment)。任選地,該同一丨I"生存在於長度至少500個胺基酸的區域，諸如至少600個胺基酸或至少700個胺基酸。合適地，該比較在對應於參考序列全長的窗口進行(相對於衍生物序列)。對於序列比較，將一個序列作為參考序列，將測試序列與之比較。當使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入計算機，在需要時，指定子序列坐標，並指定序列算法程序參數。可採用默認程序參數，或指定可選參數。隨後序列比較算法將根據程序參數計算測試序列相對於參考序列的百分比序列同一性。本文所用的「比較窗口 」指對兩個序列進行最佳比對後，其中序列可與相同數量連續位置的參考序列比較的區段。比較序列的比對的方法已為本領域眾所周知。比較序列最佳比對可通過下述方法實現，例如，通過Smith & Waterman, Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通過 Needleman & ffunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970)的同源性比對算法，通過 Pearson & Lipman, Proc.Nat』7.Acad.ScL USA 85:2444(1988)的相似性搜索法，通過這些算法的計算機執行(Wisconsin遺傳學軟體包中的GAP,BESTFIT, FASTA 以及 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison,WI),或者通過人工比對和目視觀察(參見例如，Current Protocols in MolecularBiology (Au sub el 等人編輯 1995 增補))。一種有用算法的實例為PILEUP。PILEUP採用漸進的、成對比對建立了來自一組相關序列的多重序列比對，從而顯示相關性和百分比序列同一性。它還繪製了可顯示用於建立比對的聚類關係的樹狀圖或系統樹圖。PILEUP採用了簡化的Feng & Doolittle,J.Mol.EvoL 35:351-360 (1987)的漸進比對法。所採用的方法與 Higgins & Sharp,CABIOS 5:151-153 (1989)所描述的方法類似。該程序可對最高達300個序列進行比對，每個序列的最大長度為5，000個核苷酸或胺基酸。該多重比對程序始於對兩個最為相似的序列的成對比對，從而產生兩個比對序列的聚類。然後將該聚類與下一個最相關的序列或比對序列的聚類進行比對。兩個序列聚類通過將兩個單獨序列的成對比對的簡單擴展進行比對。最終比對可通過一系列的漸進、成對比對實現。該程序通過指定特定的序列及其胺基酸坐標為序列比較區域並指定程序參數來運 行。使用PILEUP時採用下列參數比較參考序列和其他測試序列以確定百分比序列同一性關係:默認空位權重(3.00),默認空位長度權重(0.10)，以及加權的末端空位。PILEUP可以從GCG序列分析軟體包例如7.0版中獲取(Devereaux 等人，M/c.Acids Res.12:387-395 (1984))。適於確定百分比序列同一性和序列相似性的算法的另一實例為BLAST和BLAST2.0 算法，其分別描述於 Altschul 攀yL M/c.Acids Res.25:3389-3402 (1977)和Altschul 等人，7； Mol.Biol.215:403-410 (1990)。進行 BLAST 分析的軟體可通過國家生物技術信息中心公開獲取(網址在www.ncb1.nlm.nih.gov/)。該算法包括首先通過鑑定查詢序列中長度為W的短字來鑑定高得分序列對(HSPs)，其中該短字與資料庫序列中相同長度的字比對時匹配或滿足某些正數值閾值得分T。T指鄰近字得分閾值(Altschul等人，同前)。這些初始鄰近字採樣數(word hits)作為種子啟動對包含它們的更長HSPs的搜索。該字採樣數沿著每個序列的兩個方向伸展，直至累計比對得分增加。對核苷酸序列的累計分數採用參數M(對一對匹配殘基的獎賞分數；總是>0)和N(對不匹配殘基的懲罰分數；總是〈0)進行計算。對於胺基酸序列，可使用得分矩陣來計算累計分數。以下情況下字採樣數向各方向的伸展被停止:累計比對分數較其最大獲得值小數量X;由於一個或多個負得分殘基比對的累積，累計分數降至O或以下；或者達到了任一序列的末端。BLAST算法的參數W、T和X確定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用於核苷酸序列)的默認值為字長(w) 11，預期(E)10，M=5，N=-4，且同時對兩條鏈進行比較。對於胺基酸序列，BLASTP程序的默認值為字長3，和預期(E) 10，以及該BLOSUM62得分矩陣(參見Henikoff
&Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:10915 (1989))的比對(B) 50，預期(E)10，M=5, N=-4，且對兩條鏈進行比較。BLAST算法還進行兩個序列間的相似性的統計學分析(參見例如，Karlin &Altschul, Proc.Natf 1.Acad.Sc1.USA 90:5873-5787 (1993))。由 BLAST 算法所提供的一種相似性的量度為最小概率總和(P (N))，它對兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然產生匹配的概率提供了指示。例如，如果測試核酸與參考核酸之間比較得到的最小概率總和小於約0.2，更優選小於約0.01，最優選小於約0.001時，該核酸被認為與參考核酸相類似。在任意情況下，多肽序列的免疫原性衍生物將具有與參考序列基本相同的活性。基本相同的活性指參考序列在PBMC或全血的用特定抗原的體外再刺激測定(例如，再刺激數小時至長達兩周之間，諸如長達一天、I天至I周或者I至2周的時間)中活性的至少50%、合適地至少75%且特別是至少90%，其中該測定通過淋巴組織增殖、培養上清液中細胞因子生成(通過ELISA、CBA等測量)或者胞內和胞外染色(例如，採用特異性針對免疫標記物的抗體，諸如CD3、CD4、CD8、IL2、TNF a、IFN Y、CD40L、CD69等)然後以流式細胞儀表徵T和B細胞應答來測量細胞的活化。合適地，基本相同的活性指參考序列在T細胞增殖和/或IFN- y生成測定中的活性的至少50%、合適地至少75%且尤其是至少90%。M72蛋白的特定衍生物包括在N末端具有額外的His殘基的那些(例如，兩個His殘基，如SEQ ID No:7中所提供的；或5個或尤其是6個His殘基的多組氨酸標記，其可以用於鎳親和純化)。Mtb72f (SEQ ID No:5)，其中M72中的初始絲氨酸殘基已經被突變，是在N末端具有額外的His殘基 的Mtb72f蛋白(例如，兩個His殘基；或5個或尤其是6個His殘基的多組氨酸標記，其可以用於鎳親和純化)。合適地，M72相關抗原將包含，諸如與M72具有至少70%，諸如至少80%、特別是至少90%、特別是至少95%，例如至少99%同一性的序列。任選地，M72相關抗原將包含，諸如與M72具有至少98%同一性的序列。典型地，M72相關抗原將包含，諸如SEQ ID No:1或3的具有小量缺失插入和/或取代的免疫原性衍生物。實例是在0-5個位置具有最多達5個殘基缺失，在0-5五個位置具有最多達5個殘基插入和最多達20個殘基取代的那些。M72的其他免疫原性衍生物是包含諸如由SEQ ID No:1或3的片段組成的衍生物，所述片段長度為至少500個胺基酸，諸如長度為至少600個胺基酸或長度為至少700個胺基酸。M72相關抗原可以通過前面描述的方法(W02006/117240)、實施例中提供的那些、或與其類似的方法來製備。免疫原性組合物可以包含一個或多個進一步的抗原成分。這樣的額外抗原組分本身不需要對組合物中鹽的存在敏感。額外的抗原組分可以旨在增強或補充結核病預防和治療領域中由M72相關抗原要求的免疫應答，或者額外的抗原可以與其他病原體相關且旨在為了方便起見用於和M72相關抗原一起施用。當許多抗原組分存在於製劑中時，這些也可以以個別多肽或融合蛋白的形式提供。在一些情況下，額外的抗原組分可以作為多核苷酸(或多個核苷酸)提供。眾所周知的是，對於胃腸外施用，溶液應當具有藥學上可接受的重量摩爾滲透壓濃度，以避免細胞變形或裂解。藥學上可接受的重量摩爾滲透壓濃度將通常是指溶液將具有約等滲或輕度高滲的重量摩爾滲透壓濃度。合適地，本發明的免疫原性組合物將具有250至750 mOsm/kg範圍內的重量摩爾滲透壓濃度，例如，重量摩爾滲透壓濃度可以在250至550 mOsm/kg的範圍內，諸如280至500 mOsm/kg的範圍內。可以根據本領域中已知的技術，諸如通過使用商業上獲得的滲壓計，例如從Advanced Instruments Inc.(USA)可獲得的Advanced Model 2020測量重量摩爾滲透壓濃度。「等滲劑」是生理上可耐受的並賦予製劑合適漲度的化合物，以防跨越與製劑接觸的細胞膜的水的淨流動。通常，氯化鈉(NaCl)用作漲度劑。本發明人已經首次顯示M72相關抗原對「鹽析」特別敏感，鹽析是指溶液中的蛋白在含高濃度鹽的溶液中聚集或凝結的過程。因此，提供了可替代的方式以確保本發明的免疫原性組合物具有藥學上可接受的重量摩爾滲透壓濃度。在特定的實施方案中，提供進一步包含非離子型漲度劑的免疫原性組合物。用於免疫原性組合物中的非離子型漲度劑需要自身是藥學上可接受的，例如適用於人類，並且與M72相關抗原相容並且進一步與其他成分如一種或多種免疫刺激劑相容。在本發明的一 個實施方案中，合適的非離子型漲度劑是多元醇、糖類(尤其是蔗糖、果糖、右旋糖或葡萄糖)或胺基酸如甘氨酸。在一個實施方案中，多元醇是糖醇，尤其是C3-6糖醇。示例性的糖醇包括甘油、赤蘚糖醇、蘇糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、山梨醇、甘露醇、衛矛醇和艾杜糖醇。在該實施方案的特定實例中，合適的非離子型漲度劑是山梨醇。技術人員將認識到可以通過使用不同漲度劑的混合物獲得適當的重量摩爾滲透壓濃度。在本發明的特定實施方案中，本發明組合物中的非離子型漲度劑合併蔗糖和/或山梨醇。在一個實施方案中，免疫原性組合物中多元醇的合適濃度為約2.5至約15% (w/v),尤其是約2.5至約10% (w/v)例如約3至約7 % (w/v),諸如約4至約6% (w/v)。在該實施方案的特定實例中，多元醇是山梨醇。在另一個實施方案中，免疫原性組合物包含蔗糖和山梨醇。在這樣的情況下，免疫原性組合物可以合適地含有約2.5至約15% (w/v)的鹿糖,和約2.5至約15% (w/v)的山梨醇，特別是約2.5至約10% (w/v)的鹿糖和約2.5至約10% (w/v)的山梨醇,例如,約3至約7% (w/v)的鹿糖,和約3至約7% (w/v)的山梨醇,諸如約4至約6% (w/v)的鹿糖和約4至約6% (w/v)的山梨醇。免疫原性組合物的pH應該適合用於腸胃外施用。通常，pH將在6.0至9.0的範圍內。合適地，pH將在7.0至9.0的範圍內，特別是7.25至8.75，諸如7.5至8.5，特別是pH 7.75至8.25。約8.0的pH是特別感興趣的。可以通過使用緩衝劑，包括例如Tris或磷酸鹽緩衝劑控制pH。在本發明的特定實施方案中，免疫原性組合物包含一種或多種免疫刺激劑。
在一個實施方案中，免疫刺激劑可以是皂苷。用於本發明的尤其合適的皂苷是Quil A及其衍生物。Quil A是分離自南美樹以saponaria Molina的一種阜苷製劑，首次由 Dalsgaard 等人描述於 1974 ( 「Saponin adjuvants，，，Archiv.fiir die gesamteVirusforschung,第 44 卷，Springer Verlag, Berlin,第 243-254 頁)，其具有佐劑活性。Quil A的純化部分已通過HPLC分離，其保留佐劑活性，而沒有與Quil A (W088/09336)例如QS7和QS21 (也稱為QA7和QA21)相關的毒性。QS21是源自Quillaja saponariaMolina的一種天然皂苷，其誘導⑶8+細胞毒性T細胞(CTL)、Thl細胞和主要IgG2a抗體應答。QS21是本發明的上下文中的優選皂苷。在本發明的合適形式中，免疫原性組合物中的阜苷佐劑是MolinaQuil A的衍生物，尤其是Quil A的免疫活性部分，諸如QS17或QS21，合適地是QS21。理想的是，在反應原性較低的組合物中提供QS21，其中它被外源固醇例如膽固醇猝滅。存在著其中QS21被膽固醇猝滅的反應原性較低的組合物的若干種特定形式。在一個特定的實施方案中，皂苷/固醇是脂質體結構的形式(諸如在W096/33739中所述，實施例1)。在該實施方案中，脂質體合適地含有中性脂質，例如磷脂醯膽鹼，其在室溫下合適地為非晶性的，例如卵黃磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)或二月桂基磷脂醯膽鹼。月旨質體也可含有帶電荷的脂質，其對於由飽和脂質構成的脂質體而言能增加脂質體-QS21結構的穩定性。在這些情況下，帶電荷脂質的量合適地為1-20% w/w,諸如5-10%。固醇與磷脂的比例為1-50% (mol/mol)，合適地為20-25%。合適的固醇包括￠-谷固醇、豆固醇、麥角固醇、麥角鈣化醇和膽固醇。在一個特定的實施方案中，免疫原性組合物包含膽固醇作為固醇。這些固醇是本領域眾所周知的，例如膽固醇公開於默克索引(Merck Index,第11版，第341頁)，是存在於動物脂肪中的天然存在的固醇。當活性皂苷部分是QS21時，QS21:固醇的比例通常為約1:100至1:1 (w/w)，合適地1:10至1:1 (w/w),特別1:5至1:1 (w/w) o存在適當過量的固醇,QS21:固醇的比例為至少1:2 (w/w) o在一個實施方案中,QS21:固醇的比例為1:5 (w/w) o固醇合適地為膽固醇。在另一個實施方案中，免疫原性組合物包含免疫刺激劑，其是Toll-樣受體4(TLR4)激動劑。「TLR激動劑」是指能通過TLR信號轉導途徑而引起信號轉導反應的成分，或者是作為直接配體或者間接通過產生內源或外源配體(Sabroe等人，J Immunol 2003P1630-5)。TLR4激動劑能通過TLR-4信號轉導途徑而引起信號轉導反應。TLR4激動劑的合適實例是脂多糖，合適地是脂質A的無毒衍生物，尤其是單磷醯脂質A或更尤其是3-脫-0-酸化單憐酸脂質A (3D-MPL)。3D-MPL 由 GlaxoSmithKline Biologicals N.A.售賣，名稱是 MPL，並且在全文中都稱為MPL或3D-MPL,參見例如美國專利號4，436，727; 4，877，611; 4，866，034和4，912，094。30-]\0^主要促進具有正^￥ (Thl)表型的CD4+ T細胞應答。可根據GB2220211A所公開的方法產生3D-MPL。從化學上說，它是具有3、4、5或6條醯化鏈的3-脫-0-醯化單磷醯脂質A的混合物 。在本發明的組合物中，小顆粒3D-MPL可用於製備免疫原性組合物。小顆粒3D-MPL的粒徑使其可通過0.22 um濾器進行除菌過濾。這樣的製劑描述於WO94/21292。合適地，粉末狀3D-MPL用於製備本發明的免疫原性組合物。
可使用的其他TLR4激動劑是氨基葡糖苷磷酸烷基酯(AGP)，諸如公開於冊98/50399或美國專利號6，303，347 (也公開了 AGP的製備方法)的那些，合適地是RC527或RC529或美國專利號6，764，840所公開的AGP的藥學上可接受的鹽。一些AGP是TLR4激動劑，而一些則是TLR4拮抗劑。其他合適的TLR4激動劑描述於W02003/011223和W02003/099195，諸如W02003/011223的第4_5頁或W02003/099195的第3_4頁上公開的化合物1、化合物II和化合物III，尤其是公開於W02003/011223的那些化合物ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057m ER804058、ER804059、ER804442、ER804680 和 ER804764。例如，一種合適的TLR-4激動劑是ER804057。在一個特定的實施方案中，免疫原性組合物同時包含皂苷和TLR4激動劑。在一個特定的實例中，免疫原性組合物包含QS21和3D-MPL。每份人用劑量的免疫原性組合物中可以使用的TLR-4激動劑諸如脂多糖諸如3D-MPL的量為I至100 Ugo可使用的3D-MPL的水平為約50 ug，例如40至60 ug，合適地為45至55 ug或49至51 ug或50 ug。在一個進一步實施方案中，免疫原性組合物的人用劑量包含3D-MPL的水平為約25 ug，例如20至30 ug，合適地為21至29 ug或22至28ug 或 23 至 27 ug 或 24 至 26 ug 或 25 ug。每份人用劑量的免疫原性組合物中可以使用的皂苷諸如QS21的量為I至100 Ugo可使用的QS21水平為約50ug，例如40至60 ug，合適地為45至55 ug或49至51 ug或50Ug0在一個進一步實施方案中，免疫原性組合物的人用劑量包含QS21的水平為約25 ug,例如20至30 ug,合適地為21至29 ug或22至28 ug或23至27 ug或24至26 ug或25
Ug0當TLR4激動劑和皂苷同時存在於免疫原性組合物中時，TLR4激動劑與皂苷的重量比合適地為1:5至5:1，合適地為1:2至2:1，`諸如約1:1。例如，在每份人用劑量的免疫原性組合物中，當3D-MPL含量為50ug或25ug時，合適地QS21的含量也可分別為50ug或25ug。本發明的某些免疫原性組合物包含量為I至100 ug QS21和3D-MPL /每個人用劑量，諸如量為10至75 ug/每個人用劑量。本發明的免疫原性組合物可以合適地包含QS21和3D-MPL，其量為15至35 ug/每人用劑量，諸如20至30 ug/每人用劑量。在一個實施方案中，免疫刺激劑是TLR9激動劑，例如W02008/142133所給出的那些。在一個特定的實例中，所述TLR9激動劑是免疫刺激性寡核苷酸，尤其是含有未甲基化CpG基序的寡核苷酸。這樣的寡核苷酸是眾所周知的並描述於例如W096/02555、W099/33488和US5，865，462。用於本文所述的免疫原性組合物的合適的TLR9激動劑是含有CpG的寡核苷酸，任選含有被至少3個、合適地為至少6個或更多個核苷酸分隔的兩個或更多二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸後接鳥嘌呤核苷酸。在一個實施方案中，寡核苷酸中的核苷酸間鍵是二硫代磷酸酯鍵，或可能是硫代磷酸酯鍵，儘管磷酸二酯鍵和其他核苷酸間鍵也可使用，包括具有混合核苷酸間鍵的寡核苷酸。產生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯寡核苷酸的方法描述於US5，666，153、US5, 278，302和W095/26204。考慮了包含不同核苷酸間鍵的寡核苷酸，例如混合硫代磷酸磷酸二酯類。可使用能穩定寡核苷酸的其他核苷酸間鍵。適合本文所述的免疫原性組合物所包含的CpG寡核苷酸的實例具有以下序列。在一個實施方案中，這些序列含有經硫代磷酸酯修飾的核苷酸間鍵。
SK 作酸.1 {SEQ ID No: 9): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)
U:核 f 酸 2 {SEQ ID No: 10}: TCT CCC AGC GTG CGC CAT {CpG 1758)
袁核.fl:_ 3 (SEQ ID No: 11): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG 霖核 f!-鑛 4 (SEQ ID Ho: 12): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006):ff 核 f!+-_ 5 {SEQ ID No: 13): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 16€8)可替代的CpG寡核苷酸可包含上述序列，因為其中它們可具有不連續缺失或添加。在一個實施方案中，免疫刺激劑是母育酚。母育酚是本領域眾所周知的並描述於EP0382271。在一個特定的實施方案中，母育酚是a-生育酚或其衍生物諸如a -生育酚琥珀酸酯(也稱為維生素E琥珀酸酯)。本發明也提供本發明免疫原性組合物的製備方法，所述方法包括以下步驟:
a.凍幹M72相關抗原；和
b.用水溶液重構步驟a)的凍幹的M72相關抗原，其中所述溶液的導電率是13mS/cm或更低。

在某些實施方案中，所述水溶液的導電率是12 mS/cm或更低，例如10 mS/cm或更低,8 mS/cm或更低,6 mS/cm或更低,5 mS/cm或更低,4 mS/cm或更低,或3 mS/cm或更低。在一個特定的實施方案中，所述水溶液的導電率是2.5 mS/cm或更低，諸如2.25 mS/cm或更低,或2.0 mS/cm或更低。合適地，所述水溶液的導電率使得當重構凍幹抗原時獲得的溶液的導電率是13mS/cm或更低,諸如12 mS/cm或更低,例如10 mS/cm或更低,8 mS/cm或更低,6 mS/cm或更低,5 mS/cm或更低,4 mS/cm或更低,或3 mS/cm或更低。在一個特定的實施方案中,所述獲得的溶液的導電率是2.5 mS/cm或更低,諸如2.25 mS/cm或更低,或2.0 mS/cm或更低。進一步提供本發明免疫原性組合物的製備方法，所述方法包括以下步驟:
a.凍幹M72相關抗原；和
b.用水溶液重構步驟a)的凍幹的M72相關抗原，其中所述溶液中的鹽濃度是130mM或更低。在某些實施方案中，所述水溶液中的鹽濃度是100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一個特定的實施方案中，所述水溶液中的鹽濃度是35 mM或更低，諸如30 mM或更低或25 mM或更低。合適地，所述水溶液中的鹽濃度使得當重構凍幹抗原時獲得的溶液的鹽濃度是130 mM或更低，諸如100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一個特定的實施方案中，所述獲得的溶液中的鹽濃度是35 mM或更低，諸如30 mM或更低，或25 mM或更低。額外地提供本發明免疫原性組合物的製備方法，所述方法包括以下步驟:
a.凍幹M72相關抗原；和
b.用水溶液重構步驟a)的凍幹的M72相關抗原，其中所述溶液中的氯化鈉濃度是130mM或更低。在某些實施方案中，所述水溶液中的氯化鈉濃度是100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一個特定的實施方案中，所述水溶液中的鹽濃度是35 mM或更低，諸如30 mM或更低，20 mM或更低，或15 mM或更低。合適地，水溶液中的氯化鈉濃度或等於或低於5 mM。合適地，所述水溶液中的氯化鈉濃度使得當重構凍幹抗原時獲得的溶液的氯化鈉濃度是130 mM或更低，諸如100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一個特定的實施方案中，所述獲得的溶液中的氯化鈉濃度是35 mM或更低，諸如30 mM或更低，或25 mM或更低。在一個實施方案中，步驟b)的水溶液(上述)包含皂苷和/或TLR4激動劑，例如QS21和/或3D-MPL。在一個進一步實施方案中，皂苷和/或TLR4激動劑在脂質體製劑中。在一個實施方案中，水溶液包含在脂質體製劑中的TLR4激動劑和皂苷，以及本文所述的非離子型漲度劑，諸如多元醇。尤其是水溶液可以包含山梨醇。還提供試劑盒，所述試劑盒包含:
a.凍幹的M72相關抗原；和
b.水溶液，其中所述溶液的導電率是13mS/cm或更低。在某些實施方案中，所述水溶液的導電率是12 mS/cm或更低，例如10 mS/cm或更低,8 mS/cm或更低,6 mS/cm或更低,5 mS/cm或更低,4 mS/cm或更低,或3 mS/cm或更低。在一個特定的實施方案中，所述水溶液的導電率是2.5 mS/cm或更低，諸如2.25 mS/cm或更低,或2.0 mS/cm或 更低。合適地，所述水溶液的導電率使得當重構凍幹抗原時獲得的溶液的導電率是13mS/cm或更低,諸如12 mS/cm或更低,例如10 mS/cm或更低,8 mS/cm或更低,6 mS/cm或更低,5 mS/cm或更低,4 mS/cm或更低,或3 mS/cm或更低。在一個特定的實施方案中,所述獲得的溶液的導電率是2.5 mS/cm或更低,諸如2.25 mS/cm或更低,或2.0 mS/cm或更低。額外地提供試劑盒，所述試劑盒包含:
a.凍幹的M72相關抗原；和
b.水溶液，其中所述溶液中的鹽濃度是130mM或更低。在某些實施方案中，所述水溶液中的鹽濃度是100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一個特定的實施方案中，所述水溶液中的鹽濃度是35 mM或更低，諸如30 mM或更低或25 mM或更低。合適地，所述水溶液中的鹽濃度使得當重構凍幹抗原時獲得的溶液的鹽濃度是130 mM或更低，諸如100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一個特定的實施方案中，所述獲得的溶液中的鹽濃度是35 mM或更低，諸如30 mM或更低，或25 mM或更低。進一步地提供試劑盒,所述試劑盒包含:
a.凍幹的M72相關抗原；和
b.水溶液，其中所述溶液中的氯化鈉濃度是130mM或更低。在某些實施方案中，所述水溶液中的氯化鈉濃度是100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一個特定的實施方案中，所述水溶液中的鹽濃度是35 mM或更低，諸如30 mM或更低，20 mM或更低，或15 mM或更低。合適地，溶液中的氯化鈉濃度或等於或低於5 mM。
合適地，所述水溶液中的氯化鈉濃度使得當重構凍幹抗原時獲得的溶液的氯化鈉濃度是130 mM或更低，諸如100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一個特定的實施方案中，所述獲得的溶液中的氯化鈉濃度是35 mM或更低，諸如30 mM或更低，或25 mM或更低。試劑盒可以適於提供單一劑量的免疫原性組合物，諸如單人劑量，或多劑量的免疫原性組合物。用於本發明試劑盒的水溶液可以是本文所定義的任何水溶液。在本發明的特定的實施方案中，水溶液包含呈脂質體形式的TLR4激動劑和/或皂苷。在一個特定的實施方案中，TLR4激動劑是3D-MPL且皂苷是QS21。本文所用的水溶液可包含漲度劑，例如多元醇，諸如山梨醇。關於上面提到的用於產生本發明的免疫原性組合物的試劑盒和方法，可以指出的是，如果存在的話，一種或多種免疫刺激劑和一種或多種漲度劑可以根據需要與抗原共同凍幹或含在水溶液中。水溶液可以簡單地是注射用水，且免疫原性組合物的所有其他組分與抗原共同凍幹。通常，至少一些一種或多種免疫刺激劑和一種或多種漲度劑在水溶液中提供，如果某些組分與凍幹相容性較差，諸如脂質體，那麼這是特別合適的。在一個實施方案中，水溶液包含免疫刺激劑。在第二個實施方案中，水溶液包括漲度劑，例如非離子漲度齊U，諸如多元醇，特別是山梨醇。在第三個實施方案中，水溶液包含免疫刺激劑和漲度劑，諸如多元醇，特別是山梨醇。試劑盒可以進一步包括指示使用水溶液重構凍幹M72相關抗原的說明。根據本發明的免疫原性組合物可以用於藥物中，特別是用於預防、治療或改善分枝桿菌的感染，諸如結核分枝桿菌的感染。免疫原性組合物將通常提供用於施用於人，儘管它們也可能在獸藥中諸如施用於牛中是有價值的。提供了本發 明的免疫原性組合物在製備藥物中的用途，所述藥物特別用於預防、治療或改善分枝桿菌的感染，諸如結核分枝桿菌的感染。還提供了用於預防、治療或改善分枝桿菌的感染，諸如結核分枝桿菌的感染的方法，所述方法包括施用安全和有效量的本發明的免疫原性組合物。可以出於下述目的提供免疫原性組合物:
-治療活動性結核；
-預防活動性結核，諸如通過施用於未感染的受試者，或者具有潛伏感染的受試者；
-治療潛伏結核；
-預防潛伏結核，諸如通過施用於未感染的受試者；或
-預防或延緩結核病的再活化，特別是TB再活化的延緩，例如延緩數月、數年或甚至無限期。術語「活動性感染」指具有已顯現的疾病症狀和/或損傷(合適地具有顯現的疾病症狀)的感染，例如，結核分枝桿菌感染。術語「非活動性感染」、「休眠感染」或「潛伏感染」指未顯示疾病症狀和/或損傷(合適地未顯示疾病症狀)的感染，例如，結核分枝桿菌感染。具有潛伏感染的受試者將合適地是測試為陽性感染的受試者，例如通過基於pro或T細胞的測定，但所述受試者還沒有表現出疾病症狀和/或與活動性感染相關的損傷。
術語「原髮結核病」指在感染(例如，結核分枝桿菌感染)後直接形成的臨床疾病，例如，疾病症狀的顯現。參見Harrison’s Principles of Internal Medicine,第 150章，pp.953-966 (第 16 版，Braunwald,等人編輯，2005)。術語「繼發性結核病」或「原發後結核病」指休眠、非活動性或潛伏性感染(例如，結核分枝桿菌感染)的再活化。參S Principles of Internal Medicine,第150 章，pp.953-966 (第 16 版，Braunwald,等人編輯，2005)。術語「結核病再活化」指感染測試呈陽性(例如，在結核菌素皮試中呈陽性，合適地在體外基於T細胞的測定中呈陽性)但沒有明顯的疾病症狀的個體隨後顯現疾病症狀。合適地，個體將沒有再暴露於感染。該陽性診斷測試表明該個體被感染，然而，該個體可能曾顯示或未曾顯示已進行過充分治療以將結核病帶入非活動性或潛伏狀態的活動性疾病的症狀。合適地，將免疫原性組合物施用於未感染的受試者或具有分枝桿菌潛伏感染，諸如結核分枝桿菌感染的受試者。施用的免疫原性組合物的體積將根據許多其他因素而變化，諸如特定遞送途徑，例如肌內、皮下或皮內途徑。通常，用於人的單一注射(單位劑量)施用的體積將是50 u I至I ml，諸如100 ill至750 yl，特別是400至600 yl，例如約500 yl。單一劑量內含有的M72相關抗原的量取決於臨床需要，但是單一人劑量將通常是I至100 yg，諸如5至50 yg，例如5至20 u g0單一人劑量可以含有約10 y g的M72相關抗原。合適地，本發明的組合物將是穩定的，其中是指在25°C儲存24小時的期間過程中，如通過本文中描述的技術所測量的抗原性保留儲存前抗原性的至少80%。期望地，在25°C儲存24小時的期間後，抗原·性將保留至少85%，諸如至少90%，特別是至少95%。對於特別感興趣的組合物，在30°C儲存24小時的期間後，保留組合物的至少80%，諸如至少85 %，至少90 %，特別是至少95 %的抗原性。現在藉助以下非限制性實例將進一步描述本發明。
實施例實施例1:佐劑組合物ASA (山梨醇)的製備
製備佐劑組合物，其包含使用山梨醇作為漲度劑的脂質體製劑中的3-脫-0-醯化單磷醯脂質A和QS21。其製備如下:
A.脂質體的製備方法:
將脂質(DOPC)、膽固醇和3-脫-0-醯化單磷醯脂質A的有機溶液中的混合物真空乾燥。然後加入水溶液(磷酸鹽緩衝鹽水[100 mM NaCl,50 mM磷酸鹽pH 6.1])並攪拌容器直到所有脂質呈懸浮狀態。用高剪切混合器將該懸浮液預均質，再進行高壓均質，直到脂質體大小降低到經DLS測定約為90nm土 10nm。然後將脂質體除菌過濾。B.ASA 製劑:
步驟1:濃縮脂質體的稀釋
當稀釋10倍時，將Na2/K磷酸鹽緩衝液100 mM pH 6.1加入到注射用水中，在最終製劑中達到IOmM磷酸鹽緩衝液濃度。再加入30% (w/v)山梨醇的注射用水(WFI)溶液，在最終製劑中達到4.7%的濃度-將其在室溫下攪拌15-45分鐘。再將濃縮脂質體(分別由40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的DOPC、膽固醇和3D-MPL製成)加入到該混合物中，在最終製劑中達到100 ug/ml 3D-MPL的濃度。然後將混合物在室溫下攪拌15-45分鐘。步驟2:加入QS21
使用蠕動泵，將QS21貯液加入到稀釋的脂質體中，同時磁力攪拌，在最終製劑中達到100 ug/ml的濃度。將混合物攪拌15-45分鐘。最終ASA (山梨醇)製劑中含有2 mg DOPC,500 ug膽固醇、100 ug 3D_MPL/ml和
100ug QS21/ml、4.7%山梨醇以及5 mM氯化鈉和10 mM磷酸鹽。步驟3:檢查 pH 為 6.1 ±0.1
步驟4:除菌過濾
使用來自PALL Corporation的聚醚碸(PES)濾器進行除菌過濾。步驟5:在+2°C至+8°C儲存
獲得佐劑組合物，其包含在脂質體製劑中的3-脫-0-醯化MPL和QS21並含有作為漲度劑的山梨醇(稱為ASA (山梨醇))，然後儲存在4°C。實施例2:佐劑糹目合物ASA (150 mM NaCl)的制各
使用作為漲度劑的氯化鈉製備佐劑組合物，其包含脂質體製劑中的3-脫-0-醯化單磷醯脂質A和QS21。A.脂質體的製備方法:
將脂質(DOPC)、膽固醇和3-脫-0-醯化單磷醯脂質A(3D-MPL)的有機溶液的混合物真空乾燥。再加入磷酸鹽緩衝鹽水(100 mM NaCl,50 mM磷酸鹽pH 6.1)並攪拌容器直到所有脂質呈懸浮狀態。再用高剪切混合器將該懸浮液預均質，然後進行高壓均質，直到脂質體大小降低到經DLS測定約為90 nm 土 10 nm。然後將脂質體在0.22 um PES膜上除菌過濾。B.ASA 製劑:
步驟1:濃縮脂質體的稀釋
當稀釋10倍時，將Na2/K磷酸鹽緩衝液IOOmM pH6.45和NaCl 1.5M加入到注射用水中，在最終製劑中分別達到IOmM磷酸鹽和NaCl 150mM的濃度。將該混合物在室溫下攪拌5分鐘。再將濃縮脂質體(分別由40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的D0PC、膽固醇和3D-MPL製成)加入到該混合物中，在最終製劑中達到100 ug/ml 3D-MPL的濃度。然後將混合物在室溫下攪拌5-15分鐘。步驟2:加入QS21
將QS21貯液加入到稀釋的脂質體中，同時磁力攪拌，在最終製劑中達到100 ug/ml的濃度。將混合物在室溫下攪拌。步驟3:檢查pH目的為6.1 ±0.1 步驟4:除菌過濾
使用來自PALL Corporation的聚醚碸(PES)濾器上進行除菌過濾。步驟5:在+2 V至+8 V儲存
ASA (150 mM NaCl)的最終組合物是2 mg D0PC,500 ug膽固醇、100 ug 3-脫-0-醯化MPLUOO ug QS21/ml、10 mM 磷酸鹽和 150 mM NaCl。實施例3:QS21裂解活件
已知QS21能裂解紅血細胞(RBC)。測試實施例1中製備的ASA (山梨醇)佐劑組合物，以確保QS21的裂解活性以與包含150mM NaCl的當量佐劑組合物(ASA (150mM NaCl))中所觀察到的同樣方式被猝滅。通過溶血測定，使用雞紅血細胞(chicken Red Blood cell, RBC)測定QS21的裂解活性。將RBC在550g於4°C離心。棄去上清液。將沉澱小心重懸於PBS緩衝液中達原先體積並且重複同樣操作，直到上清液不再呈紅色(通常3次)。如果不直接使用的話，將沉澱儲存於4°C持續3-4天(並在使用當天再次洗滌)，或者如果在同一天使用的話，將其在緩衝液中稀釋約10倍。臨時在ASA緩衝液(在測試ASA樣品後在鹽或在山梨醇緩衝液中)中製作QS21劑量範圍曲線並且製備佐劑樣品(含50 ug或90 ug QS21當量，即相當於500 ul或900 ulASA當量)。在標準品和樣品中用充足緩衝液(含或不含山梨醇，隨所測試樣品的緩衝液而定)將終體積調節至900ul。因為其為乳色，ASA幹擾光密度(OD)。因此製備ASA 「空白」並從ASA測試樣品的OD值中減去「空白」 0D。這些空白相當於與樣品中測試的體積相同的ASA體積，但用緩衝液調節至Iml。這些空白中不加RBC。然後將標準品和樣品與RBC —起(將100 ul稀釋RBC加入到900 ul標準品和樣品中)在室溫下(RT)孵育30分鐘。再將樣品在900g離心5分鐘。離心後在540nm處測定光密度。通過限值試驗(limit test)進行裂解活性的測定。1.檢測限值(LOD)定義為導致下列OD的最低QS21濃度:
-比基礎水平更高(0D>0 .1)
-比緩衝液(「0 ug」QS21)的OD高約3倍 -在曲線的上升部分 -對每次試驗進行測定
2.如果佐劑樣品的OD大於ODmi,則佐劑樣品中QS21的裂解活性始終是陽性的。實例QS21曲線
權利要求
1.包含M72相關抗原的免疫原性組合物，其中: (i)所述組合物的導電率是13mS/cm或更低；和/或 (ii)所述組合物中鹽的濃度是130mM或更低；和/或 (iii)所述組合物中氯化鈉的濃度是130mM或更低。
2.根據權利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述組合物的導電率是10mS/cm或更低。
3.根據權利要求2所述的免疫原性組合物，其中所述組合物的導電率是3mS/cm或更低。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述組合物中鹽的濃度是100 mM或更低。
5.根據權利要求4所述的免疫原性組合物，其中所述組合物中鹽的濃度是40mM或更低。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述組合物中氯化鈉的濃度是100 mM或更低。
7.根據權利要求6所述的免疫原性組合物，其中所述組合物中氯化鈉的濃度是40mM或更低。·
8.根據權利要求1至7中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物中CaCl2的濃度是30 mM或更低。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物中MgSO4的濃度是60或更低。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的免疫原性組合物，NH4\Mg2+和Ca2+離子的總濃度是40 mM或更低。
11.根據權利要求1至10中任一項所述的免疫原性組合物，進一步包含非離子漲度劑。
12.根據權利要求11所述的免疫原性組合物，其中所述非離子漲度劑是多元醇。
13.根據權利要求12所述的免疫原性組合物，其中所述多元醇是山梨醇。
14.根據權利要求13所述的免疫原性組合物，其中所述山梨醇的濃度是約4至約6%(w/v)。
15.根據權利要求1至14中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述蔗糖的濃度是約4至約 6% (w/v) o
16.根據權利要求1至15中任一項所述的免疫原性組合物，進一步包含一種或多種免疫刺激劑。
17.根據權利要求16所述的免疫原性組合物，其中所述免疫刺激劑是皂苷和/或TLR4激動劑。
18.根據權利要求17所述的免疫原性組合物，其中所述一種或多種免疫刺激劑是脂質體形式。
19.根據權利要求17或權利要求18所述的免疫原性組合物，其中所述皂苷是QS21。
20.根據權利要求17至19中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述TLR4激動劑是3-脫-0-醯化單磷醯脂質A。
21.根據權利要求1至20中任一項所述的免疫原性組合物，其中重量摩爾滲透壓濃度是 250 至 750 mOsm/kg。
22.根據權利要求1至21中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述組合物作為50ul至I ml的單位劑量提供。
23.根據權利要求22所述的免疫原性組合物，其中所述單位劑量是IOOul至750ul。
24.根據權利要求22或23所述的免疫原性組合物，其中所述單位劑量含有I至100Ug的M72相關抗原。
25.根據權利要求24所述的免疫原性組合物，其中單位劑量含有5至50Ug的M72相關抗原。
26.根據權利要求1至25中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述組合物的pH在7.0至9.0的範圍內。
27.根據權利要求1至26中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述M72相關抗原包含與SEQ ID No:1具有至少70%同一性的序列。
28.根據權利要求27所述的免疫原性組合物，其中所述M72相關抗原由與SEQID No:1具有至少70%同一性的序列組成。
29.根據權利要求28所述的免疫原性組合物，其中所述M72相關抗原包含與SEQIDNo:1具有至少90%同一性的序列。
30.根據權利要求29所述的免疫原性組合物，其中所述M72相關抗原由與SEQID No:1具有至少90%同一性的序列組成。
31.根據權利要求1至26中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述M72相關抗原包含SEQ ID No:1的胺基酸序列。
32.根據權利要求1至26中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述M72相關抗原包含SEQ ID No:3的胺基酸序列。
33.根據權利要求31所述的免疫原性組合物，其中所述M72相關抗原由SEQID No:1的胺基酸序列組成。
34.根據權利要求32所述的免疫原性組合物，其中所述M72相關抗原由SEQID No: 3的胺基酸序列組成。
35.根據權利要求1至32中任一項所述的免疫原性組合物，其中在250C儲存24小時的期間後保持所述免疫原性組合物的至少80%的抗原性。
36.根據權利要求1至35中任一項所述的免疫原性組合物，其用於藥物中。
37.根據權利要求1至35中任一項所述的免疫原性組合物在藥物製備中的用途。
38.用於預防、治療或改善分支桿菌感染、諸如結核分枝桿菌感染的方法，所述方法包括施用安全且有效量的權利要求1至35中任一項的免疫原性組合物。
39.製備權利要求1至35中任一項的免疫原性組合物的工藝，其包括以下步驟: a)凍幹M72相關抗原；和 b)用水溶液重構步驟a)的凍幹的M72相關抗原，其中: (i)所述溶液的導電率是13mS/cm或更低；和/或 (ii)所述溶液中鹽的濃度是130mM或更低；和/或 (iii)所述溶液中氯化鈉的濃度是130mM或更低。
40.製備權利要求1至35中任一項的穩定的免疫原性組合物的方法，其包括下列步驟: a)凍幹M72相關抗原；和 b)用水溶液重構步驟a)的凍幹的M72相關抗原，其中: (i)所述溶液的導電率是13mS/cm或更低；和/或 (ii)所述溶液中鹽的濃度是130mM或更低；和/或 (iii)所述溶液中氯化鈉的濃度是130mM或更低； 其中在25 0C儲存24小時的期間後保持所述免疫原性組合物的至少80%的抗原性。
41.試劑盒，包含: a)凍幹的M72相關抗原；和 b)水溶液，其中: (i)所述溶液的導電率是13mS/cm或更低；和/或 (ii)所述溶液中鹽的濃度是130mM或更低；和/或 (iii)所述溶液中氯化鈉的濃度是130mM或更低。
42.根據權利要求39所述的工藝、根據權利要求40所述的方法或根據權利要求41所述的試劑盒，其中所述水溶液包含免疫刺激劑。
43.根據權利要求42所述的工藝、方法或試劑盒，其中所述水溶液包含脂質體製劑中的皂苷和TLR4激動劑，和非離子漲度劑。
44.根據權利要求43所述的工藝、方法或試劑盒，其中所述非離子漲度劑是山梨醇。
45.根據權利要求44所述的工藝、方法或試劑盒，其中所述山梨醇的濃度是約2.5至約15% (w/v)。
46.根據權利要求43至45中任一項所述的工藝、方法或試劑盒，其中所述皂苷是QS21。
47.根據權利要求43至46中任一項所述的工藝、方法或試劑盒，其中所述TLR4激動劑是3-脫-O-酸化單憐酸脂質A。
全文摘要
提供了包含M72相關抗原的免疫原性組合物及其在藥物中的用途，其中所述組合物的導電率是13mS/cm或更低，或者所述組合物的鹽濃度是130mM或更低。
文檔編號A61K39/04GK103249431SQ201180060222
公開日2013年8月14日 申請日期2011年12月14日 優先權日2010年12月14日
發明者S.A.G.戈達特, A.拉南, D.I.萊莫伊內 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司