仔豬水腫病滅活疫苗的製備方法及其產品的製作方法
2023-11-30 18:32:36
專利名稱：仔豬水腫病滅活疫苗的製備方法及其產品的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種滅活疫苗的製備方法，尤其涉及仔豬水腫病滅活疫苗的製備方法以及由該製備方法得到的滅活疫苗產品，屬於仔豬水腫病滅活疫苗的生產領域。
背景技術：
仔豬水腫病(Edema disease,ED)病原屬於腸桿菌科埃希菌屬大腸埃希菌種，產類志賀毒素大腸桿菌。研究證明，有％個0抗原血清型與仔豬水腫病發生有關，其中主要有 0 2,0 8,0 138,0 139,0 141等0抗原血清型，這些菌株多具有溶血性，其中，C83684屬於 0 139的一個種屬。在臨床上，該病主要引起仔豬眼瞼水腫和神經症狀，部分仔豬伴有腹瀉症狀，剖檢可見眼瞼、胃壁、腸繫膜水腫，組織病變為器官漿液性炎症及廣泛性小動脈炎症。 仔豬水腫病主要發生在斷乳後1-2周的仔豬，尤其在發育良好的仔豬群，造成很大的經濟損失，是斷奶仔豬危害較嚴重的疾病。此病分布於全世界，中國也常見報導，是多年來困擾中國養豬業的問題之一。雖然此病可採用抗生素及磺胺類藥物進行治療，但會造成藥物殘留，據現地調查90%以上的大型養豬場均採用接種疫苗的方式來防治該病。目前，中國國內一些生物製品生產廠家生產的仔豬水腫病疫苗均為滅活疫苗。其主要的工藝方法如下1、製備一級斜面菌種將大腸桿菌菌種稀釋接種營養肉湯平板，37 °C培養 22-24h ；選典型菌落接種營養肉湯斜面培養基，37°C培養Mh，得到一級斜面菌種；2、製備二級菌種取一級斜面菌種接種於營養肉湯基中37°C振蕩培養18_20h，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到營養肉湯培養基中用生物發酵罐培養；37°C通氣培養18-20h，純檢確認無菌後，滅活，即得。按照現有的方法進行生產所製備得到的仔豬水腫病滅活疫苗的培養菌數一般都在100-200億/ml。此外，現有的仔豬水腫病滅活疫苗的製備方法還存在培養基營養成分少，生產成本高，產量低等缺陷，有待改進。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有的仔豬水腫病滅活疫苗的製備方法中所普遍存在的培養菌數低、生產成本高等缺陷，提供一種新的仔豬水腫病滅活疫苗的製備方法，該製備方法具有培養基營養豐富，生產成本低，產量高等優點。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的一種仔豬水腫病滅活疫苗的製備方法，包括以下步驟(1)、製備一級斜面菌種將大腸桿菌菌種稀釋接種合成平板培養基，培養；選取所培養的典型菌落接種合成斜面培養基，培養，得到一級斜面菌種；(2)、製備二級菌種取一級斜面菌種接種於合成培養基中振蕩培養，得到二級菌種，備用；
3
(3)、菌液培養將二級菌種接種到合成培養基中進行發酵培養；將發酵培養液滅活，即得。其中，步驟(1)中所述的大腸桿菌菌種為大腸桿菌C83684菌種；所述的合成平板培養基或合成斜面培養基的成分包括蒸餾水100ml、牛肉粉0. 5g、酵母提取物0. 5g、胰蛋白腖lg、氯化鈉lg、瓊脂粉1. 5g、葡萄糖0. 5g、DMEM0. Ig ；所述的培養優選在以下條件下進行培養溫度為37°C，培養時間為22-24h。優選的，步驟(1)中選10-20個所培養的典型菌落接種合成斜面培養基；步驟⑵或步驟(3)中所述合成培養基的成分包括蒸餾水3000ml、牛肉粉15g、 酵母提取物15g、胰蛋白腖30g、氯化鈉30g、葡萄糖15g、DMEM 3g ；其pH值為7. 2-7. 4。步驟O)中所述的振蕩培養優選在以下條件下進行振蕩轉速為100-200r/min， 培養溫度為37°C，培養時間為16h。步驟(3)中所述的發酵培養條件優選為培養溫度為37°C;轉速為100-200r/min ； 培養時間為12h ；本發明人經過進一步的試驗發現，在發酵培養過程中，採用逐漸加大通氣量的方法，能夠顯著提高培養菌數。本發明針對現有的仔豬水腫病滅活疫苗的製備方法所存在的培養基營養成分少， 生產成本高，產量低等缺陷，改進培養基配方並優化了生產工藝，最終在培養基配方和培養方法上獲得突破，培養菌數相比於現有的方法有大幅度提高，平均達到了 279. 875億/ml， 本發明方法培養時間縮短了 8-10h，有效降低了生產成本。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。1、大腸桿菌C83684菌種購自中國獸醫藥品監察所。2、各培養基的具體組成成分及配製(1)營養肉湯培養基牛肉湯1000ml、蛋白腖10g、氯化鈉5g ；
(2)合成平板培養基蒸餾水100ml、牛肉粉0. 5g、酵母提取物0. 5g、胰蛋白腖lg、 氯化鈉lg、瓊脂粉1. 5g、葡萄糖0. 5g、DMEMO. Ig ；(3)合成斜面培養基成分與合成平板培養基相同；(4)合成培養基蒸餾水3000ml、牛肉粉15g、酵母提取物15g、胰蛋白腖30g、氯化鈉 30g、葡萄糖 15g、DMEM3g ；調 pH7. 2-7. 4、115°C滅菌 40 分鐘。實施例11、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養基37°C培養 22h，選典型菌落10個接種合成斜面培養基，37°C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於合成培養基中全溫振蕩器37°C培養 16h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到合成培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度
437°C，轉速lOOr/min，進氣量18m3/h，罐內壓0. 05Mpa，培養時間12h ；取樣平板活菌計數、純檢確認無菌後，滅活，即得。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。實施例21、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養基37°C培養 Mh，選典型菌落20個接種合成斜面培養基，37°C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於合成培養基中全溫振蕩器37°C培養 16h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到合成培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度 37°C，轉速200r/min，進氣量18m3/h，罐內壓0. 05Mpa，培養時間12h ；取樣平板活菌計數、純檢確認無菌後，滅活，即得。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。實施例31、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養基37°C培養 23h，選典型菌落15個接種合成斜面培養基，37°C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於合成培養基中全溫振蕩器37°C培養 16h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到合成培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度 37°C，轉速150r/min，罐內壓0. 05Mpa，培養時間12h ；在發酵培養過程中，採用逐漸加大通氣量的方法，其中0- 靜置培養，2-4h進氣量12m3/h，4-Mi進氣量14m3/h，6_1池進氣量 18m3/h。取樣平板活菌計數，純檢確認無菌後，滅活，即得。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。實施例41、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養基37°C培養 22h，選典型菌落20個接種合成斜面培養基，37°C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於合成培養基中全溫振蕩器37°C培養 16h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到合成培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度 37°C，轉速120r/min，罐內壓0. 05Mpa，培養時間12h ；在發酵培養過程中，採用逐漸加大通氣量的方法，其中0- 靜置培養，2-4h進氣量12m3/h，4-Mi進氣量14m3/h，6_1池進氣量 18m3/h。取樣平板活菌計數，純檢確認無菌後，滅活，即得。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。
實施例51、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養基37°C培養 Mh，選典型菌落10個接種合成斜面培養基，37°C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於合成培養基中全溫振蕩器37°C培養 16h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到合成培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度 37°C，轉速180r/min，罐內壓0. 05Mpa，培養時間1 ；在發酵培養過程中，採用逐漸加大通氣量的方法，其中0- 靜置培養，2-4h進氣量12m3/h，4-Mi進氣量14m3/h，6_1池進氣量 18m3/h。取樣平板活菌計數，純檢確認無菌後，滅活，即得。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。實施例61、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養基37°C培養 23h，選典型菌落16個接種合成斜面培養基，37°C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於合成培養基中全溫振蕩器37°C培養 16h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到合成培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度 37°C，轉速140r/min，進氣量18m3/h，罐內壓0. 05Mpa，培養時間12h ；取樣平板活菌計數，純檢確認無菌後，滅活，即得。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。實施例71、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養基37°C培養 Mh，選典型菌落17個接種合成斜面培養基，37°C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於合成培養基中全溫振蕩器37°C培養 16h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到合成培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度 37°C，轉速190r/min，進氣量18m3/h，罐內壓0. 05Mpa，培養時間12h ；取樣平板活菌計數，純檢確認無菌後，滅活，即得。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。實施例81、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種合成平板培養基37°C培養 Mh，選典型菌落18個接種合成斜面培養基，37°C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於合成培養基中全溫振蕩器37°C培養16h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到合成培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度 37°C，轉速200r/min，罐內壓0. 05Mpa，培養時間1 ；在發酵培養過程中，採用逐漸加大通氣量的方法，其中0- 靜置培養，2-4h進氣量12m3/h，4-Mi進氣量14m3/h，6_1池進氣量 18m3/h。取樣平板活菌計數，純檢確認無菌後，滅活，即得。培養菌數的檢測結果見表1。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。對照實施例11、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養瓊脂平板37°C培養 22h，選典型菌落10個接種營養瓊脂斜面培養基，37°C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於營養肉湯培養基中全溫振蕩器37°C培養18h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到營養肉湯培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度37°C，轉速lOOr/min，進氣量18m3/h，罐內壓0. 05Mpa，培養時間18h ；取樣平板活菌計數純檢確認無菌後，滅活，即得。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。對照實施例21、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養瓊脂平板37°C培養 24h,選典型菌落20個接種營養瓊脂斜面培養基，370C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於營養肉湯培養基中全溫振蕩器37°C培養18h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到營養肉湯培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度37°C，轉速200r/min，進氣量18m3/h，罐內壓0. 05Mpa，培養時間18h ；取樣平板活菌計數純檢確認無菌後，滅活，即得。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。對照實施例31、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養瓊脂平板37°C培養 23h，選典型菌落15個接種營養瓊脂斜面培養基，37°C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於營養肉湯培養基中全溫振蕩器37°C培養18h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到營養肉湯培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度37°C，轉速150r/min，進氣量18m3/h，罐內壓0. 05Mpa，培養時間18h ；取樣平板活菌計數純檢確認無菌後，滅活，即得。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。對照實施例41、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養瓊脂平板37°C培養 22h，選典型菌落20個接種營養瓊脂斜面培養基，370C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於營養肉湯培養基中全溫振蕩器37°C培養18h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到營養肉湯培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度37°C，轉速120r/min，進氣量18m3/h，罐內壓0. 05Mpa，培養時間18h ；取樣平板活菌計數，純檢確認無菌後，滅活，即得。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。對照實施例51、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養瓊脂平板37°C培養 Mh，選典型菌落10個接種營養瓊脂斜面培養基，37°C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於營養肉湯培養基中全溫振蕩器37°C培養18h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到營養肉湯培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度37°C，轉速180r/min，進氣量18m3/h，罐內壓0. 05Mpa，培養時間1 ；取樣平板活菌計數，純檢確認無菌後，滅活，即得。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。對照實施例61、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養瓊脂平板37°C培養 23h，選典型菌落16個接種營養瓊脂斜面培養基，370C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於營養肉湯培養基中全溫振蕩器37°C培養18h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到營養肉湯培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度37°C，轉速140r/min，進氣量18m3/h，罐內壓0. 05Mpa，培養時間18h ；取樣平板活菌計數，純檢確認無菌後，滅活，即得。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。對照實施例71、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養瓊脂平板37°C培養 Mh，選典型菌落17個接種營養瓊脂斜面培養基，37°C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於營養肉湯培養基中全溫振蕩器37°C培養18h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到營養肉湯培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度37°C，轉速190r/min，進氣量18m3/h，罐內壓0. 05Mpa，培養時間18h ；取樣平板活菌計數，純檢確認無菌後，滅活，即得。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。對照實施例8 1、一級斜面菌種製備大腸桿菌C83684菌種稀釋接種營養瓊脂平板37°C培養 Mh，選典型菌落18個接種營養瓊脂斜面培養基，37°C培養Mh，得到一級斜面菌種，放置 4°C冰箱待用；2、二級菌種製備取一級斜面菌種接種於營養肉湯培養基中全溫振蕩器37°C培養18h，純檢確認無菌後，得到二級菌種，備用；3、菌液培養將二級菌種接種到營養肉湯培養基中用生物發酵罐進行培養；培養溫度37°C，轉速200r/min，罐內壓0. 05Mpa，培養時間18h ；在發酵培養過程中，採用逐漸加大通氣量的方法，其中0- 靜置培養，2-4h進氣量12m3/h，4-6h進氣量14m3/h，6-18h進氣量18m3/h。取樣平板活菌計數，純檢確認無菌後，滅活，即得。培養菌數的檢測結果見表1。採用《獸用生物製品規程》活菌計數法，營養瓊脂平板計數，計算培養菌數，培養菌數的檢測結果見表1。表1現在生物製品廠普遍採用的工藝培養方法和本發明方法培養菌數對比
權利要求
1.一種仔豬水腫病滅活疫苗的製備方法，包括以下步驟(1)、將大腸桿菌菌種稀釋接種合成平板培養基，培養；選取所培養的典型菌落接種合成斜面培養基，培養，得到一級斜面菌種；(2)、取一級斜面菌種接種於合成培養基中振蕩培養，得到二級菌種，備用；(3)、將二級菌種接種到合成培養基中進行發酵培養；將發酵培養液滅活，即得。
2.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(1)中所述的大腸桿菌菌種為大腸桿菌C83684菌種。
3.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(1)中選10-20個所培養的典型菌落接種合成斜面培養基。
4.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(1)中所述的培養在以下條件下進行培養培養溫度為37°C，培養時間為22-24h。
5.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(1)中所述的合成平板培養基或合成斜面培養基的成分包括蒸餾水100ml、牛肉粉0. 5g、酵母提取物0. 5g、胰蛋白腖lg、 氯化鈉lg、瓊脂粉1. 5g、葡萄糖0. 5g、DMEMO. lg。
6.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)或步驟(3)中所述合成培養基的成分包括蒸餾水3000ml、牛肉粉15g、酵母提取物15g、胰蛋白腖30g、氯化鈉30g、 葡萄糖 15g、DMEM 3g ；pH 值為 7. 2-7. 4。
7.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)中所述的振蕩培養為振蕩轉速為100-200r/min，培養溫度為37°C，培養時間為16h。
8.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(3)中所述的發酵培養為培養溫度為37°C ；轉速為100-200r/min ；培養時間為12h。
9.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(3)中在發酵培養過程中，採用逐漸加大通氣量的方法進行發酵培養。
10.由權利要求1-9任何一項製備方法製備得到的仔豬水腫病滅活疫苗。
全文摘要
本發明公開了一種仔豬水腫病滅活疫苗的製備方法及其產品，包括(1)、將大腸桿菌菌種稀釋接種合成平板培養基，培養；選取典型菌落接種合成斜面培養基，培養，得到一級斜面菌種；(2)、取一級斜面菌種接種於合成培養基中振蕩培養，得到二級菌種；(3)、二級菌種接種到合成培養基中進行發酵培養；滅活發酵培養液，即得。本發明針對仔豬水腫病滅活疫苗製備方法所存在的培養基營養成分少，生產成本高，產量低等缺陷，改進培養基配方並優化了生產工藝，本發明方法培養菌數相比於現有的方法有大幅度提高，平均達到了279.875億/ml，培養時間縮短了8-10h，有效降低了生產成本。
文檔編號C12N1/20GK102266553SQ20111020201
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月19日 優先權日2011年7月19日
發明者丁國傑, 付麗傑, 孫建富, 孫德君, 孟福強, 張楊, 曲海波, 柴華, 王彬, 王琪, 田路路, 謝德炎, 鄭鐵鑫, 郝建偉 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司