ZESTE增強子同源物2抑制劑的製作方法
2023-11-30 19:26:01
本發明涉及化合物，其抑制zeste增強子同源物2(ezh2)並且因此用於在癌細胞中抑制增殖和/或誘導細胞凋亡。
背景技術：
表觀遺傳修飾在許多細胞過程(包括細胞增殖、分化和細胞存活)的調節中起著重要作用。總體表觀遺傳修飾在癌症中是常見的，且包括導致致癌基因、腫瘤抑制基因和信號通路的異常活化或失活的dna和/或組蛋白甲基化的總體變化、非編碼rna的失調以及核小體重構。但是，不像癌症中出現的基因突變，這些表觀遺傳變化可通過選擇性抑制所參與的酶而被逆轉。已知參與組蛋白或dna甲基化的多個甲基化酶在癌症中失調。因此，特定甲基化酶的選擇性抑制劑將有用於治療增殖性疾病，例如癌症。
ezh2(人ezh2基因：cardoso，c，等人；europeanjofhumangenetics，第8卷，第3期，174-180頁，2000)為多梳抑制複合物2(polycombrepressorcomplex2，prc2)的催化亞單位，其功能是通過將組蛋白h3的賴氨酸27三甲基化(h3k27me3)來使靶基因沉默。組蛋白h3是參與真核細胞染色質結構的五種主要組蛋白之一。以主要球狀結構域和長的n末端尾為特徵的組蛋白涉及核小體結構，即'串珠'結構。雖然組蛋白被高度地翻譯後修飾，但組蛋白h3是五種組蛋白中被最廣泛修飾的。單獨的術語「組蛋白h3」是有意模糊的，因為它沒有區分序列變體或修飾狀態。組蛋白h3是表觀遺傳學(epigenetics)新領域中的重要蛋白，其中其序列變體和可變的修飾狀態被認為在基因的動力學和長期調節中發揮著作用。
已經在許多實體瘤(包括前列腺、乳腺、皮膚、膀胱、肝、胰腺、頭和頸的腫瘤)中觀測到了增加的ezh2表達並且所述增加的ezh2表達與癌症進攻性、轉移性和不良預後有關(varambally等人，2002；kleer等人，2003；breuer等人，2004；bachmann等人，2005；weikert等人，2005；sudo等人，2005；bachmann等人，2006)。例如，在具有高ezh2水平的乳腺癌患者中，存在在前列腺切除術後表達高水平ezh2的腫瘤復發、轉移增加、無疾病生存期縮短和死亡增加的風險(varambally等人，2002；kleer等人，2003)。最近，在utx(ubiquitouslytranscribedtetratricopeptiderepeatsx，泛轉錄的三十四肽重複x)(即h3k27去甲基化酶，其與ezh2的功能相反)中的失活突變已經在多個實體瘤和血液腫瘤類型(包括腎腫瘤、成膠質細胞瘤、食管腫瘤、乳腺腫瘤、結腸腫瘤、非小細胞肺腫瘤、小細胞肺腫瘤、膀胱腫瘤、多發性骨髓瘤和慢性髓樣白血病腫瘤)中得以證實，且低utx水平與乳腺癌中低存活有關，意味著utx功能的喪失導致h3k27me3的增加和靶基因的抑制(wang等人，2010)。總而言之，這些數據表明，在許多腫瘤類型中，增加的h3k27me3水平導致癌症的惡化，並且ezh2活性的抑制可提供治療益處。
許多研究報導，通過sirna或shrna直接敲除ezh2或通過sah水解酶抑制劑3-去氮腺嘌呤a(deazaneplanocina，dznep)的治療間接消耗ezh2均降低癌細胞系在體外的增殖與侵入並降低體內腫瘤生長(gonzalez等人，2008，gbm2009)。雖然不知道異常ezh2活性導致癌症進展的確切機理，但是許多ezh2靶基因是腫瘤抑制劑，意味著腫瘤抑制劑功能的喪失是關鍵機理。此外，ezh2在永生化或原代上皮細胞中的過表達促進無貼壁依賴性生長和侵入且需要ezh2催化活性(kleer等人，2003；cao等人，2008)。
因此，有力的證據顯示，ezh2活性的抑制降低了細胞增殖和侵入。因此，抑制ezh2活性的化合物將可用於治療癌症。
發明概述
本發明涉及式(i)化合物或其藥學上可接受的鹽：
其中：
x和y各自獨立地為ch、c或n；其中
當x為n，y為ch時，為單鍵；
當y為n，x為ch時，為單鍵；
當x和y各為ch時，為單鍵；和
當x為c，y為c時，為雙鍵；
z為ch或n；
r1和r2各自獨立地為(c1-c4)烷基；
r3和r4各為氫；
或r3和r4一起表示-ch2ch2-；
r5和r6各自獨立地為(c1-c3)烷基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2、羥基、嘧啶基、噁唑基甲基、和-c(＝n-cn)nh(c1-c4)烷基；
條件是所述化合物不是n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-((4-(二甲基氨基)環己基)(乙基)氨基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺、5-((4-(二甲基氨基)環己基)(乙基)氨基)-4-甲基-n-((6-甲基-2-氧代-4-丙基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)噻吩-3-甲醯胺、n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)乙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺、n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺、n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)環己基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺或n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(4-(乙基(甲基)氨基)環己基)氨基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺或各個這些化合物的立體異構體或其混合物。
本發明的另一方面涉及在實體瘤的癌細胞中誘導細胞凋亡；治療實體腫瘤的方法。
本發明的另一方面涉及包含式(i)化合物和藥學上可接受的賦形劑的藥物製劑。
在另一方面，提供了式(i)化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物，在製備用於治療由ezh2介導的病症(例如通過誘導癌細胞中的細胞凋亡)的藥物中的用途。
在另一方面，本發明提供了式(i)化合物或其藥學上可接受的鹽在治療由ezh2介導的疾病中的用途。本發明還提供了式(i)化合物或其藥學上可接受的鹽作為活性治療物質在治療由ezh2介導的疾病中的用途。
在另一方面，本發明提供了式(i)化合物或其藥學上可接受的鹽，其用於治療。
在另一方面，提供了式(i)化合物或其藥學上可接受的鹽，其用於治療由ezh2介導的病症。
在另一方面，提供了式(i)化合物或其藥學上可接受的鹽，其用於治療細胞增殖疾病。
在另一方面，提供了式(i)化合物或其藥學上可接受的鹽，用於治療癌症，包括治療實體瘤，例如腦癌(神經膠質瘤)、成膠質細胞瘤、白血病、淋巴瘤、bannayan-zonana症候群、考登病、lhermitte-duclos病、乳腺癌、炎性乳腺癌、威爾姆斯腫瘤、尤因肉瘤、橫紋肌肉瘤、室管膜瘤、成神經管細胞瘤、結腸癌、胃癌、膀胱癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、腎臟癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、骨肉瘤、骨的巨細胞腫瘤和甲狀腺癌。
在另一方面，提供了共同給藥本發明的式(i)化合物與其他活性成分的方法。
在另一方面，提供了式(i)化合物或其藥學上可接受的鹽和至少一種抗腫瘤藥的組合，其用於治療由ezh2介導的病症。
在另一方面，提供了式(i)化合物或其藥學上可接受的鹽和至少一種抗腫瘤藥的組合，其用於治療細胞增殖疾病。
在另一方面，提供了式(i)化合物或其藥學上可接受的鹽和至少一種抗腫瘤藥的組合，其用於治療癌症，包括治療實體瘤，例如腦癌(神經膠質瘤)、成膠質細胞瘤、白血病、淋巴瘤、bannayan-zonana症候群、考登病、lhermitte-duclos病、乳腺癌、炎性乳腺癌、威爾姆斯腫瘤、尤因肉瘤、橫紋肌肉瘤、室管膜瘤、成神經管細胞瘤、結腸癌、胃癌、膀胱癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、腎臟癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、骨肉瘤、骨的巨細胞腫瘤和甲狀腺癌。
發明詳述
本發明涉及如上定義的式(i)化合物。
在一個實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中x和y各自獨立地為ch或n，其中x和y中至少一個為ch，和為單鍵。在另一實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中x為n，y為ch，和為單鍵。在另一實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中y為n，x為ch，和為單鍵。在另一實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中x和y各為ch，和為單鍵。在另一實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中x和y各為c，和為雙鍵。
在另一實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中x為ch或c和y為ch，c或n，其中當y為n，x為ch時，為單鍵，當x和y各為ch時，為單鍵，且當x為c，y為c時，為雙鍵。
在具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中z為ch。在另一具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中z為n。
在另一實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基。在具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r1和r2各為甲基。
在另一具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r3和r4各為氫。在另一具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r3和r4一起表示-ch2ch2-；
在另一實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基。在具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r5為甲基。在另一具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r6為乙基。
在另一實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2和羥基。在另一實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r7為滷代(c1-c4)烷基。在另一實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r7為-n((c1-c4)烷基)2。在具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r7為二甲基氨基。在另一具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r7為羥基。
在另一實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r7為-c(＝n-cn)nh(c1-c4)烷基。在另一實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中z為n，和r7為-c(＝n-cn)nh(c1-c4)烷基。在具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中z為n，和r7為-c(＝n-cn)nhch3。
在另一具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r7選自：2-氟丙基、2-氟-2-甲基丙基、2,2-二氟乙基、2,2-二氟丙基、2,2,2-三氟乙基、羥基、二甲基氨基、嘧啶-2-基、噁唑-2-基甲基和-c(＝n-cn)nhch3。在另一具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r7選自：2-氟-2-甲基丙基、2,2-二氟丙基、2,2,2-三氟乙基、羥基、二甲基氨基、嘧啶-2-基和噁唑-2-基甲基。在另一具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r7選自：2-氟-2-甲基丙基、2,2-二氟丙基和2,2,2-三氟乙基。在另一具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r7為2-氟-2-甲基丙基。還在另一具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中r7為2,2-二氟丙基。
在具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中當r7為-n((c1-c4)烷基)2時，以下條件中至少一個必須滿足：
(i)z為n；
(ii)r3和r4一起表示-ch2ch2-；或
(iii)x和y各為c，和為雙鍵。
在另一具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中當r7為-n((c1-c4)烷基)2時，z為n。在另一具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中當r7為-n((c1-c4)烷基)2時，r3和r4一起表示-ch2ch2-。在另一具體實施方案中，本發明涉及式(i)化合物，其中當r7為-n((c1-c4)烷基)2時，x和y各為c，和為雙鍵。
在另一實施方案中，本發明還涉及式(ia)化合物：
或其藥學上可接受的鹽，其中z、r1、r2、r3、r4、r5、r6和r7根據式(i)定義，條件是所述化合物不是n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-((4-(二甲基氨基)環己基)(乙基)氨基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺、5-((4-(二甲基氨基)環己基)(乙基)氨基)-4-甲基-n-((6-甲基-2-氧代-4-丙基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)噻吩-3-甲醯胺或n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(4-(乙基(甲基)氨基)環己基)氨基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺或各個這些化合物的立體異構體或其混合物。
在具體實施方案中，本發明涉及式(ia)化合物，其中：
z為n；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4各為氫；
或r3和r4一起表示-ch2ch2-；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2、羥基和-c(＝n-cn)nh(c1-c4)烷基；
或其藥學上可接受的鹽。
在另一具體實施方案中，本發明涉及式(ia)化合物，其中：
z為n；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4各為氫；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2和羥基；
或其藥學上可接受的鹽。
在另一具體實施方案中，本發明涉及式(ia)化合物，其中：
z為ch或n；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4一起表示-ch2ch2-；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2和羥基；
或其藥學上可接受的鹽。
在另一實施方案中，本發明還涉及式(ib)化合物：
或其藥學上可接受的鹽，其中z、r1、r2、r3、r4、r5、r6和r7根據式(i)定義，條件是所述化合物不為n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)乙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺或n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺或這些化合物的立體異構體或其混合物。
在具體實施方案中，本發明涉及式(ib)化合物，其中：
z為n；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4各為氫；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2和羥基；
或其藥學上可接受的鹽。
在具體實施方案中，本發明涉及式(ib)化合物，其中：
z為n；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4各為氫；
或r3和r4一起表示-ch2ch2-；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2、羥基和-c(＝n-cn)nh(c1-c4)烷基；
或其藥學上可接受的鹽。
在另一具體實施方案中，本發明涉及式(ib)化合物，其中：
z為ch或n；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4一起表示-ch2ch2-；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2和羥基；
或其藥學上可接受的鹽。
在另一具體實施方案中，本發明涉及式(ib)化合物，其中：
z為ch；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4一起表示-ch2ch2-；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7為-n((c1-c4)烷基)2；
或其藥學上可接受的鹽。
在另一實施方案中，本發明還涉及式(ib2)化合物：
或其藥學上可接受的鹽，其中z、r1、r2、r3、r4、r5、r6和r7根據式(i)定義，條件是所述化合物不為n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)乙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺或n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺或這些化合物的立體異構體或其混合物。
在具體實施方案中，本發明涉及式(ib2)化合物，其中：
z為n；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4各為氫；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2和羥基；
或其藥學上可接受的鹽。
在具體實施方案中，本發明涉及式(ib2)化合物，其中：
z為n；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4各為氫；
或r3和r4一起表示-ch2ch2-；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2、羥基和-c(＝n-cn)nh(c1-c4)烷基；
或其藥學上可接受的鹽。
在另一具體實施方案中，本發明涉及式(ib2)化合物，其中：
z為ch或n；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4一起表示-ch2ch2-；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2和羥基；
或其藥學上可接受的鹽。
在另一具體實施方案中，本發明涉及式(ib2)化合物，其中：
z為ch；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4一起表示-ch2ch2-；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7為-n((c1-c4)烷基)2；
或其藥學上可接受的鹽。
在另一實施方案中，本發明還涉及式(ic)化合物：
或其藥學上可接受的鹽，其中z、r1、r2、r3、r4、r5、r6和r7根據式(i)定義，條件是所述化合物不為n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)環己基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺或其立體異構體或混合物。
在具體實施方案中，本發明涉及式(ic)化合物，其中：
z為n；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4各為氫；
或r3和r4一起表示-ch2ch2-；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2、羥基和-c(＝n-cn)nh(c1-c4)烷基；
或其藥學上可接受的鹽。
在另一具體實施方案中，本發明涉及式(ic)化合物，其中：
z為n；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4各為氫；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2和羥基；
或其藥學上可接受的鹽。
在另一實施方案中，本發明還涉及式(ic2)化合物：
或其藥學上可接受的鹽，其中z、r1、r2、r3、r4、r5、r6和r7根據式(i)定義，條件是所述化合物不為n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-(二甲基氨基)環己基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺或其立體異構體或混合物。
在具體實施方案中，本發明涉及式(ic2)化合物，其中：
z為n；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4各為氫；
或r3和r4一起表示-ch2ch2-；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2、羥基和-c(＝n-cn)nh(c1-c4)烷基；
或其藥學上可接受的鹽。
在另一具體實施方案中，本發明涉及式(ic2)化合物，其中：
z為n；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4各為氫；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2和羥基；
或其藥學上可接受的鹽。
在另一實施方案中，本發明還涉及式(id)化合物：
或其藥學上可接受的鹽，其中z、r1、r2、r3、r4、r5、r6和r7根據式(i)定義。
在具體實施方案中，本發明涉及式(id)化合物，其中：
z為n；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4各為氫；
或r3和r4一起表示-ch2ch2-；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2、羥基和-c(＝n-cn)nh(c1-c4)烷基；
或其藥學上可接受的鹽。
在另一具體實施方案中，本發明涉及式(id)化合物，其中：
z為ch或n；
r1和r2各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或正丁基；
r3和r4各為氫；
r5和r6各自獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基；和
r7選自：滷代(c1-c4)烷基、-n((c1-c4)烷基)2和羥基；
或其藥學上可接受的鹽。
本發明的具體化合物包括：
5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-亞基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺；
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺；
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲醯胺；
(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺；
(s)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺；
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺；
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(二甲基氨基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺；
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-羥基哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺；
5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮；
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-羥基環己亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺；
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基)丙基)噻吩-3-甲醯胺；
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(噁唑-2-基甲基)哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲醯胺；
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(嘧啶-2-基)哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲醯胺；
5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺；
5-(1-(1-(n'-氰基-n-甲基甲脒基)哌啶-4-亞基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺；
2-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮；
5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(1-(2-氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮；
n'-氰基-4-(1-(5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氫噻吩並[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)-n-甲基哌啶-1-甲脒；
5-(1-(1-(n'-氰基-n-甲基甲脒基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺；
5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-亞基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺；
(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺；
(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺；和
(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)乙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺；
或其藥學上可接受的鹽。
典型地，但不是絕對地，本發明的鹽是藥學上可接受的鹽。含有鹼性胺官能團或其他鹼性官能團的所公開的化合物的鹽可通過本領域已知的任何合適的方法製備，包括用無機酸處理游離鹼，所述無機酸諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，或用有機酸處理游離鹼，所述有機酸諸如乙酸、三氟乙酸、馬來酸、琥珀酸、扁桃酸、富馬酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水楊酸、吡喃糖基酸諸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸、α-羥基酸諸如檸檬酸或酒石酸、胺基酸諸如天冬氨酸或穀氨酸、芳族酸諸如苯甲酸或肉桂酸、磺酸諸如對甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸等。藥學上可接受的鹽的實例包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽(propiolate)、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、丁炔-1,4-二酸鹽、己炔-1,6-二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、苯乙酸鹽、苯基丙酸鹽、苯基丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥基丁酸鹽、乙醇酸鹽、酒石酸鹽、扁桃酸鹽和磺酸鹽諸如二甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、萘-1磺酸鹽和萘-2磺酸鹽。
含有羧酸官能團或其他酸性官能團的所公開的化合物的鹽可通過與合適的鹼反應製備。所述藥學上可接受的鹽可用提供藥學上可接受的陽離子的鹼製得，所述鹽包括鹼金屬鹽(尤其是鈉鹽和鉀鹽)、鹼土金屬鹽(尤其是鈣鹽和鎂鹽)、鋁鹽和銨鹽，以及所述藥學上可接受的鹽可從生理學可接受的有機鹼製得，所述有機鹼諸如三甲基胺、三乙基胺、嗎啉、吡啶、哌啶、甲基吡啶、二環己基胺、n,n』-二苄基乙二胺、2-羥基乙基胺、雙-(2-羥基乙基)胺、三-(2-羥基乙基)胺、普魯卡因、二苄基哌啶、去氫樅胺(dehydroabietylamine)、n,n』-去氫樅胺、二葡萄糖胺、n-甲基葡萄糖胺、三甲基吡啶、奎寧、喹啉，和鹼性胺基酸諸如賴氨酸和精氨酸。
不是藥學上可接受的其他鹽可用於製備本發明化合物，並且這些應被視為本發明的另一方面。這些鹽諸如草酸鹽或三氟乙酸鹽，儘管它們本身不是藥學上可接受的，但是可用於製備在獲得本發明化合物和它們的藥學上可接受的鹽時用作中間體的鹽。
式(i)化合物或其鹽可按立體異構形式存在(例如，其含有一個或多個不對稱碳原子)。單獨的立體異構體(對映異構體和非對映異構體)和這些異構體的混合物包括在本發明範圍內。同樣地，應理解式(i)的化合物或鹽可按不同於該式中所示的互變異構形式存在，並且這些也包括在本發明範圍內。應理解，本發明包括上文定義的具體組的所有組合和亞類。本發明的範圍包括立體異構體的混合物以及純化的對映異構體或對映異構體/非對映異構體富集的混合物。應理解，本發明包括上文定義的具體組的所有組合和亞類。
本發明還包括同位素標記的化合物，其除以下事實外與式(i)所述的那些化合物相同：一個或多個原子被原子質量或質量數不同於天然常見的原子質量或質量數的原子代替。可引入本發明化合物及其藥學上可接受的鹽中的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯和碘的同位素，諸如2h、3h、11c、13c、14c、15n、17o、18o、31p、32p、35s、18f、36cl、123i和125i。
含有上述同位素和/或其他原子的其他同位素的本發明的化合物和所述化合物的藥學上可接受的鹽在本發明範圍內。同位素標記的本發明的化合物，例如引入了放射性同位素諸如3h或14c的那些化合物，用於藥物和/或底物組織分布測定。氚代的即3h和碳-14即14c同位素由於其易於製備及可檢測性而是特別優選的。11c和18f同位素特別用於pet(正電子發射斷層掃描術)，以及125i同位素特別用於spect(單光子發射計算機斷層掃描)，所有這些都用於腦成像。此外，用較重的同位素諸如氘即2h取代可提供某些導致更大的代謝穩定性的治療益處，例如體內半衰期增加或劑量需求減小，由此在一些情況中是優選的。通常可通過進行下文的方案和/或實施例中披露的操作，通過用容易獲得的同位素標記的試劑代替非同位素標記的試劑來製備同位素標記的式(i)化合物和本發明的以下化合物。
本發明還提供了藥物組合物(也稱為藥物製劑)，其包含式(i)化合物或其藥學上可接受的鹽和一或多種賦形劑(在製藥領域也稱為載體和/或稀釋劑)。所述賦形劑在與該製劑的其他成分相容且對其接受者(即，患者)無毒方面是可接受的。
合適的藥學上可接受的賦形劑將根據所選具體的劑型而變化。此外，可根據在組合物中所起的具體功能來選擇合適的藥學上可接受的賦形劑。例如，可根據促進位備均一劑型的能力來選擇某些藥學上可接受的賦形劑。可根據促進位備穩定的劑型的能力來選擇某些藥學上可接受的賦形劑。可根據在給藥至患者後促進本發明化合物從身體的一個器官或部分攜帶或運輸至身體的另一器官或部分的能力來選擇某些藥學上可接受的賦形劑。某些藥學上可接受的賦形劑可根據其提高患者順應性的能力進行選擇。
合適的藥學上可接受的賦形劑包括下列賦形劑類型：稀釋劑、填充劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、粒化劑、包衣劑、潤溼劑、溶劑、共溶劑、助懸劑、乳化劑、增甜劑、矯味劑、掩味劑、著色劑、防結塊劑、保溼劑、螯合劑、增塑劑、增粘劑、抗氧化劑、防腐劑、穩定劑、表面活性劑和緩衝劑。本領域技術人員將理解，某些藥學上可接受的賦形劑可以以多於一種功能和以替代性功能來使用，取決於所述賦形劑在製劑中存在多少和在製劑中存在何種其它成分。
具有本領域的知識和技術的技術人員能夠選擇出以適當量用於本發明的合適的藥學上可接受的賦形劑。此外，有許多本領域技術人員可用的資源，這些資源描述了藥學上可接受的賦形劑且其可用於選擇合適的藥學上可接受的賦形劑。實例包括remington'spharmaceuticalsciences(mackpublishingcompany)，thehandbookofpharmaceuticaladditives(gowerpublishinglimited)，和thehandbookofpharmaceuticalexcipients(theamericanpharmaceuticalassociationandthepharmaceuticalpress)。
本發明的藥物組合物使用本領域技術熟練人員已知的技術和方法製備。通常用於本領域的一些方法描述在remington'spharmaceuticalsciences(mackpublishingcompany)中。
藥物組合物可為每個劑量單位含有預定量的活性成分的單位劑量形式。所述單位可含有治療有效劑量的式(i)化合物或其鹽，或一定比例的治療有效劑量的式(i)化合物或其鹽，從而在給定的時間可給予多個單位劑量形式以達到期望的治療有效劑量。優選的單位劑量製劑是本申請上文所述的含有活性成分的每日劑量或亞劑量或其適當的比例的那些。此外，所述藥物組合物可通過藥學領域熟知的任何方法製備。
藥物組合物可適應於通過任何適當的途徑給藥，例如，經口服(包括口腔或舌下)、直腸、鼻、局部(包括口腔、舌下或經皮)、陰道或胃腸外(包括皮下、肌內、靜脈內或皮內)途徑給藥。所述組合物可通過藥學領域已知的任何方法製備，例如，通過使活性成分與一種或多種賦形劑結合。
當適應於口服給藥時，藥物組合物可為離散單位諸如片劑或膠囊劑、粉末或顆粒、於水性或非水性液體中的溶液或懸浮液、可食用泡沫或攪打劑(whip)，或水包油型液體乳液或油包水型乳液。本發明的化合物或其鹽或本發明的藥物組合物也可被摻入到糖果、薄片劑(wafer)和/或條型(tonguetape)製劑中，用於作為「快速溶解」的藥物給藥。
例如，就以片劑或膠囊劑形式進行的口服給藥而言，可將活性藥物組分與口服的無毒的藥學上可接受的惰性載體如乙醇、甘油、水等混合。粉末劑或顆粒劑如下製備：將化合物研磨至合適的微細尺寸，然後與經類似研磨的藥物載體如可食用的碳水化合物(如澱粉或甘露醇)混合。也可存在矯味劑、防腐劑、分散劑和著色劑。
膠囊劑如下製備：如上所述製備粉末混合物，然後填充到成形的明膠或非明膠殼中。可將助流劑和潤滑劑如膠體二氧化矽、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或固體聚乙二醇加到粉末混合物中，然後進行填充操作。也可加入崩解劑或增溶劑如瓊脂、碳酸鈣或碳酸鈉以改善膠囊劑被攝入時的藥物利用度。
此外，當期望或需要時，也可將合適的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑摻到混合物中。合適的粘合劑包括澱粉、明膠、天然糖(如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味劑、天然膠和合成膠如阿拉伯膠、西黃蓍膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇、蠟等。在這些劑型中使用的潤滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括但不限於澱粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠等。
片劑如下配製：例如製備粉末混合物，制粒或預壓片，加入潤滑劑和崩解劑，然後壓製成片劑。粉末混合物如下製備：將經合適研磨的化合物與上述稀釋劑或基質以及任選的粘合劑(如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、凝膠或聚乙烯吡咯烷酮)、溶液延遲劑(solutionretardant)(如石蠟)、吸收促進劑(如季胺鹽)和/或吸收劑(如膨潤土、高嶺土或磷酸二鈣)混合。粉末混合物可如下制粒：潤溼粘合劑如糖漿、澱粉糊、阿拉伯膠液、纖維素溶液或聚合物溶液，然後擠壓過篩。作為可選擇的制粒方法，粉末混合物可通過壓片機來處理，導致不完全成形的預壓片破裂成顆粒。可通過加入硬脂酸、硬脂酸鹽、滑石或礦物油的方式來對顆粒進行潤滑以防止與片劑成形模粘連。然後將經潤滑的混合物壓製成片劑。本發明的化合物或鹽也可與自由流動的惰性載體組合，並在不經歷制粒或預壓片步驟的情況下直接壓製成片劑。可提供透明的或不透明的保護性包衣，所述包衣由以下包衣層構成：由蟲膠形成的隔離包衣層、由糖或聚合物形成的包衣層和由蠟形成的光亮包衣層。可將染料加到這些包衣中以區分不同的劑量。
口服流體如溶液劑、糖漿劑和酏劑可按劑量單位形式來製備，從而使給定的量含有預定量的活性成分物。糖漿劑可通過將本發明的化合物或其鹽溶於經合適矯味的水溶液中來製備，而酏劑通過使用無毒的含醇媒介物來製備。懸浮劑可通過將本發明的化合物或其鹽分散在無毒的媒介物中來製備。也可加入增溶劑和乳化劑(如乙氧基化的異硬脂醇和聚氧乙烯山梨醇醚)、防腐劑、矯味添加劑(如薄荷油、天然甜味劑、糖精或其它人造甜味劑)等。
當適當時，可對用於口服給藥的劑量單位製劑進行微囊化。也可例如通過將顆粒物質包衣或包埋到聚合物、蠟等中來製備製劑以延長或維持釋放。
在本發明中，對於遞送藥物組合物而言，片劑和膠囊劑是優選的。
根據本發明的另一方面，提供了製備藥物組合物的方法，其包括將式(i)化合物或其鹽與至少一種賦形劑混合(或摻合)。
本發明還提供了在哺乳動物，尤其是人中的治療方法。本發明的化合物和組合物用於治療細胞增殖性疾病。可通過本文提供的方法和組合物得到治療的疾病包括，但不限於，癌症(下文進一步討論)、自身免疫性疾病、真菌病症、關節炎、移植排斥、炎性腸病、醫療程序(medicalprocedure)後誘導的增殖，所述醫療程序包括，但不限於，手術、血管成形術等。應理解，在一些情況下，細胞可能並不在高增殖或低增殖狀態(異常狀態)但仍需要進行治療。例如，在傷口癒合過程中，儘管細胞可能是「正常」增殖的，但仍可能需要增殖強化。因此，在一個實施方案中，本發明包括施用至患有或即將患有任一這些疾病或病症的細胞或個體。
本文提供的組合物和方法尤其被認為是用於治療癌症，包括腫瘤，例如前列腺癌、乳腺癌、腦癌、皮膚癌、宮頸癌、睪丸癌等。它們尤其用於治療轉移性或惡性腫瘤。更具體地，可通過本發明的組合物和方法得到治療的癌症包括，但不限於以下腫瘤類型，例如星形細胞癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、肝細胞癌、喉癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、前列腺癌和甲狀腺癌和肉瘤。更具體地，這些化合物可用於治療：心臟：肉瘤(血管肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、橫紋肌瘤、纖維瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺：支氣管癌(鱗狀上皮細胞癌、未分化小細胞癌、未分化大細胞癌、腺癌)、肺泡(細支氣管)癌、支氣管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、軟骨錯構瘤、間皮瘤；胃腸道：食道(鱗狀上皮細胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(導管腺癌、胰島瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、類癌瘤、舒血管腸肽瘤(vipoma))、小腸(腺癌、淋巴瘤、類癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神經纖維瘤、纖維瘤)、大腸(腺癌、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、錯構瘤、平滑肌瘤)；泌尿生殖道：腎(腺癌、威爾姆斯腫瘤(wilm'stumor)(腎胚細胞瘤)、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(鱗狀上皮細胞癌、移行細胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睪丸(精原細胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、絨毛膜癌、肉瘤、間質細胞癌、纖維瘤、纖維腺瘤、腺瘤樣瘤、脂肪瘤)；肝：肝癌(肝細胞癌)、膽管癌、肝母細胞瘤、血管肉瘤、肝細胞性腺瘤、血管瘤；膽道：膽囊癌、壺腹癌、膽管癌；骨：成骨性肉瘤(骨肉瘤)、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、軟骨肉瘤、尤因肉瘤、惡性淋巴瘤(網狀細胞肉瘤)、多發性骨髓瘤、惡性巨細胞瘤脊索瘤、骨軟骨瘤(骨軟骨外生骨疣(osteocartilaginousexostose))、良性軟骨瘤、軟骨母細胞瘤、軟骨粘液纖維瘤(chondromyxofibroma)、骨樣骨瘤和巨細胞瘤；神經系統：頭骨(骨瘤、血管瘤、肉芽腫、黃色瘤、畸形性骨炎)、腦膜(腦膜瘤、腦膜肉瘤(meningiosarcoma)、神經膠質瘤病)、腦(星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、神經膠質瘤、室管膜瘤、生殖細胞瘤(松果體瘤)、多形性成膠質細胞瘤、少突神經膠質瘤(oligodendroglioma)、神經鞘瘤、視網膜母細胞瘤、先天性腫瘤)、脊髓神經纖維瘤、腦膜瘤、神經膠質瘤、肉瘤)；婦科：子宮(子宮內膜癌)、宮頸(宮頸癌、腫瘤前宮頸病變(pre-tumorcervicaldysplasia))、卵巢(卵巢癌(漿液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分類癌(unclassifiedcarcinoma))、顆膜細胞瘤(granulosa-thecalcelltumor)、塞-萊細胞瘤(sertoli-leydigcelltumor)、無性細胞瘤、惡性畸胎瘤)、外陰(鱗狀上皮細胞癌、上皮內癌、腺癌、纖維肉瘤、黑色素瘤)、陰道(透明細胞癌、鱗狀上皮細胞癌、葡萄狀肉瘤(胚胎性橫紋肌肉瘤)、輸卵管癌)；血液方面：血液(髓細胞性白血病(急性和慢性)、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、骨髓增生性疾病、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常症候群(myelodysplasticsyndrome))、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惡性淋巴瘤)；皮膚：惡性黑色素瘤、基底細胞癌、鱗狀上皮細胞癌、卡波西肉瘤、發育不良痣(molesdysplasticnevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤、瘢痕瘤、牛皮癬；和腎上腺：神經母細胞瘤。因此，本文所述術語「癌細胞」包括患有任一上述病症或相關病症的細胞。
本發明化合物可與其他治療劑，尤其是可提高化合物活性及體內處置時間的藥劑組合或共同給藥。本發明的組合療法包括施用至少一種本發明化合物並使用至少一種其他治療方法。在一個實施方案中，本發明的組合療法包括施用至少一種本發明化合物和手術治療。在一個實施方案中，本發明的組合療法包括施用至少一種本發明化合物和放射療法。在一個實施方案中，本發明的組合療法包括施用至少一種本發明化合物和至少一種支持療法藥物(例如，至少一種鎮吐藥)。在一個實施方案中，本發明的組合療法包括施用至少一種本發明化合物和至少一種其他化療劑。在一個具體實施方案中，本發明包括施用至少一種本發明化合物和至少一種抗腫瘤藥。在另一實施方案中，本發明包括治療方案，其中本公開的ezh2抑制劑本身並沒有活性或並沒有顯著活性，但是當其與另一療法組合時(所述另一療法作為單獨療法時可以是有活性的或無活性的)，該組合提供有用的治療效果。
本文所用的術語「共同給藥」及其衍生詞語是指同時給藥或以任意單獨的方式相繼給藥本文所述的ezh2抑制化合物和已知用於治療癌症(包括化療和放射治療)的一種或多種其他活性成分。當向有治療癌症需要的患者給藥時，本文所用術語一種或多種活性成分還包括已知的或被證明有有益性質的任意化合物或治療劑。優選地，如果所述給藥不是同時的，那麼該化合物以彼此極接近的時間進行給藥。此外，所述化合物是否以同一劑型施用並不重要，例如一種化合物可局部給藥而另一化合物可口服給藥。
通常，在治療本發明中指定的癌症時，可以共同給藥對待治療的敏感腫瘤具有活性的任何抗腫瘤藥物。該藥物的實例參考v.t.devita和s.hellman(主編)的cancerprinciplesandpracticeofoncology，第6版(2001年2月15日)，lippincottwilliams&wilkinspublishers。本領域一般技術人員將能夠根據藥物的具體特徵和所涉及癌症辨別藥物的何種組合將是有用的。可用於本發明的典型抗腫瘤藥物包括，但不限於，抗微管劑例如二萜類化合物和長春花生物鹼；鉑配位絡合物；烷基化劑例如氮芥、氧氮磷雜環己二烯(oxazaphosphorine)、烷基磺酸鹽、亞硝基脲和三氮烯；抗生素例如蒽環類、放線菌素和博萊黴素；拓撲異構酶ii抑制劑例如表鬼臼毒素；抗代謝劑例如嘌呤和嘧啶類似物和抗葉酸化合物；拓撲異構酶i抑制劑例如喜樹鹼；激素和激素類似物；dna甲基轉移酶抑制劑例如阿扎胞苷和地西他濱；信號轉導途徑抑制劑；非受體酪氨酸激酶血管生成抑制劑；免疫治療劑；促細胞凋亡劑；以及細胞周期信號轉導抑制劑。
通常，對所治療的易感腫瘤具有活性的任意化學治療劑可與本發明化合物組合使用，條件是該具體藥物與採用本發明化合物的療法在臨床上兼容。用於本發明的典型抗腫瘤劑包括，但不限於：烷化劑、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素、抗有絲分裂藥、核苷類似物、拓撲異構酶i和ii抑制劑、激素和激素類似物；維甲酸，組蛋白脫乙醯基酶抑制劑；信號轉導通路抑制劑，包括細胞生長或生長因子功能的抑制劑、血管生成抑制劑和絲氨酸/蘇氨酸或其他激酶抑制劑；細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑；反義療法和免疫治療劑，包括單克隆抗體、疫苗或其他生物製劑。
核苷類似物是指轉化成三磷酸脫氧核苷酸並代替胞嘧啶併入到複製的dna中的化合物。dna甲基轉移酶共價地連接至該修飾的鹼基上，導致酶失活以及降低的dna甲基化。核苷類似物的實例包括阿扎胞苷和地西他濱，它們都用於治療骨髓增生異常疾病。組蛋白脫乙醯基酶(hdac)抑制劑包括伏立諾他，其用於治療皮膚t細胞淋巴瘤。hdac通過組蛋白脫乙醯基作用來修飾染色質。此外，它們具有各種作用底物，包括各種轉錄因子和信號分子。其他hdac抑制劑正在研發。
信號轉導通路抑制劑是阻斷或抑制化學過程的那些抑制劑，所述化學過程引起細胞內變化。如本文所用，這一變化是細胞增殖或分化或存活。用於本發明的信號轉導通路抑制劑包括，但不限於，受體酪氨酸激酶、非受體酪氨酸激酶、sh2/sh3結構域阻斷劑、絲氨酸/蘇氨酸激酶、磷脂醯肌醇-3-oh激酶、肌醇信號傳導和ras癌基因的抑制劑。信號轉導通路抑制劑可與上述組合物和方法中的本發明化合物組合使用。
受體激酶血管生成抑制劑也可用於本發明中。涉及vegfr和tie-2的血管生成抑制劑在上述針對信號傳導抑制劑(兩者都是受體酪氨酸激酶)中進行討論。其他抑制劑可與本發明化合物組合使用。例如，抗vegf抗體，其不識別vegfr(受體酪氨酸激酶)，但結合至該配體；整聯蛋白(αvβ3)的小分子抑制劑，其抑制血管生成；內皮他丁和血管他丁(非-rtk)也可被證明用於與本發明化合物組合。vegfr抗體的一個實例是貝伐單抗
生長因子受體的多種抑制劑正在研發且包括配體拮抗劑、抗體、酪氨酸激酶抑制劑、反義寡核苷酸和適體。任意這些生長因子受體抑制劑可與本發明化合物組合用於本文所述的任意組合物和方法/用途中。曲妥珠單抗是生長因子功能的抗-erbb2抗體抑制劑的實例。生長因子功能的抗-erbb2抗體抑制劑的實例是西妥昔單抗(erbituxtm，c225)。貝伐單抗是直接針對vegfr的單克隆抗體的實例。表皮生長因子受體的小分子抑制劑的實例包括但不限於拉帕替尼和厄洛替尼甲磺酸伊馬替尼是pdgfr抑制劑的一個實例。vegfr抑制劑的實例包括帕唑帕尼zd6474、azd2171、ptk787、舒尼替尼和索拉非尼。
抗微管或抗有絲分裂劑是時相特異性藥物(phasespecificagent)，其在細胞周期中的m期或有絲分裂期對腫瘤細胞的微管具有活性。抗微管劑的實例包括但不限於二萜類化合物(diterpenoid)和長春花生物鹼(vincaalkaloid)。
天然來源的二萜類化合物是時相特異性的抗癌劑，其在細胞周期中的g2/m期起作用。認為二萜類化合物通過與該蛋白結合，使微管的β-微管蛋白亞單位穩定。然後使蛋白的分解受到抑制，有絲分裂停止，接著發生細胞死亡。二萜類化合物的實例包括但不限於紫杉醇及其類似物多西他賽。
紫杉醇，5β,20-環氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羥基紫杉-11-烯-9-酮4,10-二乙酸酯2-苯甲酸酯13-(2r,3s)-n-苯甲醯基-3-苯基異絲氨酸酯(5β,20-epoxy-1,2α,4,7β,10β,13α-hexa-hydroxytax-11-en-9-one4,10-diacetate2-benzoate13-esterwith(2r,3s)-n-benzoyl-3-phenylisoserine)，其是從太平洋紫杉樹(taxusbrevifolia)中分離出來的天然二萜產物，且作為可注射的溶液市售。其為萜類紫杉烷家族的成員。其在1971年由wani等人首次分離出來(j.am.chem，soc.,93：2325,1971)，並通過化學和x-射線結晶學方法表徵其結構。其活性的機理之一是關於紫杉醇能結合微管蛋白，進而抑制癌細胞生長。schiff等,proc.natl,acad,sci.usa,77：1561-1565(1980)；schiff等,nature,277：665-667(1979)；kumar,j.biol,chem,256：10435-10441(1981)。有關一些紫杉醇衍生物的合成和抗癌活性的綜述，參見d.g.i.kingston等,studiesinoranicchemistry第26卷,標題為「newtrendsinnaturalproductschemistry1986」,attaur-rahman,p.w.lequesne編輯(elsevier,amsterdam,1986)第219-235頁。
在美國，已經批准紫杉醇的臨床使用，用於治療難治的卵巢癌(markman等,yalejournalofbiologyandmedicine,64：583,1991；mcguire等,ann.int.,med.,111：273,1989)和用於治療乳腺癌(holmes等,j.nat.cancerinst.,83：1797,1991)。其為治療皮膚癌(einzig等,proc.am.soc.clin.oncol.,20：46)和頭頸癌(forastire等,sem.oncol.,20：56,1990)的可能的候選藥物。該化合物還具有治療多囊性腎病(woo等,nature,368：750,1994)、肺癌和瘧疾的潛力。採用紫杉醇治療患者，導致骨髓抑制(多重細胞譜系(multiplecelllineage),ignoff,r.j.等,cancerchemotherapypocketguide,1998)，這與高於閾濃度(50nm)的給藥的持續時間有關(kearns,c.m.等,seminarsinoncology,3(6)p.16-23,1995)。
多西他賽(docetaxel)，5β-20-環氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羥基紫杉-11-烯-9-酮4-乙酸酯2-苯甲酸酯13-(2r,3s)-n-羧基-3-苯基異絲氨酸n-叔丁基酯，三水合物，作為可注射的溶液市售。多西他賽可用於治療乳腺癌。多西他賽是適量(q.v.)紫杉醇的半合成衍生物，其利用天然前體即從歐洲漿果紫杉樹的針葉中提取的10-去乙醯基漿果赤黴素iii製備。多西他賽的劑量限制性毒性是嗜中性白細胞減少症。
長春花生物鹼(vincaalkaloids)是來源於長春花屬植物的時相特異性的抗腫瘤藥物。長春花生物鹼通過特異性地結合微管蛋白而在細胞周期的m期(有絲分裂)起作用。因此，被結合的微管蛋白分子不能聚合成微管。認為有絲分裂在中期被停止，隨後細胞死亡。長春花生物鹼的實例包括但不限於長春鹼，長春新鹼和長春瑞濱。
長春鹼(vinblastine)，長春鹼硫酸鹽，以注射液市售。儘管已經表明其有可能作為各種實體瘤的二線治療，但是其最初表明用於治療睪丸癌和各種淋巴瘤，包括霍奇金病以及淋巴細胞和組織細胞的淋巴瘤。骨髓抑制是長春鹼的劑量限制性副作用。
長春新鹼(vincristine)，長春鹼22-氧代-硫酸鹽，以注射溶液市售。長春新鹼顯示用於治療急性白血病，還發現用於治療霍奇金和非霍奇金惡性淋巴瘤。脫髮和神經作用是長春新鹼最常見的副作用，並產生較小程度的骨髓抑制和胃腸黏膜炎作用。
長春瑞濱(vinorelbine)，3',4'-二脫氫-4'-脫氧-c'-去甲長春鹼(norvincaleukoblastine)[r-(r*,r*)-2,3-二羥基丁二酸二酯(1：2)(鹽)]，以長春瑞濱酒石酸鹽注射溶液市售，是半合成的長春花生物鹼。長春瑞濱可作為單獨的藥物或與其它化學治療劑(如順鉑)組合，用於治療各種實體瘤，特別是非小細胞肺癌、晚期乳腺癌和激素難治的前列腺癌。骨髓抑制是長春瑞濱最常見的劑量限制性副作用。
鉑配位絡合物(platinumcoordinationcomplex)是非時相特異性的抗癌劑，其與dna相互作用。鉑絡合物進入腫瘤細胞，進行水合作用，並與dna形成鏈內部和之間的交聯，導致對腫瘤不利的生物學作用。鉑配位絡合物的實例包括但不限於順鉑和卡鉑。
順鉑，順式-二氨二氯合鉑，以注射溶液市售。順鉑最初用於治療轉移性睪丸癌和卵巢癌以及晚期的膀胱癌。順鉑的主要劑量限制性副作用是腎毒性和耳毒性，所述腎毒性可通過水合和利尿來控制。
卡鉑，二氨[1,1-環丁烷-二羧酸根(2-)-o,o']合鉑，以注射溶液市售。卡鉑最初用於晚期卵巢癌的一線和二線治療。骨髓抑制是卡鉑的劑量限制性毒性。
烷化劑是非時相特異性的抗癌藥物和強親電試劑。通常，烷化劑藉助於烷基化作用，通過dna分子的親核部分如磷酸基(phosphate)、氨基、巰基、羥基、羧基和咪唑基，與dna形成共價鍵。這種烷基化作用破壞核酸功能，導致細胞死亡。烷化劑的實例包括但不限於氮芥(如環磷醯胺、美法侖和苯丁酸氮芥)、磺酸烷基酯(如白消安、亞硝基脲如卡莫司汀)，以及三氮烯(如達卡巴嗪)。
環磷醯胺(cyclophosphamide)，2-[雙(2-氯乙基)氨基]四氫-2h-1,3,2-氧氮磷雜環己二烯2-氧化物一水合物(2-[bis(2-chloroethyl)amino]tetrahydro-2h-1,3,2-oxazaphosphorine2-oxidemonohydrate)，以注射溶液或片劑市售。環磷醯胺可作為單獨的藥物或與其它化學治療劑組合，用於治療惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤和白血病。脫髮、噁心、嘔吐和白細胞減少症是環磷醯胺最常見的劑量限制性副作用。
美法侖(melphalan)，4-[雙(2-氯乙基)氨基]-l-苯基丙氨酸(4-[bis(2-chloroethyl)amino]-l-phenylalanine)，以注射溶液或片劑市售。美法侖可用於多發性骨髓瘤和不可切除的卵巢上皮癌的姑息療法。骨髓抑制是美法侖最常見的劑量限制性副作用。
苯丁酸氮芥(chlorambucil)，4-[雙(2-氯乙基)氨基]苯丁酸(4-[bis(2-chloroethyl)amino]benzenebutanoicacid)，以片劑市售。苯丁酸氮芥可用於慢性淋巴細胞性白血病，惡性淋巴瘤(如淋巴肉瘤、巨濾泡性淋巴瘤和霍奇金病)的姑息療法。骨髓抑制是苯丁酸氮芥最常見的劑量限制性副作用。
白消安(busulfan)，1,4-丁二醇二甲磺酸酯(1,4-butanedioldimethanesulfonate)，以片劑市售。白消安用於慢性髓細胞性白血病的姑息療法。骨髓抑制是白消安最常見的劑量限制性副作用。
卡莫司汀(carmustine)，1,3-[雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲(1,3-[bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea)，以單瓶裝的凍乾產物市售。卡莫司汀可作為單獨的藥物或與其它藥物組合，用於腦瘤、多發性骨髓瘤、霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤的姑息療法。延遲的骨髓抑制是卡莫司汀最常見的劑量限制性副作用。
達卡巴嗪(dacarbazine)，5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)-咪唑-4-甲醯胺(5-(3,3-dimethyl-1-triazeno)-imidazole-4-carboxamide)，以dtic-單瓶裝的產物市售。達卡巴嗪可用於轉移性惡性黑素瘤的治療，並且可與其它藥物組合，用於霍奇金病的二線治療。噁心、嘔吐和厭食是達卡巴嗪最常見的劑量限制性副作用。
抗生素類抗癌劑(antibioticanti-neoplastics)是非時相特異性的藥物，其結合或嵌入dna中。通常，這種作用導致穩定的dna複合物或鏈斷裂，破壞核酸的正常功能，導致細胞死亡。抗生素類抗腫瘤藥物的實例包括但不限於放線菌素(如放線菌素d)；蒽環類(anthrocyclins)(如柔紅黴素和多柔比星)；以及博來黴素。
放線菌素d(dactinomycin，也稱為actinomycind)，以注射液形式市售。放線菌素d可用於威爾姆斯腫瘤和橫紋肌肉瘤的治療。噁心、嘔吐和厭食是放線菌素d最常見的劑量限制性副作用。
柔紅黴素(daunorubicin)，(8s-順式-)-8-乙醯基-10-[(3-氨基-2,3,6-三脫氧基α-l-來蘇-己吡喃糖基)-氧基]-7,8,9,10-四氫-6,8,11-三羥基-1-甲氧基-5,12-並四苯二酮鹽酸鹽，以脂質體可注射形式或可注射形式市售。柔紅黴素可在急性非淋巴細胞性白血病和晚期hiv相關的卡波西肉瘤的治療中用於誘導緩解。骨髓抑制是柔紅黴素最常見的劑量限制性副作用。
多柔比星(doxorubicin)，(8s,10s)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脫氧-α-l-來蘇-己吡喃糖基)氧基]-8-乙醇醯基-7,8,9,10-四氫-6,8,11-三羥基-1-甲氧基-5,12-並四苯二酮鹽酸鹽((8s,10s)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-α-l-lyxo-hexopyranosyl)oxy]-8-glycoloyl,7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-1-methoxy-5,12naphthacenedionehydrochloride)，以或adriamycin注射溶液市售。多柔比星主要用於急性成淋巴細胞性白血病和急性成髓細胞性白血病的治療，但也是治療某些實體瘤和淋巴瘤的有用組分。骨髓抑制是多柔比星最常見的劑量限制性副作用。
博來黴素(bleomycin)，是從輪絲鏈黴菌(streptomycesverticilus)菌株中分離出來的細胞毒素糖肽類抗生素的混合物，以市售。博來黴素可作為單獨的藥物或與其它藥物組合，用於鱗狀細胞癌、淋巴瘤和睪丸癌的姑息療法。肺部和皮膚毒性是博來黴素最常見的劑量限制性副作用。
拓撲異構酶ii抑制劑包括但不限於表鬼臼脂毒素。
表鬼臼脂毒素(epipodophyllotoxins)是來源於曼德拉草(mandrake)植物的時相特異性的抗腫瘤藥物。表鬼臼脂毒素通常通過與拓撲異構酶ii和dna形成三元複合物，導致dna鏈斷裂來影響處於細胞周期的s和g2期的細胞。鏈斷裂積聚，接著細胞死亡。表鬼臼脂毒素的實例包括但不限於依託泊苷和替尼泊苷。
依託泊苷(etoposide)，4'-去甲基-表鬼臼脂毒素9[4,6-0-(r)-亞乙基-β-d-吡喃葡萄糖苷]，以注射溶液或膠囊市售，並且常稱之為vp-16。依託泊苷可作為單獨的藥物或與其它化療劑組合，用於治療睪丸癌和非小細胞肺癌。骨髓抑制是依託泊苷最常見的副作用。白細胞減少症的發生率(incidence)傾向於比血小板減少症的發生率更嚴重。
替尼泊苷(teniposide)，4'-去甲基-表鬼臼脂毒素9[4,6-0-(r)-噻吩亞甲基-β-d-吡喃葡萄糖苷]，以注射溶液市售，並且通常稱之為vm-26。替尼泊苷可作為單獨的藥物或與其它化療劑組合，用於治療兒童急性白血病。骨髓抑制是替尼泊苷最常見的劑量限制性副作用。替尼泊苷可引起白細胞減少症和血小板減少症。
抗代謝腫瘤藥物(antimetaboliteneoplasti)是時相特異性的抗腫瘤藥物，其作用於細胞周期的s期(dna合成)，通過抑制dna的合成，或者通過抑制嘌呤或嘧啶鹼基的合成進而限制dna的合成。因此，s期不能繼續下去，接著細胞死亡。抗代謝類抗腫瘤藥物的實例包括但不限於氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤，以及吉西他濱(fluorouracil,methotrexate,cytarabine,mecaptopurine,thioguanine,andgemcitabine)。
5-氟尿嘧啶，5-氟-2,4-(1h,3h)嘧啶二酮，以氟尿嘧啶市售。5-氟尿嘧啶的給藥導致胸苷酸合成的抑制，並且還摻入到rna和dna中。結果通常是細胞死亡。5-氟尿嘧啶可作為單獨的藥物或與其它化療劑組合，用於治療乳腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌和胰腺癌。骨髓抑制和黏膜炎是5-氟尿嘧啶的劑量限制性副作用。其它的氟嘧啶類似物包括5-氟脫氧尿嘧啶核苷(氟尿苷)和5-氟脫氧尿嘧啶核苷一磷酸。
阿糖胞苷(cytarabine)，4-氨基-1-β-d-阿拉伯呋喃糖基-2(1h)-嘧啶酮(4-amino-1-β-d-arabinofuranosyl-2(1h)-pyrimidinone)，以cytosar-市售，並且通常稱之為ara-c。認為阿糖胞苷在s-期具有細胞時相特異性，其通過將阿糖胞苷末端摻入到生長的dna鏈中而抑制dna鏈的延長。阿糖胞苷作為單獨的藥物或與其它化療劑組合，用於治療急性白血病。其它的胞苷類似物包括5-氮雜胞苷和2',2'-二氟脫氧胞苷(吉西他濱)。阿糖胞苷引起白細胞減少症、血小板減少症和黏膜炎。
巰基嘌呤，1,7-二氫-6h-嘌呤-6-硫酮一水合物(1,7-dihydro-6h-purine-6-thionemonohydrate)，以嘌呤市售。巰基嘌呤在s-期通過至今尚未清楚的機理抑制dna的合成具有細胞時相特異性。巰基嘌呤可作為單獨的藥物或與其它化療劑組合，用於治療急性白血病。預期骨髓抑制和胃腸黏膜炎是高劑量巰基嘌呤的副作用。可使用的巰基嘌呤類似物是硫唑嘌呤。
硫鳥嘌呤(thioguanine)，2-氨基-1,7-二氫-6h-嘌呤-6-硫酮(2-amino-1,7-dihydro-6h-purine-6-thione)，以市售。硫鳥嘌呤在s-期通過至今尚未清楚的機理抑制dna的合成具有細胞時相特異性。硫鳥嘌呤可作為單獨的藥物或與其它化療劑組合，用於治療急性白血病。骨髓抑制，包括白細胞減少症、血小板減少症和貧血是給藥硫鳥嘌呤最常見的劑量限制性副作用。然而，還發生胃腸副作用，而且該副作用可能是劑量限制性的。其它的嘌呤類似物包括噴司他丁、赤式羥基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine)、磷酸氟達拉濱和克拉屈濱。
吉西他濱(gemcitabine)，2'-脫氧-2',2'-二氟胞苷一鹽酸鹽(β-異構體)，以市售。吉西他濱通過阻斷細胞通過g1/s邊界的發展在s-期具有細胞時相特異性。吉西他濱可與順鉑組合，用於治療局部的晚期非小細胞肺癌，也可以單獨地用於治療局部的晚期胰腺癌。骨髓抑制(包括白細胞減少症、血小板減少症和貧血)是給藥吉西他濱最常見的劑量限制性副作用。
甲氨蝶呤，n-[4[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲基氨基]苯甲醯基]-l-穀氨酸，以甲氨蝶呤鈉市售。甲氨蝶呤在s-期具有細胞時相特異性作用，其通過抑制合成嘌呤核苷酸和胸苷酸所需的脫氫葉酸還原酶來抑制dna的合成、修復和/或複製。甲氨蝶呤可作為單獨的藥物或與其它化療劑組合，用於治療絨毛膜癌、腦膜白血病、非霍奇金淋巴瘤，以及乳腺癌、頭癌、頸癌、卵巢癌和膀胱癌。預期骨髓抑制(白細胞減少症、血小板減少症和貧血)和黏膜炎是給藥甲氨蝶呤的副作用。
喜樹鹼(camptothecins)，包括喜樹鹼和喜樹鹼衍生物，其可作為拓撲異構酶i抑制劑來使用或開發。認為喜樹鹼細胞毒素活性與其拓撲異構酶i抑制活性相關。喜樹鹼的實例包括但不限於伊立替康、託泊替康，以及下述7-(4-甲基哌嗪基-亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20-喜樹鹼的各種旋光體。
鹽酸伊立替康(irinotecanhcl)，(4s)-4,11-二乙基-4-羥基-9-[(4-哌啶子基哌啶子基)羰基氧基]-1h-吡喃並[3',4',6,7]中氮茚並[1,2-b]喹啉-3,14(4h,12h)-二酮鹽酸鹽，以注射溶液市售。
伊立替康(irinotecan)是喜樹鹼的衍生物，其與其活性代謝物sn-38一起結合在拓撲異構酶i-dna複合物上。認為由於雙鏈不可修復的(irreparable)斷裂，導致出現細胞毒性，所述斷裂是由拓撲異構酶i：dna：伊立替康或sn-38三元複合物與複製酶之間的相互作用引起的。伊立替康可用於治療結腸或直腸的轉移癌。鹽酸伊立替康的劑量限制性副作用是骨髓抑制，包括嗜中性白細胞減少症，以及包括腹瀉的gi效應。
鹽酸託泊替康(topotecanhcl)，(s)-10-[(二甲基氨基)甲基]-4-乙基-4,9-二羥基-1h-吡喃並[3',4',6,7]中氮茚並[1,2-b]喹啉-3,14-(4h,12h)-二酮一鹽酸鹽((s)-10-[(dimethylamino)methyl]-4-ethyl-4,9-dihydroxy-1h-pyrano[3』,4』,6,7]indolizino[1,2-b]quinoline-3,14-(4h,12h)-dionemonohydrochloride)，以注射溶液市售。託泊替康是喜樹鹼的衍生物，其與拓撲異構酶i-dna複合物結合，並阻止單鏈斷裂的再連接，所述單鏈斷裂是拓撲異構酶i響應dna分子的扭轉張力(torsionalstrain)所引起的。託泊替康用於卵巢轉移癌和小細胞肺癌的二線治療。鹽酸託泊替康的劑量限制性副作用是骨髓抑制，主要是嗜中性白細胞減少症。
本文提供了治療或預防自身免疫性和炎性病症和疾病的方法，所述病症和疾病可通過抑制ezh1和/或ezh2而改善，從而，例如，調節甲基化活化和甲基化抑制的靶基因的表達水平或調節信號蛋白的活性。一種方法可以包括向人，例如有此需要的人給藥治療有效量的本文所述藥劑。
炎症代表針對創傷的一組血管、細胞和神經系統反應。炎症可以表徵為炎性細胞如單核細胞、嗜中性粒細胞和粒細胞進入組織的運動。這通常與減少的內皮屏障功能和水腫進入組織有關。炎症可分為急性或慢性。急性炎症是身體對有害刺激的初始反應，並且是通過血漿和白細胞從血液向損傷組織的運動增加而實現的。生物化學事件的級聯傳播和使炎症反應成熟，涉及局部血管系統、免疫系統和損傷組織內的各種細胞。被稱為慢性炎症的長期炎症導致存在於炎症部位的細胞類型的逐漸變化，且其特徵在於炎症過程中組織的同時破壞和癒合。
當發生作為對感染的免疫應答的一部分或作為對創傷的急性反應時，炎症可以是有益的並且通常是自限性的。然而，炎症在不同條件下可能是有害的。這包括響應於感染因子產生過度炎症，其可導致顯著的器官損傷和死亡(例如，在敗血症的情況中)。此外，慢性炎症通常是有害的，並且是許多慢性疾病的根源，對組織造成嚴重的和不可逆的損害。在這種情況下，免疫應答通常針對自身組織(自身免疫)，儘管對外來實體的慢性反應也可能導致對自身組織的旁觀者損傷(bystanderdamage)。
因此，抗炎治療的目的是減少這種炎症，當存在時抑制自身免疫並允許生理過程或癒合和組織修復進展。
這些藥劑可用於治療身體的任何組織和器官的炎症，包括肌肉骨骼炎症、血管炎症、神經炎症、消化系統炎症、眼部炎症、生殖系統的炎症和其它炎症，如下所示。
肌肉骨骼炎症是指肌肉骨骼系統的任何炎症病症，特別是影響骨骼關節，包括手、手腕、肘部、肩部、頜、脊柱、頸部、髖部、膝蓋、腳踝和腳部的關節的那些病症以及影響連接肌肉與骨骼的組織(例如腱)的病症。可用本發明化合物治療的肌肉骨骼炎症的實例包括關節炎(包括例如，骨關節炎、牛皮癬關節炎、強直性脊柱炎、急性和慢性感染性關節炎、與痛風和假性關節炎相關的關節炎和幼年特發性關節炎)、肌腱炎、滑膜炎、腱鞘炎、滑囊炎、纖維組織炎(纖維肌痛)、上髁炎、肌炎和骨炎(包括，例如，佩吉特氏病、恥骨骨炎和纖維性骨炎)。
眼部炎症是指眼睛任何結構的炎症，包括眼瞼。可以在本發明中治療的眼部炎症的實例包括眼瞼炎、眼瞼皮膚鬆弛症、結膜炎、淚腺炎、角膜炎、乾燥性角結膜炎(乾眼症)、鞏膜炎、倒睫症和葡萄膜炎。
可以在本發明中治療的神經系統的炎症的實例包括腦炎、格-巴二氏症候群、腦膜炎、神經性肌強直、發作性睡病、多發性硬化、脊髓炎和精神分裂症。
可在本發明中治療的脈管系統或淋巴系統炎症的實例包括關節硬化、關節炎、靜脈炎、血管炎和淋巴管炎。
可在本發明中治療的消化系統的炎性病症的實例包括膽管炎、膽囊炎、腸炎、小腸結腸炎、胃炎、胃腸炎、迴腸炎和直腸炎。
可以在本發明中治療的生殖系統的炎性病症的實例包括宮頸炎、絨毛膜羊膜炎、子宮內膜炎、附睪炎、臍炎、卵巢炎、睪丸炎、輸卵管炎、輸卵管卵巢膿腫、尿道炎、陰道炎、外陰炎和外陰痛。
所述藥劑可用於治療具有炎性成分的自身免疫病症。這些病症包括急性播散性脫髮、貝赫切特病、查加斯病、慢性疲勞症候群、自主神經機能異常、腦脊髓炎、強直性脊柱炎、再生障礙性貧血、化膿性汗腺炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎、乳糜瀉、克羅恩病、1型糖尿病、巨細胞動脈炎、肺出血腎炎症候群、格雷夫病、格-巴二氏症候群、橋本病、過敏性紫癜、川崎病、紅斑狼瘡、微觀結腸炎、微觀多動脈炎、混合性結締組織病、多發性硬化、重症肌無力、眼肌陣攣症候群、視神經炎、ord’s甲狀腺炎、天皰瘡、結節性多動脈炎、多肌痛、賴特症候群、乾燥症候群、顳動脈炎、韋格納肉芽腫病、溫熱自身免疫性溶血性貧血、間質性膀胱炎、萊姆病、硬斑病、結節病、硬皮病、潰瘍性結腸炎和白癜風。
所述藥劑可用於治療具有炎性成分的t細胞介導的超敏反應性疾病。這些病症包括接觸性超敏反應、接觸性皮炎(包括由有毒常春藤引起的)、蕁麻疹、皮膚過敏、呼吸道過敏(花粉症、過敏性鼻炎)和麩質敏感性腸病(乳糜瀉)。
可在本發明中治療的其它炎性病症包括例如，闌尾炎、皮炎、皮肌炎、心內膜炎、纖維組織炎、牙齦炎、舌炎、肝炎、化膿性汗腺炎、虹膜炎、喉炎、乳腺炎、心肌炎、腎炎、耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、肺炎、前列腺炎、腎盂腎炎和口內炎、移植排斥反應(涉及腎臟、肝臟、心臟、肺、胰腺(如胰島細胞)、骨髓、角膜、小腸、皮膚同種異體移植物、皮膚同種移植物和心臟瓣膜異種移植物、血清病(sewrumsickness)和移植物抗宿主病)、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、急性呼吸窘迫症候群、sexary症候群、先天性腎上腺增生、非化膿性甲狀腺炎、與癌症相關的高鈣血症、天皰瘡、大皰性皰疹性皮炎、嚴重多形紅斑、剝脫性皮炎、脂溢性皮炎、季節性或常年性變應性鼻炎、支氣管哮喘、接觸性皮炎、異位性皮炎、藥物超敏反應、變應性結膜炎、角膜炎、眼部帶狀皰疹、虹膜炎和虹膜睫狀體炎、脈絡膜視網膜炎、視神經炎、症狀性結節病、暴發性或播散性肺結核化療、成人特發性血小板減少性紫癜、成人繼發性血小板減少症、獲得性(自身免疫性)溶血性貧血、成人白血病和淋巴瘤、兒童的急性白血病、局限性腸炎、自身免疫性血管炎、多發性硬化、慢性阻塞性肺疾病、實體器官移植排斥、敗血症。
優選的治療包括移植排斥、牛皮癬關節炎、多發性硬化、1型糖尿病、哮喘、系統性紅斑狼瘡、慢性肺疾病和伴隨感染的傳染性疾病(例如敗血症)的治療中的任一種。
藥物組合物可按照每單位劑量含有預定量的活性成分的單位劑量形式存在。該單位依據所治療的疾病、給藥途徑和患者的年齡、體重和狀況，可含有，例如，0.5mg-1g，優選1mg-700mg，更優選5mg-100mg的式(i)化合物，或藥物組合物可按照每單位劑量含有預定量的活性成分的單位劑量形式存在。優選的單位劑量組合物是含有如上文所述的活性成分的日劑量或亞劑量或其適當分數的那些。此外，該藥物組合物可通過藥學領域熟知的任意方法製備。
藥物組合物可適於任意合適的途徑的施用，例如，口服(包括口腔或舌下)、直腸、鼻、局部(包括口腔、舌下或經皮)、陰道或胃腸外(包括皮下、肌內、靜脈內或真皮內)途徑。該組合物可通過藥物領域已知的任意方法製備，例如，通過將式(i)化合物與一種或多種載體或賦形劑組合。
適用於口服給藥的藥物組合物可為離散單位，例如片劑或膠囊；粉劑或顆粒；水性或非水液體中的溶液或混懸液；食用泡沫或攪打劑；水包油的液體乳液或油包水的液體乳液。
膠囊是通過以下製備的：按上述製備粉末混合物並填充到成形的明膠鞘中。可在填充操作前，將助流劑和潤滑劑，例如膠體二氧化矽、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、固體聚乙二醇加至該粉末混合物中。還可加入崩解劑或增溶劑，例如瓊脂、碳酸鈣或碳酸鈉，使得當該膠囊被攝取時提高藥物的可用性。
此外，當需要或必要時，還可將合適的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑摻入到該混合物中。合適的粘合劑包括澱粉、明膠、天然糖(例如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味劑、天然和合成樹膠(例如阿拉伯膠、黃蓍膠)、海藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇、蠟等。在這些劑型中所用的潤滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括，但不限於，澱粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠等。片劑是通過如下製備的，例如，製備粉末混合物、制粒或預壓(slugging)、添加潤滑劑和崩解劑並壓製成片。粉末混合物是通過以下製備的，將適當粉碎的化合物與上述稀釋劑或鹼混合，並任選地，與粘合劑(例如羧甲基纖維素和藻酸鹽)、明膠或聚乙烯吡咯烷酮、溶液延遲劑(例如石蠟)、再吸收加速劑(例如季鹽)和/或吸收劑(例如膨潤土、高嶺土或磷酸二鈣)混合。用片劑成形模，通過加入硬脂酸、硬脂酸鹽、滑石或礦物油可將該粉末混合物制粒。然後將該潤滑的混合物壓製成片。本發明化合物還可與自由流動的惰性載體組合且無需進行制粒或預壓步驟而直接壓製成片。可提供由蟲膠隔離層、糖或聚合材料的包衣和蠟的拋光包衣組成的澄清或不透明的保護包衣。可將染料加至這些包衣以區分不同的劑量。
口服流體(例如溶液、糖漿和酏劑)可以單位劑量形式製備，使得給定量含有預定量的式(i)化合物。糖漿可通過將該化合物溶於適當矯味的水溶液中進行製備，而酏劑通過使用無毒醇媒介物製備。混懸液可通過將該化合物分散於無毒媒介物中進行配製。還可加入增溶劑和乳化劑(例如乙氧基化的異硬脂醇和聚氧乙烯山梨醇醚)、防腐劑、矯味添加劑(例如薄荷油)、天然甜味劑、糖精或其他人造甜味劑等。
當適當時，可對用於口服給藥的劑量單位製劑進行微囊化。也可例如通過將顆粒物質包衣或包埋到聚合物、蠟等中來製備製劑以延長或維持釋放。
適用於直腸給藥的藥物組合物可以栓劑或灌腸劑存在。
適用於陰道給藥的藥物組合物可以陰道栓劑、棉塞、霜劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧製劑存在。
適用於胃腸外給藥的藥物製劑包括水性和非水無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和溶質，其使得該組合物與預期接受者的血液等滲；和水性和非水無菌混懸液，其可包含懸浮劑和增稠劑。該藥物組合物可存在於單位劑量或多劑量容器中，例如密閉的安瓿和小瓶且可儲存於冷凍乾燥的(凍幹的)條件下，其僅需在使用前立即加入無菌液體載體，例如注射用水。臨時注射溶液和混懸液可由無菌粉末、顆粒和片劑製備。
應理解，除了上面特別提及的成分，該藥物組合物可根據所探討的製劑類型包含本領域常用的其他試劑，例如適用於口服給藥的那些可包含矯味劑。
本發明化合物的治療有效量將取決於許多因素，包括，例如，預期接受者的年齡和體重、需要治療的精確病症和其嚴重性、該製劑的性質和給藥途徑且最終由開處方人員慎重決定。但是，治療貧血的式(i)化合物的有效量的通常範圍是每天0.001-100mg/kg接受者體重，適當地範圍為每天0.1-10mg/kg體重。對於70kg成年哺乳動物，每天的實際量將適當地為7-700mg且該量可以每日單一劑量給予或以每天若干(例如2、3、4、5或6個)亞劑量給予，使得總的劑量相同。有效量的鹽或溶劑合物等可按式(i)化合物本身有效量的比例來確定。預期類似的劑量將適用於治療上述其他病症。
定義
術語以其被接受的含義使用。以下定義旨在闡明，而非限制所定義的術語。
本文所用術語「烷基」表示具有指定碳原子數的飽和、直鏈或支鏈烴部分。術語「(c1-c6)烷基」是指含有1-6個碳原子的烷基。示例性的烷基包括，但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基。
當術語「烷基」與其他取代基組合使用時，例如「滷代(c1-c4)烷基」，術語「烷基」旨在涵蓋二價直鏈或支鏈烴基，其中連接點通過烷基部分。術語「滷代(c1-c4)烷基」旨在表示在含有1-4個碳原子的烷基基團的1個或多個碳原子上具有1個或多個可相同或不同的滷素原子的基團，其可以是直鏈或支鏈碳基。在本發明中所用的「滷代(c1-c4)烷基」的實例包括，但不限於，-cf3(三氟甲基)、-ccl3(三氯甲基)、1,1-二氟乙基、2-氟-2-甲基丙基、2,2-二氟丙基、2,2,2-三氟乙基和六氟異丙基。
術語「滷素」和「滷」表示氯、氟、溴或碘取代基。「羥基」旨在表示基團-oh。
本文所用術語「任選地」是指隨後描述的事件可能發生或不發生，且包括發生的事件和不發生的事件二者。
本文所用術語「治療」是指在先前患有或確診的患者或受試者中，減輕具體病症、消除或減少該病症的一種或多種症狀、減緩或消除該病症的進展和預防或延遲該病症的復發。
本文所用術語「有效量」是指由例如研究人員或臨床醫師所探索的將引起組織、系統、動物或人的生物學或醫學響應的藥物或藥劑的量。
術語「治療有效量」是指與未接受該量的相應受試者相比，引起疾病、障礙或副作用的改進的治療、治癒或改善，或降低疾病或障礙進展速度的任意量。術語在其範圍內還包括提高正常生理功能的有效量。對於在療法中的用途，治療有效量的式(i)化合物及其鹽可以化學原料施用。此外，所述活性成分可以藥物組合物存在。
化合物的製備
縮寫
acoh乙酸
boc叔丁氧基羰基
boc2o二碳酸二叔丁酯
ch3cn乙腈
ch3no2硝基甲烷
cs2co3碳酸銫
dcm二氯甲烷
dibal-h二異丁基氫化鋁
dmap4-二甲基氨基吡啶
dmfn,n-二甲基甲醯胺
dmso二甲基亞碸
edcn-(3-二甲基氨基丙基)-n′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽
es電噴射
et3n三乙胺
etoac乙酸乙酯
etococl氯甲酸乙酯
etoh乙醇
h小時
h2氫氣
hcl鹽酸
h2o水
h2so4硫酸
hoat1-羥基-7-氮雜苯並三唑
hplc高效液相色譜
in(otf)3三氟甲磺酸銦(iii)
k2co3碳酸鉀
koac乙酸鉀
kotbu叔丁醇鉀
lcms液相色譜質譜
libh4硼氫化鋰
liclo4高氯酸鋰
meoh甲醇
mgso4硫酸鎂
min分鐘
ms質譜
nabh4硼氫化鈉
nabh3cn氰基硼氫化鈉
nabh(oac)3三乙醯氧基硼氫化鈉
na2co3碳酸鈉
nahco3碳酸氫鈉
nahmds二(三甲基甲矽烷基)氨基鈉
na2hpo4磷酸氫二鈉
nano2亞硝酸鈉
naoh氫氧化鈉
na2so4硫酸鈉
nbsn-溴琥珀醯亞胺
nh4cl氯化銨
nh4oac醋酸銨
nh4oh氫氧化銨
nmmn-甲基嗎啉
2-ntf2-吡啶1,1,1-三氟-n-(吡啶-2-基)-n-((三氟甲基)磺醯基)甲磺醯
胺
pd/c鈀/炭
pdcl2(dppf)[1,1』-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(ii)
pd(pph3)4四(三苯基膦)鈀(0)
phh苯
p2o5五氧化二磷
pocl3磷醯氯
pyr吡啶
rt室溫
socl2亞硫醯氯
tfa三氟乙酸
tf2o三氟甲磺酸酐
thf四氫呋喃
ticl4四氯化鈦(iv)
tmscl三甲基氯矽烷
ti(oipr)4異丙醇鈦(iv)
一般性合成方案
本發明化合物可通過各種方法，包括熟知的標準合成方法製備。示例性的一般性合成方法如下所示，然後具體的本發明化合物在工作實施例中進行製備。本領域技術人員將理解，如果本文所描述的取代基對本文所述的合成方法不相容，則該取代基可用對該反應條件穩定的合適的保護基團進行保護。該保護基團可在反應順序中合適的點進行脫除以提供所需的中間體或目標化合物。在下文所述的全部方案中，根據合成化學的一般原則，在有必要的位置，使用敏感或反應性基團的保護基團。保護基團根據有機合成的標準方法進行處理(t.w.green和p.g.m.wuts，(1991)protectinggroupsinorganicsynthesis，johnwiley&sons，其保護基團引入本文作為參考)。使用本領域技術人員熟悉的方法，在該化合物合成的合適的階段將這些基團脫除。方法及反應條件的選擇以及它們的執行順序應與本發明化合物的製備一致。起始材料是市售可得的或使用本領域技術人員已知的方法從市售可得的起始材料製備的。
式(id)化合物可根據方案1或類似方法製備。適當取代的噻吩-3-甲酸的酯化提供了相應的酯。用適當取代的任何酸酐(或醯氯)進行銦介導的醯化反應得到5-醯基噻吩。與適當取代的酮進行的mcmurray偶聯得到四取代的烯烴。用適當取代的三氟甲磺酸酯(或烷基滷化物)進行的烷基化或用適當取代的醛進行的還原胺化提供取代的衍生物。酯的皂化，然後將所得甲酸與適當取代的胺偶聯，得到式(id)化合物。
方案1：式(id)化合物的合成。
所述式(ic)化合物可根據方案2或類似方法製備。用相應的weinreb醯胺形成適當取代的酮是由合適的格氏(或烷基鋰)試劑完成的。相應的三氟甲磺酸乙烯酯的形成，然後與適當取代的溴代噻吩進行鈀介導的偶聯，得到三取代的烯烴。烯烴的還原，然後用適當取代的三氟甲磺酸酯(或烷基滷化物)進行烷基化或用適當取代的醛還原胺化，得到取代的衍生物。酯的皂化，然後將所得羧酸與適當取代的胺偶聯，得到式(ic)化合物。
方案2：式(ic)化合物的合成。
其中r3和r4一起表示-ch2ch2-的式(i)化合物可根據方案3或類似方法製備。適當取代的噻吩甲醛與硝基甲烷的縮合提供了相應的硝基乙烯基噻吩。硝基乙烯基的還原，然後捕獲所得胺，產生相應的氨基甲酸乙酯。將所述氨基甲酸乙酯用pocl3/p2o5處理得到內醯胺。用適當取代的酸酐(或醯氯)進行銦介導的醯化反應，得到5-醯基噻吩。用適當取代的胺進行還原胺化或用適當取代的酮進行mcmurray偶聯，得到精製的噻吩內醯胺。用適當取代的烷基滷化物進行內醯胺氮的烷基化，然後除去苄基保護基，得到式(i)化合物。
方案3：式(i)化合物的合成。
式(ic2)化合物可根據方案4或類似方法製備。銥介導的硼酸化，然後與適當取代的三氟甲磺酸酯進行suzuki偶聯，得到相應的偶聯烯烴。銥介導的所述烯烴的不對稱還原，然後除去boc-保護基團，得到所述哌啶。用適當取代的三氟甲磺酸酯(或烷基滷化物)進行烷基化或用適當取代的醛進行還原胺化，得到取代的衍生物。酯的皂化，然後將所得羧酸與適當取代的胺偶聯，得到式(ic2)化合物。
方案4：式(ic2)化合物的合成。
實驗
以下指引適用於本文所述的全部實驗操作。除非另外提及，否則所有反應是在氮正壓下，使用烘乾的玻璃器具進行的。所指定的溫度是外部的(即浴溫度)且是近似的。通過注射器轉移對空氣和溼度敏感的液體。試劑按原樣使用。所用的溶劑是那些供應商標註為「無水」的溶劑。溶液試劑所標註的摩爾濃度是近似的且使用前並未相對相應的標準進行滴定。除非另外提及，否則所有的反應是通過攪拌棒進行攪拌的。除非另外提及，否則加熱是使用含有矽油的加熱浴進行的。反應是使用配有biotage微波exp小瓶(0.2–20ml)和隔墊和瓶蓋的biotageinitiatortm2.0儀器，用微波輻射(0–400w，2.45ghz)進行的。基於溶劑和離子電荷所使用的輻射水平(即高、正常、低)是基於供應商的說明。使用乾冰/丙酮或乾冰/2-丙醇將溫度冷卻至-70℃以下。用作乾燥劑的硫酸鎂和硫酸鈉是無水級別的且可互換使用。被描述為「真空」或「減壓下」除去的溶劑是通過旋轉蒸發完成的。
製備型正相矽膠色譜是使用以下進行的：配有redisep或iscogold矽膠柱(4g-330g)的teledyneiscocombiflashcompanion儀器或配有sf25矽膠柱(4g–300g)的analogixif280儀器或配有hp矽膠柱(10g–100g)的biotagesp1儀器。除非另外提及，否則反相hplc純化是使用ymc-pack柱(ods-a75x30mm)作為固相進行的。除非另外提及，否則使用25ml/mina(ch3cn-0.1％tfa):b(水-0.1％tfa)的移動相，10-80％梯度a(10min)，在214nm處進行uv檢測。
pesciexapi150單四極質譜儀(pesciex，thornhill，ontario，canada)是陽離子檢測模式下，使用電噴霧電離進行操作。該霧化氣體產生自零空氣發生器(balstoninc.，haverhill，ma，usa)並在65psi遞送，而所述氣簾氣(curtaingas)是從dewar液氮容器中遞送的在50psi的高純氮。施加到電噴霧針上的電壓是4.8kv。室口(orifice)設定在25v且質譜儀以0.5掃描/秒的速率進行掃描，其使用0.2amu的步幅質量並收集分布數據。
方法a，lcms。使用配有hamilton10ul注射器(其執行向valco10通進樣閥的注入)的ctcpal自動採樣器(leaptechnologies，carrboro，nc)，將樣品送入該質譜儀。所述hplc泵是lc-10advp(shimadzuscientificinstruments，columbia，md)，其以0.3ml/min和線性梯度4.5％a至90％b操作3.2分鐘，保持0.4分鐘。流動相由容器a中的100％(h2o0.02％tfa)和容器b中的100％(ch3cn0.018％tfa)組成。固定相是aquasil(c18)且柱尺寸為1mmx40mm。檢測是由214nm處的uv、蒸發光散射(elsd)和ms進行的。
方法b，lcms。或者，使用具有lc/ms的agilent1100分析型hplc系統並在1ml/min和線性梯度5％a至100％b操作2.2min，保持0.4min。流動相由容器a中的100％(h2o0.02％tfa)和容器b中的100％(ch3cn0.018％tfa)組成。固定相是具有3.5um顆粒尺寸的zobax(c8)且柱尺寸為2.1mmx50mm。檢測是由214nm處的uv、蒸發光散射(elsd)和ms進行的。
方法c，lcms。或者，使用配有毛細管柱(50×4.6mm，5μm)的mdssciexapi2000。hplc是在配有柱zorbaxsb-c18(50×4.6mm，1.8μm)的agilent-1200系列uplc系統上進行的，其用ch3cn:nh4oac緩衝液進行洗脫。該反應是在微波(cem，discover)中進行的。
1h-nmr譜在400mhz進行記錄，其使用brukeravance400mhz儀器，配有acdspectmanagerv.10用於再處理。所指代的多重性為：s＝單峰，d＝二重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quint＝五重峰，sxt＝六重峰，m＝多重峰，dd＝雙二重峰，dt＝雙三重峰等和br表示寬信號。除非另外提及，否則所有nmr是在dmso-d6中進行。
分析型hplc：產物用以下進行分析，agilent1100分析型色譜系統，具有4.5x75mmzorbaxxdb-c18柱(3.5um)，梯度從5％ch3cn(0.1％甲酸)至95％ch3cn(0.1％甲酸)的h2o溶液(0.1％甲酸)以2ml/min進行4min，和保持1min。
中間體
中間體1
a)2-(苄基氧基)-4,6-二甲基煙腈
將2-羥基-4,6-二甲基煙腈(5g，33.7mmol)在甲苯(50ml)中的溶液用苄基氯(4.70ml，40.5mmol)和氧化銀(8.60g，37.1mmol)處理，然後在110℃攪拌過夜。將該反應通過過濾並將固體用dcm(2x100ml)洗滌。將合併的有機層用鹽水(30ml)洗滌，通過na2so4過濾並真空濃縮，得到殘餘物。將該殘餘物在真空下，使用20-30％dcm的石油醚溶液，通過二氧化矽填料純化。將所需級分合併並濃縮，得到2-(苄基氧基)-4,6-二甲基煙腈(9g，35.9mmol，106％產率)，其為白色固體。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.47-7.56(m，2h)，7.31-7.43(m，3h)，6.72(s，1h)，5.51(s，2h)，2.48(d，j＝3.03hz，6h)。ms(es)[m+h]+239.0。
b)2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-甲醛
在惰性氣氛下，通過注射器向2-(苄基氧基)-4,6-二甲基煙腈(9g，35.9mmol)在dcm(100ml)中的冷卻(冰浴)溶液中緩慢加入1mdibal-h在甲苯(43.1ml，43.1mmol)中的溶液。將該反應在0℃攪拌20min，此時除去冰浴並將該反應在室溫攪拌過夜。lcms顯示約14％的起始原料剩餘。加入另一部分的1mdibal-h的甲苯溶液(10.76ml，10.76mmol)並將該反應在室溫繼續攪拌。lcms指示該反應完成。將該反應冷卻(冰浴)並用1nhcl(50ml)淬滅。**注意放熱。將該反應攪拌30min直到鋁鹽自由流動。將該反應用2.5nnaoh(約15ml，約ph7.5)中和。將該兩相混合物過濾並將濾液用dcm(100ml，2x)洗滌。分離各層並將水相用dcm(100ml)萃取。將合併的有機層用鹽水(30ml)洗滌，通過na2so4過濾並真空濃縮。將該殘餘物用快速色譜純化(柱：80克二氧化矽。洗脫液：0-5％etoac的庚烷溶液。梯度：15min)。將所需級分合併並真空濃縮，得到2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-甲醛(3.5g，14.36mmol，40.0％產率)，其為蓬鬆的白色固體。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ10.58(s，1h)，7.49(d，j＝7.07hz，2h)，7.31-7.44(m，3h)，6.67(s，1h)，5.54(s，2h)，2.59(s，3h)，2.50(s，3h)。ms(es)[m+h]+242.1，[m+na]+264.0。
c)(2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲醇
將2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-甲醛(3.46g，14.34mmol)在meoh(100ml)中的混懸液保持在惰性氣氛下並在冰浴中冷卻至0℃。向該攪拌的混懸液中分兩次加入nabh4(0.651g，17.21mmol)。在加入第一批nabh4後，將該混懸液倒至溶液中。將該反應在0℃攪拌10min，此時除去冰浴並將該反應在室溫攪拌過夜。將該反應溶劑真空除去，然後將剩餘的白色固體殘餘物分配於飽和nahco3(60ml)和etoac(125ml)之間。將水層用etoac(125ml)萃取。將合併的有機層用鹽水(20ml)洗滌，通過na2so4過濾並真空濃縮，得到(2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲醇(3.5g，14.39mmol，100％產率)，其為無色半透明油。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.44-7.53(m，2h)，7.30-7.43(m，3h)，6.63(s，1h)，5.46(s，2h)，4.72(s，2h)，2.43(s，3h)，2.35(s，3h)，2.25(br.s.，1h)。ms(es)[m+h]+244.1。
d)2-(苄基氧基)-3-(氯甲基)-4,6-二甲基吡啶
將(2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲醇(3.5g，14.39mmol)在dcm(70ml)中的混懸液保持在惰性氣氛下並在乾冰/ch3cn浴冷卻至-40℃持續30min。向該冷卻溶液中一次性加入2msocl2的dcm溶液(10.79ml，21.58mmol)並將該反應在-40℃繼續攪拌。1h後，lcms顯示5％起始原料剩餘。加入額外的2msocl2的dcm溶液(1.439ml，2.88mmol)且該反應繼續。20min後，將該反應傾倒至冰水中並將ph用飽和nahco3(30ml)調節至7-8。將水層用dcm(125ml，2x)萃取。將合併的有機層用鹽水(50ml)洗滌，通過na2so4並真空濃縮。將該殘餘物用快速色譜純化(柱：80克二氧化矽。洗脫液：0-10％etoac/庚烷。梯度：14min)，得到2-(苄基氧基)-3-(氯甲基)-4,6-二甲基吡啶(2.84g，10.74mmol，74.7％產率)，其為無色油。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.48-7.57(m，2h)，7.30-7.45(m，3h)，6.64(s，1h)，5.47(s，2h)，4.74(s，2h)，2.43(s，3h)，2.38(s，3h)。ms(es)[m+h]+262.1。
中間體2
a)4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
在室溫氮氣下，向3-溴-4-甲基噻吩(20.0g，113mmol)在thf(100ml)中的攪拌溶液中滴加1.3n異丙基氯化鎂氯化鋰複合物的thf溶液(90ml，117mmol)。將該反應攪拌過夜。將該反應冷卻至-78℃並用氯甲酸甲酯(12ml，155mmol)處理。將該反應溫熱至室溫並攪拌1小時。將該反應用etoac稀釋，用飽和nahco3洗滌，攪拌30min(形成懸浮於水相中的白色混懸液)，用鹽水洗滌，乾燥(na2so4)，過濾並真空濃縮。將該產物在44-50℃(油浴50-75℃)真空下(4-2mmhg)進行短程蒸餾(shortpathdistilled)。將主要且較晚洗脫的級分合併，得到產物4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(13.2g，85mmol，74.8％產率)，其為澄清液體。ms(es)[m+h]+156.8。
b)4-甲基-5-丙醯基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(5.0g，32.0mmol)在ch3no2(50ml)中的攪拌溶液中加入liclo4(4.0g，37.6mmol)、丙酸酐(5.87ml，38.4mmol)和in(otf)3(0.9g，1.601mmol)。將該反應在50℃攪拌2小時。lcms顯示該反應完全。將該反應用水(100ml)稀釋，用dcm(2x50ml)萃取，乾燥(na2so4)，過濾並真空蒸發至幹。將剩餘棕色固體用矽膠色譜純化(iscorfgold120g，0-25％etoac的己烷溶液)(裝載有dcm)。將純級分合併並蒸發至幹。將剩餘的淡黃色固體用己烷研磨，過濾和真空乾燥，得到產物4-甲基-5-丙醯基噻吩-3-甲酸甲酯(4.60g，21.67mmol，67.7％產率)，其為白色固體。ms(es)[m+h]+212.9。
中間體3
5-溴-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(12g，77mmol)在dmf(200ml)中的溶液中加入nbs(14.36g，81mmol)。將該反應在室溫攪拌過夜。將該混合物傾倒至水中(1.5l)，攪拌1h並過濾。分離5-溴-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(17.5g，70.7mmol，92％產率)，其為白色固體(在真空烘箱中乾燥後熔化，在冷藏庫儲存後固化)。
中間體4
三氟甲磺酸2-氟-2-甲基丙基酯
向2-氟-2-甲基丙-1-醇(1.3g，14.11mmol)、et3n(2.361ml，16.94mmol)和dmap(0.121g，0.988mmol)在dcm(8ml)中的冷卻(-20℃)溶液中滴加tf2o(2.86ml，16.94mmol)。將該反應在0℃攪拌2h。將該反應用dcm稀釋，用1m檸檬酸水溶液和飽和nahco3洗滌。將有機層乾燥(na2so4)並濃縮，得到2.2g的三氟甲磺酸2-氟-2-甲基丙基酯，其為棕色油。
實施例
實施例1
5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-亞基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
a)4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)亞丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在冰浴中冷卻至0℃的氮氣下，通過短冷凝器，用注射器向在1l圓底燒瓶中的鋅粉(21g，321mmol)和thf(250ml)的攪拌混懸液中加入ticl4(17ml，155mmol)(有黃色煙霧的劇烈反應)。將該反應用thf(75ml)衝洗，並將所得黑色漿液加熱回流(70℃油浴)2h(反應停止攪拌，但在其加熱時恢復)。將4-甲基-5-丙醯基噻吩-3-甲酸甲酯(5.0g，23.56mmol)、4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(15.0g，75mmol)和吡啶(20ml，247mmol)在thf(50ml)中的溶液加入並繼續加熱2天。將該反應冷卻至室溫，用飽和nh4cl水溶液(500ml)淬滅並用etoac(200ml)萃取。將上層etoac相小心地傾倒至硅藻土墊上並過濾。通過用新鮮的etoac攪拌深藍色水性懸浮液並傾析來重複該方案三次(注意：下層深色水性懸浮液不容易過濾並最終堵塞過濾器)。將合併的有機物用鹽水洗滌，乾燥(na2so4)，過濾並蒸發至幹。
將上述粗製胺鹽酸鹽溶於dcm中(250ml)並在0℃冰浴中用et3n(6.0ml，43.0mmol)和boc2o(9.57ml，41.2mmol)處理。將該反應溫熱至室溫並攪拌1h。將該反應真空濃縮，溶於etoac中並用nahco3水溶液洗滌(形成大量白色固體)。將固體過濾掉並用etoac衝洗。將含有產物的澄清濾液轉移到分液漏鬥中。除去較低的nahco3相併將etoac相用1nhcl、鹽水洗滌，乾燥(na2so4)，過濾並蒸發至幹。將該殘餘物用矽膠色譜純化(iscorfgold120g，0-25％etoac的己烷溶液)。將純級分合併並蒸發至幹，得到4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)亞丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(6.08g，14.10mmol，59.9％產率)，其為無色油，其在真空下固化成白色固體。該反應重複兩次，總共得到12.17g的產物。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.04(s，1h)，3.86(s，3h)，3.51(br.s.，2h)，3.34(br.s.，2h)，2.44(t，j＝5.8hz，2h)，2.34(br.s.，2h)，2.24(s，3h)，2.01(t，j＝5.8hz，2h)，1.48(s，9h)，0.94(t，j＝7.6hz，3h)。ms(es)[m+h]+-boc280.0，[m+h]+-異丁烯324.1，m+na+402.1。
b)5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)亞丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(12.1g，31.9mmol)中加入hcl的二噁烷溶液(30ml，120mmol)。攪拌30min後，將該反應蒸發至幹，得到粗製的胺鹽酸鹽，其為白色固體泡沫。
在0℃冰浴中，向2,2-二氟丙-1-醇(16.3g，170mmol)和吡啶(16.3ml，202mmol)在ch3cn(250ml)中的攪拌溶液中滴加tf2o(28ml，166mmol)。將該反應在0℃攪拌30min，然後加入冰塊至上述胺鹽酸鹽和k2co3(46.8g，339mmol)在ch3cn(100ml)中的漿液中。將該反應用ch3cn(50ml)漂洗。將該反應溫熱至室溫，加熱至50℃並攪拌6h。將該反應真空蒸發至幹，溶於dcm中，用水，鹽水洗滌，乾燥(na2so4)，過濾並真空濃縮。將該殘餘物用矽膠色譜純化(iscorfgold120g，5-15％etoac的己烷溶液)。將純級分合併並真空蒸發至幹，得到5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(10.05g，24.74mmol，78％產率)，其為無色油。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.03(s，1h)，3.86(s，3h)，2.70(t，j＝12.6hz，4h)，2.57-2.43(m，4h)，2.32(br.s.，2h)，2.25(s，3h)，2.06(br.s.，2h)，1.67(t，j＝18.8hz，3h)，0.94(t，j＝7.5hz，3h)。ms(es)[m+h]+358.2。
c)5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-亞基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
向5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(10.0g，28.0mmol)在meoh(150ml)中的攪拌溶液中加入5nnaoh(20ml，100mmol)。將該反應在70℃攪拌4h。將該反應真空濃縮以除去meoh並用6nhcl(16.7ml)中和至ph約7。形成膠質，將其用dcm萃取，乾燥(na2so4)，過濾並蒸發成固體泡沫。
向上述物質中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1h)-酮鹽酸鹽(5.8g，30.7mmol)、hoat(3.8g，27.9mmol)、dcm(150ml)和nmm(3.4ml，30.9mmol)。將所有固體塊用攪拌棒打碎。向該攪拌混懸液中加入edc游離鹼(5.0g，32.2mmol)。將該反應在室溫攪拌3h，然後在40℃用連接的回流冷凝器過夜。將該反應真空濃縮。將該渾濁溶液通過硅藻土墊過濾並用少量的dcm衝洗。將澄清濾液濃縮並用矽膠色譜純化(iscorfgold220g，0-5％etoh的etoac溶液)。將純級分合併並真空蒸發至幹。將所得固體用10％etoac/己烷研磨，過濾，用己烷洗滌和真空乾燥，得到5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-亞基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺(11.56g，24.20mmol，87％產率)，其為白色固體。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ11.48(s，1h)，8.01(t，j＝5.1hz，1h)，7.78(s，1h)，5.86(s，1h)，4.24(d，j＝5.1hz，2h)，2.71(t，j＝14.1hz，2h)，2.61(t，j＝4.7hz，2h)，2.46(br.s.，2h)，2.38(t，j＝5.6hz，2h)，2.30-2.21(m，2h)，2.18(s，3h)，2.11(s，3h)，2.07(s，3h)，1.93(t，j＝5.3hz，2h)，1.62(t，j＝19.2hz，3h)，0.86(t，j＝7.5hz，3h)。ms(es)[m+h]+478.3。
實施例2
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
a)5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-甲基-5-(1-(哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯鹽酸鹽(160mg，0.507mmol)在ch3cn(5ml)中的溶液中加入cs2co3(330mg，1.013mmol)和三氟甲磺酸2-氟-2-甲基丙基酯(454mg，2.026mmol)。將該混合物在50℃加熱18h。將該反應混合物冷卻至室溫，用水淬滅並用etoac(3x)萃取。將合併的有機物乾燥(na2so4)並濃縮。將該殘餘物使用柱色譜純化(矽膠，0-50％etoac/己烷)，得到5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(92mg)，其為無色油。ms(es)[m+h]+354.3。
b)n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
向5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(90mg，0.255mmol)在meoh(2ml)中的溶液中加入8nnaoh(0.159ml，1.273mmol)。將該混合物在35℃加熱18h。將該混合物用6nhcl(0.212ml，1.273mmol)中和，濃縮。
向該殘餘物在二甲基亞碸(2.000ml)中的溶液中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1h)-酮鹽酸鹽(62.4mg，0.331mmol)、nmm(0.140ml，1.273mmol)、edc(98mg，0.509mmol)和hoat(69.3mg，0.509mmol)。將該混合物在室溫攪拌18h。將該混合物用水(10ml)淬滅。將所得沉澱物通過過濾收集，用水洗滌並真空乾燥，得到n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺(105mg)，其為灰白色固體。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ0.86(t，j＝7.45hz，3h)，1.28(s，3h)，1.33(s，3h)，1.93(t，j＝5.31hz，2h)，2.07(s，3h)，2.11(s,3h)，2.18(s，3h)，2.20-2.32(m，2h)，2.34-2.46(m，6h)，4.23(d，j＝5.05hz，2h)，5.86(s，1h)，7.78(s，1h)，8.01(t，j＝4.93hz，1h)。ms(es)[m+h]+474.3.
實施例3
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲醯胺
根據實施例2的一般操作，製備n-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲醯胺。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ11.48(s，1h)，8.01(t，j＝4.93hz，1h)，7.79(s，1h)，5.86(s，1h)，4.24(d，j＝5.05hz，2h)，3.33(s，2h)，3.18(q，j＝10.27hz，2h)，2.69(d，j＝5.05hz，2h)，2.39(t，j＝5.56hz，2h)，2.26(d，j＝6.82hz，2h)，2.18(s，3h)，2.11(s，3h)，2.07(s，3h)，1.93(t，j＝5.31hz，2h)，0.87(t，j＝7.45hz，3h)。ms(es)[m+h]+482.3。
實施例4
(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
a)4-丙醯基哌啶-1-甲酸叔丁酯
在0℃(冰浴)氮氣下，向4-(甲氧基(甲基)氨基甲醯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(10.0g，36.7mmol)在thf(100ml)中的攪拌溶液中滴加2n乙基氯化鎂在thf(28ml，56.0mmol)。將該反應在0℃攪拌4h，然後用飽和nh4cl淬滅，用etoac萃取，用鹽水洗滌，乾燥(na2so4)，過濾並真空蒸發至幹。將該粗產物用矽膠色譜純化(iscorfgold220g，0-40％etoac的己烷溶液)。(uv陰性，通過h2so4的etoh溶液炭化來顯現)。將純級分合併並蒸發至幹，得到4-丙醯基哌啶-1-甲酸叔丁酯(8.10g，33.6mmol，91％產率)，其為無色油。ms(es)[m+h]+-異丁烯-18167.9，[m+h]+-異丁烯186.0，m+na+264.1。
b)(z)-4-(1-(((三氟甲基)磺醯基)氧基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在-78℃(co2，丙酮)氮氣下，向4-丙醯基哌啶-1-甲酸叔丁酯(6.9g，28.6mmol)在thf(80ml)中的攪拌溶液中滴加1nnahmds的thf溶液(31ml，31.0mmol)。將該反應在-78℃攪拌1h。接下來滴加2-ntf2-吡啶(11.4g，31.8mmol)在thf(50ml)中的，歷時5min。將該反應在-78℃攪拌1h，然後在0℃攪拌30min。將該反應用水(150ml)淬滅，用etoac(2x150ml)萃取，用鹽水洗滌，乾燥(na2so4)，過濾並真空濃縮。將該粗產物用矽膠色譜純化(iscorfgold220g，0-20％etoac的己烷溶液)。(uv陰性，通過h2so4的etoh溶液炭化來顯現)。將純級分合併並蒸發至幹，得到(z)-4-(1-(((三氟甲基)磺醯基)氧基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(9.15g，24.51mmol，86％產率)，其為無色油。ms(es)[m+h]+-異丁烯318.1。
c)(z)-4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
向4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-二(1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷)(17.39g，68.5mmol)、5-溴-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(7g，29.8mmol)和koac(9.64g，98mmol)在1,4-二噁烷(200ml)中的脫氣溶液中加入pdcl2(dppf)-dcm加合物(1.216g，1.489mmol)。將該反應混合物在70℃加熱過夜，此時將該混懸液通過二氧化矽短墊過濾。向該濾液中加入(e)-4-(1-(((三氟甲基)磺醯基)氧基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(6.67g，17.86mmol)、水(60ml)和na2co3(7.89g，74.4mmol)。將該溶液脫氣並加入pd(pph3)4(1.720g，1.489mmol)。將該反應混合物在70℃加熱1h。將該反應用etoac(200ml)稀釋並過濾。分離各層並將有機物用鹽水洗滌，用mg2so4乾燥，過濾並蒸發。將該殘餘物用快速色譜純化(8％thf:己烷)，得到(z)-4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(6.2g，15.52mmol，52.1％產率)，其為白色固體。ms(es)[m+h]+402.2(m+na)
d)4-甲基-5-(1-(哌啶-4-基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯
向(z)-4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(6.2g，16.34mmol)在etoh(120ml)中的溶液中加入10％pd/c(degussa，12g，11.28mmol)。將該反應在氫氣氛下(氣球)攪拌24h，此時將該混合物通過硅藻土過濾並蒸發。將該殘餘物溶於二噁烷(10ml)中並加入3mhcl(10ml)。將該反應混合物加熱回流10min，然後蒸發。將該殘餘物分配於etoac(100ml)和1mna2co3(50ml)之間。分離各層並將有機物用鹽水洗滌，用mgso4乾燥，過濾並蒸發，得到4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.6g，8.78mmol，53.7％產率)，其為無色液體。ms(es)[m+h]+282.2。
e)(s)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯和(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向2,2-二氟丙-1-醇(3.17g，33.0mmol)和吡啶(2.97ml，36.7mmol)在ch3cn(100ml)中的冷卻(0℃)溶液中滴加tf2o(5.70ml，33.8mmol)。將該反應在0℃攪拌30min。向該冷卻漿液中加入4-甲基-5-(1-(哌啶-4-基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯鹽酸鹽(2.6g，7.34mmol)和k2co3(9.13g，66.0mmol)在ch3cn(20ml)中的冷溶液。將該反應溫熱至室溫，然後在50℃加熱過夜。將該反應真空蒸發至幹，溶於dcm，用水，鹽水洗滌，乾燥(na2so4)，過濾並真空濃縮。將該殘餘物用矽膠色譜純化(iscorfgold120g，5％etoac:己烷)，得到5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(2.05g，5.42mmol，73.8％產率)，其為黃色油。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.00(s，1h)，3.85(s，3h)，2.99(d，j＝11.12hz，1h)，2.86(d，j＝11.12hz，1h)，2.53-2.75(m，3h)，2.37(s，3h)，2.04-2.27(m，2h)，1.84-2.01(m，2h)，1.62(t，j＝18.69hz，4h)，1.30-1.47(m，5h)，0.76(t，j＝7.33hz，3h)。ms(es)[m+h]+360.2。
通過手性hplc(chiralcelod-h，5微米，30mmx250mm，250nmuv，98:2:0.1正庚烷:2-丙醇:異丙胺)拆分外消旋產物。將該拆分的產物用2-丙醇稀釋兩次並濃縮，然後在真空烘箱中(50℃)乾燥，得到：
s-(-)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(870mg)：>99.8％ee，[α]d＝-9.6°(c＝0.50，meoh，24℃)和
r-(+)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(860mg)：99.74％ee；[α]d＝+8.8°(c＝0.50，meoh，24℃)。
f)(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
向(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(860mg，2.392mmol)在meoh(10ml)中的溶液中加入3mnaoh(5ml，400mmol)。將該反應混合物攪拌過夜，此時將其用6mhcl中和並蒸發至幹。
向該殘餘物在dmf(10.00ml)中的混懸液中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1h)-酮鹽酸鹽(542mg，2.87mmol)，然後加入edc(550mg，2.87mmol)和hoat(391mg，2.87mmol)。5min後，加入nmm(0.789ml，7.18mmol)並將該溶液在室溫攪拌3h。將該反應混合物傾倒至60ml水中並用etoac(2x50ml)萃取。將合併的有機物用水(30ml)，鹽水洗滌，用mgso4乾燥，過濾並蒸發。將該殘餘物從20％ch3cn:水中重結晶，得到(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺(780mg，1.626mmol，68.0％產率)，其為白色固體(注意：乙基基團的絕對立體化學是根據關於ezh2抑制的r-異構體的已知偏好指定的)。1hnmr(400mhz，meoh-d4)δ7.60(s，1h)，6.12(s，1h)，4.45(s，2h)，3.01(d，j＝11.62hz，1h)，2.89(d，j＝11.12hz，1h)，2.74(ddd，j＝3.79，7.89，11.05hz，1h)，2.64(t，j＝14.02hz，2h)，2.37(s，2h)，2.25(d，j＝5.56hz，6h)，2.18(dt，j＝2.40，11.56hz，1h)，2.03-2.11(m，1h)，1.86-2.01(m，2h)，1.60(t，j＝18.69hz，3h)，1.20-1.49(m，5h)，0.76(t，j＝7.33hz，3h)。ms(es)[m+h]+480.3。
實施例5
(s)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
根據實施例4f的操作，製備(s)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺。1hnmr(400mhz，meoh-d4)δ7.60(s，1h)，6.13(s，1h)，4.45(s，2h)，3.01(d，j＝11.62hz，1h)，2.89(d，j＝10.61hz，1h)，2.74(ddd，j＝3.79，7.89，11.05hz，1h)，2.65(t，j＝14.15hz，2h)，2.38(s，3h)，2.25(d，j＝6.06hz，6h)，2.18(dt，j＝2.53，11.62hz，1h)，2.07(dt，j＝2.53，11.62hz，1h)，1.87-2.01(m，2h)，1.60(t，j＝18.82hz，3h)，1.18-1.48(m，5h)，0.76(t，j＝7.20hz，3h)。ms(es)[m+h]+480.3。
實施例6
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
根據實施例4的操作，製備外消旋n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(2-氟-2-甲基丙基)哌啶-4-基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ0.62-0.76(m，3h)，1.08-2.97(m，24h)，3.26-3.41(m，2h)，4.17-4.31(m，2h)，5.79-5.94(m，1h)，7.68(s，1h)，7.98(t，j＝4.93hz，1h)。ms(es)[m+h]+476.3。
實施例7
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(二甲基氨基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
a)5-(1-(1-(二甲基氨基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)亞丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.0g，2.63mmol)中加入hcl的二噁烷溶液(20ml，658mmol)。攪拌30min後，將該反應真空蒸發至幹，得到脫保護的哌啶鹽酸鹽，其為白色固體泡沫。
向該白色固體在acoh(10ml)中的溶液中分批滴加nano2(0.46g，6.67mmol)在水(2.5ml)中的，歷時2h。將該反應通過lcms監測。2h後，該反應完成91％(n-亞硝基中間體ms(es)[m+h]+309.2)。向該反應中分批緩慢加入鋅粉(1.5g，22.94mmol)。該反應變得溫熱至可觸摸並在冰浴中冷卻。在室溫攪拌2h後，將該反應通過硅藻土墊過濾以除去鋅並用少量的meoh(15ml)衝洗。向該濾液中加入37重量％的甲醛水溶液(2.0ml，26.9mmol)。向該攪拌混合物中分批加入nabh(oac)3(2.3g，10.85mmol)，歷時30min。將該反應在室溫攪拌過夜。lcms顯示17％所需的二甲基肼。將該反應混合物真空蒸發至幹，溶於dcm中，用1nna2co3處理並攪拌30min。將該混懸液通過硅藻土墊過濾並用少量的dcm衝洗。將澄清濾液轉移至分液漏鬥中。將含有產物的較低有機相除去，乾燥(na2so4)，過濾並真空濃縮。將該殘餘物用矽膠色譜純化(iscorfgold40g，0-8％etoh的etoac溶液)。(用3至5％etoh從柱中洗脫該產物)。將含有產物的級分合併並蒸發至幹，得到5-(1-(1-(二甲基氨基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(200mg，0.360mmol，13.65％產率)，其為淡黃色油。ms(es)[m+h]+323.2。
b)n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(二甲基氨基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
向5-(1-(1-(二甲基氨基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(200mg，0.620mmol)在meoh(20ml)中的溶液中加入1nnaoh(4ml，4.00mmol)。將該反應在70℃加熱4h。將該反應真空濃縮以除去meoh並用1nhcl(4.0ml)中和。形成白色固體混懸液。將該混合物真空蒸發，得到粗製甲酸，其為白色固體。
向上述物質中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1h)-酮鹽酸鹽(150mg，0.795mmol)、hoat(84mg，0.62mmol)、dcm(20ml)和nmm(90μl，0.819mmol)。將該固體塊用攪拌棒弄碎。向攪拌的混懸液中加入edc游離鹼(130mg，0.837mmol)。將該反應在室溫攪拌2h，然後在連有回流冷凝器的情況下在40℃攪拌4h。將該渾濁溶液通過硅藻土墊過濾並用少量的dcm衝洗。將澄清濾液濃縮並用矽膠色譜純化(iscorfgold40g，2-10％(5％nh4oh/meoh)的dcm溶液)。將純級分合併並真空蒸發至幹。將該殘餘物通過矽膠色譜再純化(iscorfgold40g，15-40％etoh的etoac溶液)。將純級分合併，真空濃縮，用己烷研磨，過濾，用己烷洗滌和真空乾燥，得到n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-(二甲基氨基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺(144mg，0.325mmol，52.5％產率)，其為白色固體。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ11.49(s，1h)，8.02(t，j＝5.1hz，1h)，7.78(s，1h)，5.86(s，1h)，4.24(d，j＝5.1hz，2h)，2.61(br.s.，2h)，2.45(br.s.，2h)，2.40(t，j＝5.4hz，3h)，2.26(br.s.，2h)2.25(s，6h)，2.18(s，3h)，2.11(s，3h)，2.06(s，3h)，1.94(t，j＝5.4hz，2h)，0.86(t，j＝7.5hz，3h)。ms(es)[m+h]+443.3。
實施例8
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-羥基哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
a)5-(1-(1-(苯甲醯基氧基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)亞丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.0g，2.63mmol)中加入hcl的二噁烷溶液(20ml，658mmol)。將該反應在室溫攪拌30min，然後真空蒸發至幹，得到胺鹽酸鹽，其為白色固體泡沫。向上述的thf溶液(20ml)中加入na2hpo4(2.5g，17.61mmol)。將該反應攪拌並用過氧苯甲醯(1.0g，4.13mmol)分批處理，歷時30min。在室溫攪拌2h後，lcms未見任何變化。將該反應在50℃攪拌過夜。lcms顯示大部分為所需產物。將該反應冷卻至室溫，真空蒸發至幹，溶於etoac中，用1nna2co3，鹽水洗滌，乾燥(na2so4)，過濾並蒸發至幹。將該殘餘物用矽膠色譜純化(iscorfgold80g，10-40％etoac的己烷溶液)。將純級分合併並真空蒸發至幹，得到5-(1-(1-(苯甲醯基氧基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(0.64g，1.602mmol，60.8％產率)，其為白色泡沫。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.06(s，1h)，8.04-8.01(m，2h)，7.62-7.56(m，1h)，7.50-7.43(m，2h)，3.87(s，3h)，3.61(br.s.，1h)，3.42(br.s.，1h)，3.02(br.s.，1h)，2.85(br.s.，2h)，2.60(br.s.，1h)，2.38(br.s.，4h)，2.30(br.s.，3h)，0.97(t，j＝7.5hz，3h)。ms(es)[m+h]+400.2。
b)n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-羥基哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
向5-(1-(1-(苯甲醯基氧基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(0.64g，1.602mmol)在meoh(25ml)中的攪拌溶液中加入5nnaoh(2.0ml，10.00mmol)。將該反應在70℃加熱16h。將該反應真空濃縮以除去meoh，然後用6nhcl(1.7ml)中和。形成白色固體混懸液。將該混合物真空蒸發，得到粗製去苯甲醯化的甲酸，其為灰白色固體，其被苯甲酸汙染。
向上述物質中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1h)-酮鹽酸鹽(0.604g，3.20mmol)、dcm(40ml)和nmm(0.352ml，3.20mmol)。將該固體塊用攪拌棒弄碎。向攪拌的混懸液中加入edc游離鹼(0.547g，3.52mmol)。將該反應在室溫攪拌2h，然後在40℃加熱4h。lcms顯示所需產物，其為o-苯甲醯化衍生物(注意：反應混合物中存在的苯甲酸導致重新苯甲醯化)和其他雜質。將該渾濁溶液通過硅藻土墊過濾並用少量的dcm衝洗。將澄清濾液濃縮並用矽膠色譜純化(iscorfgold40g，0-10％etoh的etoac溶液)。將含有o-苯甲醯化產物的級分合併並蒸發至幹。將該殘餘物溶於meoh(25ml)中並用5nnaoh(1.5ml)處理。將該反應在70℃加熱過夜。將該反應用6nhcl(1.3ml)中和並真空蒸發至幹。將該殘餘物溶於dcm中，用nahco3水溶液洗滌，乾燥(na2so4)，過濾並真空濃縮。將該殘餘物用矽膠色譜純化(iscorfgold40g，10-20％etoh的etoac溶液)，得到n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(1-羥基哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺(251mg，0.604mmol，37.7％產率)，其為白色固體。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ11.49(br.s.，1h)，8.02(t，j＝5.1hz，1h)，7.97(s，1h)，7.79(s，1h)，5.87(s，1h)，4.24(d，j＝4.8hz，2h)，3.16(br.s.，1h)，2.98(br.s.，1h)，2.73-2.66(m，1h)，2.42-2.32(m，1h)，2.31-2.17(m，2h)，2.18(s，3h)，2.11(s，3h)，2.07(br.s.，3h)，2.02(br.s.，1h)，1.92(br.s.，1h)，0.86(t，j＝7.5hz，3h)。ms(es)[m+h]+416.2。
實施例9
5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮
a)(z)-4-甲基-2-(2-硝基乙烯基)噻吩
將4-甲基噻吩-2-甲醛(10.0g，79.3mmol)、ch3no2(100ml)和nh4oac(1.1g，14.27mmol)的溶液在100℃加熱4h。將該反應冷卻至室溫並真空濃縮。將該殘餘物溶於etoac中，用1nhcl、nahco3水溶液、鹽水洗滌，乾燥(mgso4)，過濾並蒸發至幹。將該殘餘物用矽膠色譜純化(iscorfgold120g，0-15％etoac的己烷溶液)。將純級分合併並真空蒸發至幹，得到(z)-4-甲基-2-(2-硝基乙烯基)噻吩(9.63g，56.91mmol，71.8％產率)，其為黃色油(在真空下固化)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.10(d，j＝13.4hz，1h)，7.47(d，j＝13.4hz，1h)，7.27(s，1h)，7.17(s，1h)，2.31(d，j＝0.8hz，3h)。ms(es)[m+h]+170.0。
b)(2-(4-甲基噻吩-2-基)乙基)氨基甲酸乙酯
在氮氣下，向2nlibh4溶液(120ml，240mmol)中滴加tmscl(60ml，473mmol)，歷時10min。該反應變成白色混懸液。攪拌15min後，緩慢滴加(z)-4-甲基-2-(2-硝基乙烯基)噻吩(9.60g，56.74mmol)在thf(50ml)中的溶液，歷時約20min。觀察到劇烈的冒泡。該反應變得微熱至可觸摸，然後在冰浴中冷卻，同時定時加冰。將該反應在室溫攪拌4h，然後溫熱至50℃並攪拌過夜。將該反應在冰浴中冷卻並小心地用meoh(200ml)淬滅。攪拌1h後，將該反應真空濃縮，得到粗製2-氨基乙基-4-甲基噻吩。ms(es)[m+h]+142.1。
向粗製的2-氨基乙基-4-甲基噻吩在dcm(200ml)和水(100ml)中的冷卻(0℃)溶液中緩慢滴加na2co3(25g，235.9mmol)和etococl(0.710ml，7.39mmol)。將所得混合物溫熱至室溫並攪拌1h。將該反應通過硅藻土墊過濾並將澄清濾液轉移到分液漏鬥中。將較低的有機相除去，乾燥(mgso4)，過濾並真空濃縮。將該殘餘物用矽膠色譜純化(iscorfgold120g，10-30％etoac的己烷溶液)。將純級分合併並真空蒸發至幹，得到(2-(4-甲基噻吩-2-基)乙基)氨基甲酸乙酯(9.29g，43.55mmol，76.7％產率)，其為無色油。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ6.74(s，1h)，6.66(s，1h)，4.80(br.s.，1h)，4.14(q，j＝6.9hz，2h)，3.46(q，j＝6.3hz，2h)，2.98(t，j＝6.6hz，2h)，2.24(d，j＝0.8hz，3h)，1.26(t，j＝7.1hz，3h)。ms(es)[m+h]+214.1。
c)3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮
向(2-(4-甲基噻吩-2-基)乙基)氨基甲酸乙酯(9.20g，43.13mmol)中加入pocl3(100ml，107mmol)和p2o5(14g，98.6mmol)。將該混合物加熱回流3h(該混合物暫時地形成膠狀沉澱物，其最終通過加熱溶解)。將該深色反應混合物冷卻至室溫並真空蒸發至幹。將該殘餘物小心地用冰淬滅，用na2co3水溶液鹼化，用dcm萃取，乾燥(na2so4)，過濾並真空濃縮。將該殘餘物用矽膠色譜純化(iscorfgold80g，30-80％etoac的己烷溶液)。將純級分合併並真空蒸發至幹，用己烷研磨，過濾和真空乾燥，得到3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮(2.22g,13.27mmol，30.78％產率)，其為灰白色固體。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ6.72(m，1h)，5.75(br.s.，1h)，3.62(t，j＝6.2hz，2h)，3.05(t，j＝6.7hz，2h)，2.50(d，j＝1.3hz，3h)。ms(es)[m+h]+168.0。
d)3-甲基-2-丙醯基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮
向3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮(1.6g，9.57mmol)在ch3no2(50ml)中的溶液中加入liclo4(1.23mg，11.57mmol)、丙酸酐(3.08ml，20.12mmol)和in(otf)3(308mg，0.547mmol)。將該反應在70℃加熱4h。將該反應冷卻至室溫，用水(200ml)稀釋，用dcm(100ml)萃取，乾燥(na2so4)，過濾並真空蒸發至幹。將該殘餘物溶於meoh(200ml)中。向該混合物中加入k2co3(10.0g，72.4mmol)。將該反應在60℃加熱過夜。將該反應蒸發至幹，用1nhcl(150ml)酸化，用dcm萃取，乾燥(na2so4)，過濾並真空濃縮。將該殘餘物用矽膠色譜純化(iscorfgold80g，20-50％etoac的dcm溶液)(裝載在大量的dcm中)。將純級分合併，蒸發至幹，用己烷研磨，過濾和真空乾燥，得到3-甲基-2-丙醯基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮(2101.59g，7.12mmol，74.4％產率)，其為亮黃色固體。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ5.97(br.s.，1h)，3.63(t，j＝6.6hz，2h)，3.08(t，j＝6.7hz，2h)，2.88(s，3h)，2.87(q，j＝7.3hz，2h)，1.23(t，j＝7.2hz，3h)。ms(es)[m+h]+224.1。
e)2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮
向3-甲基-2-丙醯基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮(280mg，1.254mmol)和n,n-二甲基哌啶-4-胺(325mg，2.53mmol)中加入ti(oipr)4(0.80ml，2.73mmol)和苯(3ml)。將該反應在80℃攪拌18h。將該反應用meoh(3ml)稀釋，然後分兩批加入nabh3cn(315mg，5.02mmol)，歷時2h。將該反應在60℃加熱並再攪拌2h。將該反應真空蒸發至幹，溶於(9:1)dcm/meoh(15ml)中並用1nna2co3(10ml)處理。將所得混懸液攪拌30min。將該混懸液通過硅藻土墊過濾(緩慢地)並用(9:1)dcm/meoh(5ml)漂洗。將澄清濾液轉移至分液漏鬥中。將較低的有機相除去，乾燥(na2so4)，過濾並真空濃縮。將該殘餘物用矽膠色譜純化(iscorfgold40g，5-20％(5％nh4oh/meoh)的dcm溶液)。將純級分合併並蒸發至幹，得到2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮(360mg，1.019mmol，81％產率)，其為無色油。(在真空下固化成白色固體泡沫)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ5.59(br.s.，1h)，3.69(dd，j＝4.7，9.5hz，1h)，3.59(dt，j＝2.8，6.8hz，2h)，3.18-3.07(m，1h)，3.01(t，j＝6.8hz，2h)，2.97-2.93(m，1h)，2.44(s，3h)，2.29(s，6h)，2.17-1.88(m，4h)，1.88-1.72(m，2h)，1.70-1.39(m，3h)，0.81(t，j＝7.3hz，3h)。ms(es)[m+h]+336.3。
f)5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮
在氮氣氛下，向2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮(350mg，1.043mmol)在dmf(5ml)中的冷卻(0℃)溶液中滴加1nkotbu的thf溶液(1.3ml，1.30mmol)。將該混合物攪拌5min，然後一次性加入2-(苄基氧基)-3-(氯甲基)-4,6-二甲基吡啶(350mg，1.337mmol)的thf(1ml)溶液。在0℃攪拌15min後，將該混合物用飽和nh4cl(1.5ml)淬滅並真空蒸發至基本幹。將該殘餘物用na2co3水溶液(5ml)稀釋，用dcm萃取，乾燥(na2so4)，過濾並蒸發至幹。將該殘餘物用矽膠色譜純化(iscorfgold40g，0-15％(5％nh4oh/meoh)的dcm溶液)。將純級分合併並真空蒸發至幹，得到5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮(530mg，0.945mmol，91％產率)，其為白色固體。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.51-7.43(m，2h)，7.41-7.30(m，3h)，6.64(s，1h)，5.43(s，2h)，4.87-4.74(m，2h)，3.68(dd，j＝4.7，9.5hz，1h)，3.38(t，j＝6.8hz，2h)，3.10(d，j＝10.9hz，1h)，2.95(dd，j＝2.3，11.1hz，1h)，2.71(t，j＝6.8hz，2h)，2.46(s，3h)，2.44(s，3h)，2.35(s，3h)，2.29(s，6h)，2.17-1.88(m，4h)，1.79(t，j＝15.3hz，2h)，1.69-1.38(m，3h)，0.80(t，j＝7.3hz，3h)。ms(es)[m+h]+561.4。
g)5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮
向5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮(530mg，0.945mmol)中加入tfa(10ml，130mmol)。將該溶液加熱至45℃並攪拌3h。將該反應真空蒸發至幹。將該殘餘物用1nna2co3(5ml)鹼化，用dcm萃取，乾燥(na2so4)，過濾並真空濃縮。將該殘餘物用矽膠色譜純化(iscorfgold40g，10-20％(5％nh4oh/meoh)的dcm溶液)。將純級分合併，蒸發至幹，用己烷研磨，過濾和真空乾燥，得到5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮(520mg，1.050mmol)，其為白色固體。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ11.54(br.s.，1h)，5.88(s，1h)，4.54-4.42(m，2h)，3.71(dd，j＝5.2，8.7hz，1h)，3.50(t，j＝6.7hz，2h)，3.07(d，j＝10.1hz，1h)，2.89(d，j＝10.1hz，1h)，2.85(t，3h)，2.68(br.s.，1h)，2.51(s，6h)(隱藏在dmso峰下)，2.36(s，3h)，2.16(s，3h)，2.12(s，3h)，2.04-1.76(m，5h)，1.59-1.34(m，3h)，0.75(t，j＝7.2hz，3h)。ms(es)[m+h]+471.3。
實施例10
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-羥基環己亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
a)5-(1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
通過短冷凝器向鋅(12.60g，193mmol)在thf(150ml)中的冷卻(0℃)混懸液中滴加ticl4(10.26ml，93mmol)。將該混合物加熱回流2h。將該混合物冷卻至室溫並加入4-甲基-5-丙醯基噻吩-3-甲酸甲酯(3g，14.13mmol)、1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-酮(6.62g，42.4mmol)和吡啶(12.00ml，148mmol)在thf(30ml)中的溶液。將該反應混合物加熱回流20h。將該混合物冷卻至室溫，用水(100ml)和etoac(150ml)處理並通過短硅藻土墊過濾。將該藍色固體用etoac洗滌。收集濾液有機層，乾燥(na2so4)並濃縮。將該殘餘物使用柱色譜純化(矽膠，0-60％etoac/己烷)，得到5-(1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸烷-8-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(1.71g，36％)，其為無色油。ms(es)[m+h]+337.2
b)4-甲基-5-(1-(4-氧代環己亞基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯
向5-(1-(1,4-二氧雜螺[4.5]癸烷-8-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(1.5g，4.46mmol)在1,4-二噁烷(20ml)中的溶液中加入6nhcl(5.94ml，35.7mmol)。將該混合物在室溫攪拌18h。將該混合物濃縮並將該殘餘物用10％nahco3處理並用etoac(3x)萃取。將萃取物乾燥(na2so4)並濃縮。將該殘餘物使用柱色譜純化(矽膠，0-70％etoac/己烷)，得到4-甲基-5-(1-(4-氧代環己亞基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯(1.1g)，其為無色油。ms(es)[m+h]+293.2
c)5-(1-(4-羥基環己亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-甲基-5-(1-(4-氧代環己亞基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯(110mg，0.376mmol)在meoh(2ml)中的溶液中加入3-甲氧基氮雜環丁烷鹽酸鹽(60.4mg，0.489mmol)、diea(0.085ml，0.489mmol)和acoh(0.043ml，0.752mmol)。將該混合物在室溫攪拌20min，此時加入nabh3cn(70.9mg，1.129mmol)。將該混合物在室溫攪拌18h。lcms未監測到反應。將該混合物加熱至50℃持續6h。lcms顯示沒有所需產物，而是顯示出還原的環己醇。將該混合物用10％nahco3淬滅並用etoac(3x)萃取。將該萃取物乾燥(na2so4)並濃縮。將該殘餘物使用柱色譜純化(矽膠，0-60％etoac/己烷)，得到5-(1-(4-羥基環己亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(36mg)，其為灰白色固體。ms(es)[m+h]+295.2
d)n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-羥基環己亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
向5-(1-(4-羥基環己亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(35mg，0.119mmol)在meoh(2ml)中的溶液中加入naoh(0.074ml，0.594mmol)。將該混合物在40℃加熱18h。將該混合物用hcl(0.099ml，0.594mmol)處理並濃縮。將該殘餘物真空乾燥並用二甲基亞碸(2.000ml)處理。向該混合物中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1h)-酮鹽酸鹽(29.2mg，0.155mmol)、nmm(0.078ml，0.713mmol)、edc(45.6mg，0.238mmol)和hoat(32.4mg，0.238mmol)。將該混合物在室溫攪拌18h。將該反應混合物用水(10ml)淬滅並將所得沉澱物通過過濾收集和真空乾燥，得到n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(1-(4-羥基環己亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺(45mg，88％)，其為灰白色固體。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ0.87(t，j＝7.45hz，3h)，1.10-1.50(m，2h)，1.60-1.90(m，3h)，1.96-2.30(m，13h)，3.66(m，1h)，4.24(d，j＝5.05hz，2h)，4.54(d，j＝4.04hz，1h)，5.87(s，1h)，7.70-7.82(m，1h)，7.92-8.11(m，1h)。ms(es)[m+h]+415.2
實施例11
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基)丙基)噻吩-3-甲醯胺
根據實施例4的操作，製備外消旋n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基)丙基)噻吩-3-甲醯胺(117.7mg，0.243mmol，47.8％產率)，其為白色固體。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ11.47(s，1h)，7.98(t，j＝5.05hz，1h)，7.69(s，1h)，5.86(s，1h)，4.23(d，j＝5.05hz，2h)，3.07(d，j＝10.36hz，2h)，2.90(br.s.，1h)，2.83(d，j＝10.36hz，1h)，2.64-2.77(m，1h)，2.26(s，1h)，2.15-2.20(m，6h)，2.11(s，3h)，1.82(br.s.，2h)，1.03-1.42(m，6h)，0.69(t，j＝7.20hz，3h)。ms(es)[m+h]+484.3。
實施例12
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(噁唑-2-基甲基)哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲醯胺
a)4-甲基-5-(1-(1-(噁唑-2-基甲基)哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯
向4-甲基-5-(1-(哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯鹽酸鹽(60mg，0.190mmol)在meoh(2ml)中的溶液中加入噁唑-2-甲醛(23.97mg，0.247mmol)、diea(0.043ml，0.247mmol)和acoh(0.023ml，0.399mmol)。將該混合物攪拌20min，此時加入nabh3cn(47.7mg，0.760mmol)。將該混合物在室溫攪拌18h。將該混合物用10％nahco3淬滅並用etoac(3x)萃取。將該萃取物乾燥(na2so4)並濃縮。將該殘餘物使用柱色譜純化(矽膠，0-80％etoac/己烷)，得到4-甲基-5-(1-(1-(噁唑-2-基甲基)哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯(49mg)，其為無色油。ms(es)[m+h]+361.2。
b)n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(噁唑-2-基甲基)哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲醯胺
根據實施例1c的一般操作，製備n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(噁唑-2-基甲基)哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲醯胺(27mg，42％產率)。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ0.85(t，j＝7.45hz，3h)，1.71-1.80(m，1h)，1.93(t，j＝5.43hz，2h)，2.05(s，3h)，2.11(s，3h)，2.18(s，3h)，2.19-2.45(m，5h)，3.52-3.75(m，3h)，4.23(d，j＝5.05hz，2h)，5.86(s，1h)，7.16(d，j＝0.76hz，1h)，7.78(s，1h)，7.93-8.15(m，2h)。ms(es)[m+h]+481.3。
實施例13
n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(嘧啶-2-基)哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲醯胺
a)4-甲基-5-(1-(1-(嘧啶-2-基)哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯
向4-甲基-5-(1-(哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯鹽酸鹽(98mg，0.310mmol)在1,4-二噁烷(3ml)中的溶液中加入2-氯嘧啶(42.6mg，0.372mmol)和k2co3(51.5mg，0.372mmol)。將該混合物加熱回流18h。將該混合物過濾並濃縮。將該殘餘物使用柱色譜純化(矽膠，0-100％etoac/己烷)，得到4-甲基-5-(1-(1-(嘧啶-2-基)哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲酸甲酯(84mg)，其為灰白色固體。ms(es)[m+h]+358.2。
b)n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(嘧啶-2-基)哌啶-4-亞基)丙基)噻吩-3-甲醯胺
根據實施例1c的一般操作，製備n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基-5-(1-(1-(嘧啶-2-基)哌啶-4-亞基丙基)噻吩-3-甲醯胺(91mg，80％產率)。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ0.85(t，j＝7.45hz，3h)，1.71-1.80(m，1h)，1.93(t，j＝5.43hz，2h)，2.05(s，3h)，2.11(s，3h)，2.18(s，3h)，2.19-2.45(m，5h)，3.52-3.75(m，3h)，4.23(d，j＝5.05hz，2h)，5.86(s，1h)，7.16(d，j＝0.76hz，1h)，7.78(s，1h)，7.93-8.15(m，2h)。ms(es)[m+h]+478.3。
實施例14
5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
根據實施例4的操作，製備外消旋5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺(109mg，0.234mmol)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ12.78(br.s.，1h)，7.43(s，1h)，7.38(t，j＝5.56hz，1h)，5.94-6.02(m，1h)，5.66-5.89(m，1h)，4.51(d，j＝5.81hz，2h)，2.78-3.06(m，2h)，2.60-2.77(m，3h)，2.39(s，3h)，2.27(s，6h)，1.98-2.19(m，2h)，1.81-1.97(m，2h)，1.30-1.48(m，4h)，0.67-0.94(m，4h)。ms(es)[m+h]+466.2。
實施例15
5-(1-(1-(n'-氰基-n-甲基甲脒基)哌啶-4-亞基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
a)5-(1-(1-(n』-氰基-n-甲基甲脒基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)亞丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.0g，2.63mmol)中加入hcl的1,4-二噁烷溶液(15ml，60.0mmol)。將該混合物在室溫攪拌30分鐘然後真空蒸發至幹成為固體泡沫。
向異硫氰酸甲酯(200mg，2.74mmol)在etoh(10ml)中的溶液中加入氰胺一鈉(180mg，2.81mmol)。將該混合物加熱回流(80℃油浴)3h，此時將其冷卻至室溫。向該混合物中加入上述胺鹽酸鹽在dmf中的溶液(5.0ml)。加入edc游離鹼(450mg，2.90mmol)並將該反應攪拌2h。將該反應混合物真空蒸發，溶於dcm中，用水洗滌，乾燥(na2so4)，過濾並真空濃縮。通過矽膠色譜純化該殘餘物(iscorfgold80g，0-10％etoh的etoac溶液)，得到5-(1-(1-(n』-氰基-n-甲基甲脒基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(0.72g，1.997mmol，76％產率)，其為白色固體泡沫。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.05(s，1h)，5.06-4.99(m，1h)，3.87(s，3h)，3.62(br.s.，2h)，3.38(br.s.，2h)，3.05(d，j＝4.8hz，3h)，2.59(t，j＝5.8hz，2h)，2.39-2.30(m，2h)，2.24(s，3h)，2.16(t，j＝5.9hz，2h)，0.94(t，j＝7.6hz，3h)。ms(es)[m+h]+361.2。
b)5-(1-(1-(n'-氰基-n-甲基甲脒基)哌啶-4-亞基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
向5-(1-(1-(n』-氰基-n-甲基甲脒基)哌啶-4-亞基)丙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(0.70g，1.942mmol)在meoh(20ml)中的溶液中加入5nnaoh(2.0ml，10.00mmol)。將該反應在70℃攪拌6h。將該反應真空濃縮，以除去meoh並用6nhcl(1.7ml)中和。形成白色膠狀固體混懸液。將該混合物真空蒸發，得到粗製甲酸(被nacl汙染)，其為灰白色固體。
向上述物質中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1h)-酮鹽酸鹽(500mg，2.65mmol)、dcm(30ml)、hoat(270mg，1.984mmol)和nmm(0.30ml，2.73mmol)。將該固體塊用攪拌棒弄碎。向該攪拌的混懸液中加入edc游離鹼(370mg，2.383mmol)。將該反應在室溫攪拌2h，然後在40℃攪拌4h。將該渾濁混合物通過硅藻土墊過濾並用少量的dcm衝洗。將澄清濾液濃縮並用矽膠色譜純化(iscorfgold80g，10-25％etoh的etoac溶液)。將純級分合併，蒸發至幹，用etoac研磨，己烷，過濾和真空乾燥，得到5-(1-(1-(n'-氰基-n-甲基甲脒基)哌啶-4-亞基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺(0.75g，1.56mmol，80％產率)，其為白色固體。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ11.48(br.s.，1h)，8.03(t，j＝4.8hz，1h)，7.81(s，1h)，7.20(q，1h)，5.87(s，1h)，4.24(d，j＝4.8hz，2h)，3.51(t，j＝5.2hz，2h)，3.32(br.s.，2h)，2.84(d，j＝4.5hz，3h)，2.47(t，j＝5.2hz，2h)，2.33-2.23(m，2h)，2.18(s，3h)，2.11(s，3h)，2.07(s，3h)，2.02-1.97(m，2h)，0.87(t，j＝7.5hz，3h)。ms(es)[m+h]+481.2。
實施例16
2-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮
a)4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)噻吩-3-甲酸甲酯
在氮氣下，向250ml帶有攪拌棒的圓底燒瓶中加入(1,5-環辛二烯)(甲氧基)銥(i)二聚體(0.955g，1.440mmol)。邊攪拌邊通過注射器加入4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷(23.28ml，161mmol)，然後加入4,4'-二-叔丁基-2,2'-聯吡啶(0.773g，2.88mmol)在正己烷(150ml)中的溶液。將該深色混合物攪拌1min，此時滴加4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(15g，96mmol)(放氣)。將該反應攪拌1.5h。將該反應真空蒸發至幹。將該殘餘物用矽膠色譜純化(iscorfgold330g，0-100％dcm/己烷，柱用3個柱體積的1％et3n的氯仿溶液預處理)，得到4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)噻吩-3-甲酸甲酯(19.5g，65.7mmol，68.4％產率)，其為亮棕色油，其一旦靜置則固化。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.32(s，1h)，3.87(s，3h)，2.70(s，3h)，1.36(s，12h)。ms(es)[m+h]+283.2。
b)(z)-4-(1-(3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氫噻吩並[3,2-c]吡啶-2-基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
向3-甲基-2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮(0.82g，2.80mmol)和(z)-4-(1-(((三氟甲基)磺醯基)氧基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.044g，2.80mmol)在1,4-二噁烷(30ml)中的溶液中加入水(10ml)和na2co3(0.741g，6.99mmol)。將該溶液脫氣並加入pd(pph3)4(0.162g，0.140mmol)。將該反應混合物在70℃加熱1h。將該混合物用etoac(100ml)稀釋並過濾。分離各層並將有機物用鹽水洗滌，用mgso4乾燥，過濾並蒸發。將黑色殘餘物用純化(50–100％etoac:己烷)，得到(z)-4-(1-(3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氫噻吩並[3,2-c]吡啶-2-基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(950mg，2.433mmol，87％產率)，其為無色油。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ5.73-5.86(m，1h)，5.66(br.s.，1h)，4.15(br.s.，2h)，3.63(t，j＝6.69hz，2h)，3.03(t，j＝6.69hz，2h)，2.67(t，j＝13.01hz，2h)，2.25(s，3h)，1.64-1.80(m，3h)，1.49-1.53(m，3h)，1.44-1.47(m，9h)，1.30-1.41(m，2h)。ms(es)[m+na]+413.2。
c)4-(1-(3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氫噻吩並[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
向(z)-4-(1-(3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氫噻吩並[3,2-c]吡啶-2-基)丙-1-烯-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(950mg，2.433mmol)在etoh(30ml)中的脫氣(氮氣)溶液中加入10％pd/c(degussa，1.5g，1.410mmol)。將該反應混合物在氫氣氛下(氣球)攪拌過夜。將該反應混合物過濾並濃縮，得到4-(1-(3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氫噻吩並[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(850mg，2.057mmol，85％產率)，其為白色固體。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ5.77(br.s.，1h)，3.98-4.29(m，2h)，3.61(t，j＝6.82hz，2h)，3.01(t，j＝6.69hz，2h)，2.65-2.77(m，2h)，2.51-2.62(m，1h)，2.39(s，3h)，2.11(d，j＝12.88hz，1h)，1.81-1.95(m，2h)，1.36-1.61(m，11h)，1.02-1.20(m，2h)，0.79(t，j＝7.33hz，3h)。ms(es)[m+na]+415.2
d)4-(1-(5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氫噻吩並[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在氮氣氛下，向4-(1-(3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氫噻吩並[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(850mg，2.165mmol)在dmf(10ml)中的冷卻(0℃冰浴)溶液中滴加1nkotbu的thf(2.81ml，2.81mmol)。將該混合物攪拌5min，此時加入2-(苄基氧基)-3-(氯甲基)-4,6-二甲基吡啶(737mg，2.81mmol)在thf(5ml)中的溶液。將該混合物在0℃攪拌15min。將該混合物用飽和nh4cl(5ml)淬滅。將該混合物用水和etoac稀釋。分離各層並將有機物用水，鹽水洗滌，用mgso4乾燥，過濾並蒸發至幹。將該殘餘物用矽膠色譜純化(iscorfgold40g，10-30％(etoac：己烷)，得到4-(1-(5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氫噻吩並[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.2g，1.845mmol，85％產率)，其為白色固體。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.45-7.51(m，2h)，7.29-7.41(m，4h)，6.65(s，1h)，5.46(s，2h)，4.80(s，2h)，3.84-4.28(m，2h)，3.38(t，j＝6.69hz，2h)，2.70(t，j＝6.69hz，4h)，2.46(s，3h)，2.40(s，3h)，2.37(s，3h)，1.88(dd，j＝4.04，7.33hz，2h)，1.32-1.58(m，12h)，1.01-1.21(m，2h)，0.78(t，j＝7.33hz，3h)。ms(es)[m+h]+618.4。
e)5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-2-(1-(哌啶-4-基)丙基)-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮
向4-(1-(5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氫噻吩並[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(900mg，1.457mmol)在1,4-二噁烷(10ml)中的冷卻(10℃)溶液中加入4mhcl的1,4-二噁烷溶液(3ml，12.00mmol)。將該反應混合物維持在10℃，歷時1h。將該反應通過lcms監測。1h後，加入額外的4mhcl的1,4-二噁烷溶液(3ml，12.00mmol)。一旦起始原料耗盡，將該反應混合物用6mnaoh(ph～9)中和並用dcm萃取。將有機層用鹽水洗滌，用mgso4乾燥，過濾並蒸發。將該殘餘物通過柱色譜純化(30％[5％nh4oh/meoh]：70％dcm)，得到5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-2-(1-(哌啶-4-基)丙基)-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮(450mg，0.826mmol，56.7％產率)，其為白色固體。1hnmr(400mhz，meoh-d4)δ7.42(dd，j＝1.64，7.96hz，2h)，7.25-7.34(m，3h)，6.72(s，1h)，5.42(s，2h)，4.77(s，2h)，3.34-3.38(m，2h)，3.06(d，j＝12.38hz，1h)，2.96(d，j＝12.38hz，1h)，2.73-2.80(m，1h)，2.66-2.72(m，2h)，2.56(dt，j＝2.78，12.38hz，1h)，2.46(dt，j＝2.65，12.44hz，1h)，2.40(s，3h)，2.36(s，3h)，2.34(s，3h)，1.88-2.05(m，2h)，1.31-1.61(m，3h)，1.03-1.28(m，2h)，0.79(t，j＝7.33hz，3h)
ms(es)[m+h]+518.3。
f)2-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮
向2,2-二氟丙-1-醇(193mg，2.010mmol)和吡啶(0.163ml，2.010mmol)在ch3cn(20ml)中的冷卻(0℃)溶液中滴加tf2o(0.312ml，1.849mmol)。將該反應維持在0℃，歷時30min。
向5-((2-(苄基氧基)-4,6-二甲基吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-2-(1-(哌啶-4-基)丙基)-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮(208mg，0.402mmol)和k2co3(500mg，3.62mmol)在ch3cn(20ml)中的混懸液中加入上述冷卻的反應混合物(含有三氟甲磺酸2,2-二氟丙酯)。將該反應溫熱至室溫，然後加熱至50℃過夜。將該反應過濾並真空蒸發至幹。將該殘餘物溶於etoac中並將所得溶液用水和鹽水洗滌，乾燥(mgso4)，過濾並真空濃縮，得到油。
將上述油在tfa(5ml，64.9mmol)中的溶液保持30min，之後將其濃縮。將該反應混合物用製備型hplc純化(5-60％mecn:水，含0.1％甲酸)。將含有產物的級分用6mhcl(0.5ml)處理並濃縮，得到2-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮(90mg，0.169mmol，42.1％產率)，其為白色固體。1hnmr(400mhz，meoh-d4)δ7.07(s，1h)，4.82(s，2h)，3.88-3.99(m，2h)，3.72-3.86(m，3h)，3.65(d，j＝12.63hz，1h)，3.07-3.27(m，4h)，2.80-2.91(m，1h)，2.69(s，3h)，2.54(s，3h)，2.40(s，2h)，2.27(d，j＝14.15hz，1h)，2.00(ddd，j＝3.79，7.20，13.52hz，1h)，1.57-1.89(m，7h)，1.47(ddd，j＝7.07，11.18，13.58hz，1h)，0.80(t，j＝7.33hz，3h)。ms(es)[m+h]+506.3。
實施例17
5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(1-(2-氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮
根據實施例16的操作，製備5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-(1-(1-(2-氟丙基)哌啶-4-基)丙基)-3-甲基-6,7-二氫噻吩並[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮(110mg，0.199mmol)。1hnmr(400mhz，meoh-d4)δ7.07(s，1h)，5.11-5.38(m，1h)，4.82(s，2h)，3.87-4.03(m，2h)，3.56-3.81(m，2h)，3.36-3.42(m，4h)，3.22-3.31(m，1h)，3.15(t，j＝6.95hz，2h)，2.92-3.10(m，2h)，2.80-2.91(m，1h)，2.69(s，3h)，2.54(s，3h)，2.40(s，3h)，2.22-2.33(m，1h)，2.00(ddd，j＝3.79，7.33，13.64hz，1h)，1.48-1.88(m，4h)，1.35-1.46(m，3h)，0.80(t，j＝7.20hz，3h)。ms(es)[m+h]+488.3。
實施例18
n'-氰基-4-(1-(5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氫噻吩並[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)-n-甲基哌啶-1-甲脒
根據實施例15和16的操作，製備n'-氰基-4-(1-(5-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-3-甲基-4-氧代-4,5,6,7-四氫噻吩並[3,2-c]吡啶-2-基)丙基)-n-甲基哌啶-1-甲脒(35mg，0.065mmol)。1hnmr(400mhz，meoh-d4)δ11.53(s，1h)，7.13(d，j＝4.8hz，1h)，5.87(s，1h)，4.48(s，2h)，3.98(d，j＝12.6hz，1h)，3.89(d，j＝12.9hz，1h)，3.50(t，j＝6.7hz，2h)，2.64-2.89(m，8h)，2.28-2.33(m，3h)，2.15(s，3h)，2.12(s，3h)，1.87(d，j＝11.4hz，2h)，1.52-1.64(m，1h)，1.25-1.42(m，2h)，1.12-1.20(m，1h)，1.00-1.09(m，1h)，0.71(t，j＝7.2hz，3h)。ms(es)[m+h]+509.0。
實施例19
5-(1-(1-(n'-氰基-n-甲基甲脒基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
根據實施例4和15的操作，製備5-(1-(1-(n'-氰基-n-甲基甲脒基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺(49mg，0.096mmol)。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ11.46(br.s.，1h)，7.98(t，j＝4.9hz，1h)，7.64-7.73(m，1h)，7.13(q，j＝4.3hz，1h)，5.86(s，1h)，4.22(d，j＝5.1hz，2h)，3.98(d，j＝13.4hz，1h)，3.88(d，j＝13.1hz，1h)，2.64-2.87(m，5h)，2.18(d，j＝2.5hz，6h)，2.11(s，3h)，1.80-1.92(m，2h)，1.55-1.66(m，1h)，1.29-1.43(m，2h)，0.91-1.19(m，3h)，0.70(t，j＝7.3hz，3h)。ms(es)[m+h]+483。
實施例20
5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-亞基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
根據實施例2的一般操作，製備5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-亞基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ11.48(s，1h)，8.02(t，j＝5.05hz，1h)，7.79(s，1h)，5.95-6.32(m，1h)，5.86(s，1h)，4.23(d，j＝5.05hz，2h)，2.72(dt，j＝4.29，15.66hz，2h)，2.60(br.s.，2h)，2.44(br.s.，2h)，2.35-2.41(m，2h)，2.21-2.31(m，2h)，2.18(s，3h)，2.11(s，3h)，2.07(s，3h)，1.93(t，j＝5.05hz，2h)，0.86(t，j＝7.45hz，3h)。ms(es)[m+h]+464.2。
實施例21
(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
根據實施例4的一般操作，製備(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)丙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ0.69(t，j＝7.20hz，3h)1.09-1.23(m，2h)1.25-1.39(m，3h)1.75-1.90(m，2h)1.93-2.02(m，1h)2.02-2.09(m，1h)2.11(s，3h)2.18(s，6h)2.56-2.74(m，3h)2.80(d，j＝11.12hz，1h)2.89(d，j＝11.62hz，1h)4.22(d，j＝5.05hz，2h)5.86(s，1h)6.06(t，j＝4.29hz，1h)7.68(s，1h)7.98(t，j＝5.05hz，1h)11.47(s，1h)。ms(es)[m+h]+466.2。
實施例22
(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
a)4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)噻吩-3-甲酸甲酯
向裝有(1,5-環辛二烯)(甲氧基)銥(l)二聚體(325mg，0.490mmol)的100-ml圓底燒瓶中邊攪拌邊加入4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷(7.10g，55.5mmol)，然後加入4,4'-二-叔丁基-2,2'-二吡啶(260mg，0.969mmol)在正己烷(35ml)中的溶液。將該混合物在室溫攪拌2min並滴加4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(5g，32mmol)。將該混合物在室溫攪拌18h。然後將該反應混合物濃縮並將該殘餘物使用柱色譜純化(矽膠，0-100％dcm/己烷)，得到5.8g的產物，其為無色油。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ1.36(s，12h)，2.70(s，3h)，3.87(s，3h)，8.32(s，1h)。ms(es)[m+h]+283.1。
b)4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)乙烯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
向4-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)噻吩-3-甲酸甲酯(2.65g，9.39mmol)在1,4-二噁烷(72ml)中的溶液中加入4-(1-(((三氟甲基)磺醯基)氧基)乙烯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(3.38g，9.39mmol)、na2co3(2.489g，23.48mmol)和水(24ml)。將該混合物通過鼓入氮氣脫氣10min。加入pd(pph3)4(0.543g，0.470mmol)並將該混合物在70℃加熱1h。將該反應混合物冷卻至室溫並用etoac(3x)萃取。將該合併的萃取物乾燥(na2so4)並濃縮。將該殘餘物使用柱色譜純化(矽膠，0-40％etoac/己烷)，得到2.8g產物，其為無色油。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ1.27-1.55(m，11h)，1.78(m，2h)，2.26-2.46(m，4h)，2.71(t，j＝11.49hz，2h)，3.87(s，3h)，4.18(br.s.，2h)，5.13(s，1h)，5.29-5.39(m，1h)，8.02(s，1h)。ms(es)[m+h]+388.1。
c)(r)-4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
將4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)乙烯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.2g，3.28mmol)和((4r,5r)-(+)-o-[1-苄基-1-(5-甲基-2-苯基-4,5-二氫噁唑-4-基)-2-苯基乙基](二環己基膦氧基)(1,5-cod)銥(i)四(3,5-二(三氟甲基)苯基硼酸鹽(63mg，36μmol)在dcm(50ml)中的溶液在50psi氫氣壓下在parr振蕩器上氫化30h。將該混合物濃縮並將該殘餘物使用柱色譜純化(矽膠，0-40％etoac/己烷)，得到(r)-4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.1g)，其為無色油。通過手性hplc測定產物的光學純度為98％e.e.(chiralpakay-h，5微米，4.6mmx150mm；245，250nmuv；90：10：0.1正庚烷：etoh：異丙胺，等梯度，1.0ml/min)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ1.03-1.33(m，5h)，1.38-1.58(m，11h)，1.88(d，j＝12.38hz，1h)，2.37(s，3h)，2.48-2.77(m，2h)，2.94(quin，j＝7.26hz，1h)，3.85(s，3h)，4.05-4.15(m，1h)，7.97(s，1h)。ms(es)[m+h]+390.2。
d)(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯
向(r)-4-(1-(4-(甲氧基羰基)-3-甲基噻吩-2-基)乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(85mg，0.231mmol)在dcm(2ml)中的溶液中加入4nhcl的1,4-二噁烷溶液(0.289ml，1.156mmol)。將該混合物保持在室溫4h。將該混合物濃縮並將該殘餘物真空乾燥。然後將該殘餘物用ch3cn(2ml)稀釋。向該混合物中加入三氟甲磺酸2,2-二氟乙基酯(163mg，0.763mmol)和cs2co3(173mg，0.532mmol)。將該混合物在50℃加熱2h。將該混合物冷卻，用dcm稀釋並過濾。將該濾液濃縮並將該殘餘物使用柱色譜純化(矽膠，0-50％etoac/己烷)，得到(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(68mg)，其為無色油。
e)(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
向(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-4-甲基噻吩-3-甲酸甲酯(68mg，0.205mmol)在meoh(2ml)中的溶液中加入8nnaoh(0.14ml，1.120mmol)。將該混合物在40℃加熱18h。將該混合物用6nhcl(0.187ml，1.12mmol)處理並濃縮。將該殘餘物真空乾燥並用dmso(2ml)稀釋。向該混合物中加入3-(氨基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1h)-酮，鹽酸鹽(58.1mg，0.308mmol)、nmm(0.135ml，1.231mmol)、edc(79mg，0.410mmol)和hoat(55.9mg，0.410mmol)。將該混合物在室溫攪拌18h。將該反應混合物用水(10ml)淬滅並將所得沉澱物通過過濾收集並真空乾燥，得到(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺(49mg)，其為灰白色固體。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ1.08-1.38(m，7h)，1.76(m，1h)，1.92-2.14(m，5h)，2.18(m，6h)，2.64(td，j＝15.73，4.17hz，2h)，2.82(d，j＝11.87hz，1h)，2.86-2.97(m，2h)，4.17-4.30(m，2h)，5.86(s，1h),5.94-6.23(m，1h)，7.65(s，1h)，7.97(t，j＝5.05hz，1h)。ms(es)[m+h]+452.2。
實施例23
(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)乙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺
根據實施例22的一般操作，製備(r)-5-(1-(1-(2,2-二氟丙基)哌啶-4-基)乙基)-n-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-4-甲基噻吩-3-甲醯胺。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ1.09-1.39(m，7h)，1.58(t，j＝19.07hz，3h)，1.76(m，1h)，1.98-2.27(m，12h)，2.63(m，2h)，2.81(d，j＝12.13hz，1h)，2.91(m，2h)，4.17-4.28(m，2h)，5.86(s，1h)，7.65(s，1h)，7.97(t，j＝4.93hz，1h)。ms(es)[m+h]+466.3。
測試方案
評估本文包含的化合物抑制prc2複合物中ezh2的甲基轉移酶活性的能力。人prc2複合物是通過如下製備的：在sf9細胞中共表達5個成員蛋白(flag-ezh2、eed、suz12、rbap48、aebp2)的每一個，然後共純化。酶活性是通過閃爍迫近分析法(spa)測定的，其中將氚代甲基從3h-sam轉移至衍生自組蛋白h3的生物素化的、未甲基化的肽底物上的賴氨酸殘基上。肽在鏈親和素包被的spa珠上被捕獲並將所得信號在viewlux讀板器上讀取。
部分a.化合物的製備
1.將固體溶於100％dmso中製備10mm化合物儲備液。
2.在384孔板上，將各測試化合物溶於100％dmso以建立11個點的連續稀釋(1:4稀釋，最高濃度10mm)，第6欄和第18欄為dmso對照。
3.將10nl化合物從稀釋板分配至反應板(corning，384-孔聚苯乙烯nbs，cat#3673)。
部分b.試劑的製備
製備以下溶液：
1.1x基礎緩衝液，50mmtris-hcl，ph8，2mmmgcl2:每1l基礎緩衝液，混合1mtris-hcl，ph8(50ml)，1mmgcl2(2ml)和蒸餾水(948ml)。
2.1x測試緩衝液:每10ml1x測試緩衝液，混合1x基礎緩衝液(9.96ml)，1mdtt(40ul)，和10％吐溫-20(1ul)，得到終濃度為50mmtris-hcl，ph8，2mmmgcl2，4mmdtt，0.001％吐溫-20。
3.2x酶溶液:每10ml2x酶溶液，混合1x測試緩衝液(9.99ml)和3.24umezh25成員複合物(6.17ul)，得到最終酶濃度為1nm。
4.pa珠溶液:每1mlspa珠溶液，混合鏈親和素包被的spa珠(perkinelmer，cat#rpnq0261，40mg)和1x測試緩衝液(1ml)，得到工作濃度為40mg/ml。
5.2x底物溶液:每10ml2x底物溶液，混合40mg/mlspa珠溶液(375ul)、1mm生物素化的組蛋白h3k27肽(200ul)、12.5um3h-sam(240ul；1mci/ml)、1mm冷sam(57ul)和1x測試緩衝液(9.13ml)，得到終濃度為0.75mg/mlspa珠溶液、10um生物素化的組蛋白h3k27肽、0.15um3h-sam(～12uci/ml3h-sam)和2.85um冷sam。
6.2.67x淬滅溶液:每10ml2.67x淬滅溶液，混合1x測試緩衝液(9.73ml)和10mm冷sam(267ul)，得到終濃度為100um的冷sam。
部分c.在384孔grenierbio-one板上的測試反應
化合物的添加
1.將10nl/孔的1000x化合物分配至測試孔中(如上所述)。
2.將10nl/孔的100％dmso分配至第6和18欄(分別為高對照和低對照)。
測試
1.將5ul/孔的1x測試緩衝液分配至第18欄(低對照反應)。
2.將5ul/孔的2x底物溶液分配至第1-24欄(注:底物溶液應被混合以保證在分配至基質貯器之前為均勻的珠懸浮液)。
3.將5ul/孔的2x酶溶液分配至第1–17、19–24欄。
4.在室溫培養該反應60分鐘。
淬滅
1.將6ul/孔的2.67x淬滅溶液分配至第1-24欄。
2.密封測試板且以500rpm旋轉約1分鐘。
3.在viewlux儀器中將板暗適應15–60分鐘。
讀板
1.在viewlux讀板器上讀取測試板，其採用613nm的發射濾波器或濾光膜(300秒暴露)。
試劑的加入可採取手動或用自動液體處理器。
結果
對於每個化合物濃度，相對於dmso對照計算百分比抑制，並且使用abase數據擬合軟體包中的標準ic50擬合參數擬合所得值。
實施例化合物通常是根據上述或類似的測試進行測定的且發現它們是ezh2的抑制劑。根據該測試測定的具體生物活性列於下表。ic50值≤10nm是指化合物的活性接近該測試中的檢測限。重複測試流程可得到稍微不同的ic50值。