甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法
2023-12-03 03:33:01
專利名稱：甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種快速、準確、操作簡單的甘蔗宿根矮化病菌檢測方法，屬 植物保護領域。
背景技術：
甘蔗宿根矮化病RSD是普遍存在於所有植蔗地區的一種世界性的重要病害。 自1944 1945年在澳大利亞昆士蘭首次發現以來，己有美國、南非、模里西斯、 印度、巴西等47個國家和地區報導了該病的發生，遍布世界各蔗區。我國臺灣 省於1945年最先報導此病的發生，在大陸1986確診存在甘蔗宿根矮化病，之後 廣東、福建、廣西、雲南曾對全省蔗區進行普查，結果表明均存在此病。此病由 一種棒桿菌屬細菌寄生於蔗株的維管束中引起，主要通過帶病蔗種和收穫、砍種 刀具等傳播蔓延，且傳播性極強。蔗株染病後變矮，蔗莖變細，生長遲滯，宿根 發株少，在乾旱地區和種植感病品種的蔗區所造成的損失尤其重要，病害造成損 失的程度隨宿根年數的增加而增加， 一般減產10 30%，乾旱缺水時可達60%以 上，還可導致品種退化。RSD無明顯的外部和內部症狀，病原菌難以分離和培養， 傳統診斷方法極其困難，因而迫切需要建立一種簡便、快速、準確、實用的檢測 方法，以期為該病害的診斷和防治、脫毒種苗的生產、對外甘蔗品種/材料交換 檢疫檢測提供技術支撐。
目前，對甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法主要有剖莖檢測法、相差顯微鏡檢 測法和PCR法。但剖莖檢測法和相差顯微鏡檢測法準確性差、操作繁瑣、檢測靈 敏低，PCR法檢測體系不易穩定，因此不適合田間大批量樣品的快速檢測。
發明內容
本發明的目的是提出一種甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法，該方法克服了現 有檢測方法中的不足，簡便、快速、準確、操作簡單、適合田間大批量樣品檢
本發明包括以下步驟
1 、將待測樣品印在硝酸纖維素膜上獲得印跡斑；
2、把硝酸纖維素膜轉移至含O. 1%甘蔗宿根矮化病菌特異性抗血清的封閉緩 衝液中孵育；
3、 把硝酸纖維素膜轉移至含O. 01%鹼性磷酸酶標記抗體、1。/。脫脂奶粉的TBST 緩衝液中孵育；
4、 把硝酸纖維素膜轉入底物/緩衝液中顯色；
5、 結果判別硝酸纖維素膜顯色後組織斑上呈紫紅色即可確定檢測樣品中 有甘蔗宿根矮化病菌存在，組織斑不顯色則檢測樣品中沒有甘蔗宿根矮化病菌。
本發明的有益效果是能快速準確的檢測甘蔗宿根矮化病菌，檢測結果易於 目測判斷，且操作簡單，取樣少，節省勞力，結果可靠，不易受汙染，不需特 殊儀器，也不需特殊條件，適合于田間大批量樣品檢測。
具體實施例方式
1、 制樣和組織印跡取待測甘蔗樣品中下部莖節，用砍刀切成9 llcm長， 用轉子鑽出中間部分後再用鋒利刀片將其橫切成平面，用力將橫切面在硝酸纖
維素膜上垂直點壓10 15秒，獲得印跡斑；
2、 封閉將封閉緩衝液倒入裝有硝酸纖維素膜的培養皿裡，37"C下孵育 45min;
3、 TBST緩衝液快速洗膜1次倒去培養皿裡封閉緩衝液，加入TBST緩衝 液，使硝酸纖維素膜浸入其中，輕輕轉動幾下，再棄去TBST緩衝液。
4、 加抗體把硝酸纖維素膜浸入含0. 1%甘蔗宿根矮化病菌特異性抗血清和 1%脫脂奶粉的TBST緩衝液中，37"下孵育2h， TBST緩衝液洗膜3次，每次 3min;
5、 加酶標抗體把硝酸纖維素膜浸入含0. 01%鹼性磷酸酶標記抗體和1%脫 脂奶粉的TBST緩衝液中，37。C下孵育2h， TBST緩衝液洗膜4次，每次3min;
6、 加底物顯色把硝酸纖維素膜轉入底物/緩衝液BCIP/NBT 二片加20ml 雙蒸水溶解中顯色5 10min，取出後用蒸餾水衝洗，自然乾燥；
7、 結果判別肉眼觀察或顯微鏡觀察判別，感染甘蔗宿根矮化病菌的樣品 組織斑上呈紫紅色，不感染的組織斑上不顯色。
上述的TBST緩衝液由PH8. 0的Tris-HC16. 05g+NaCl 2. 92g+1000ml雙蒸水， 再按重量計加入0. 5mlTween20組成。
封閉緩衝液為TBST中按重量計加入5%脫脂奶粉。 所用的酶標抗體為羊抗兔鹼性磷酸酶標記抗體Goat Anti Robbit。 所用的底物BCIP/ NBT是5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氮藍四唑。
權利要求
1、一種甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法，其特徵在於按如下步驟進行1)、制樣和組織印跡取甘蔗中下部莖節，切成9～11cm長，取中間部分將其橫切成平面，將切面在硝酸纖維素膜上垂直點壓10～15秒，獲得印跡斑；2)、封閉將封閉緩衝液倒入裝有硝酸纖維素膜的培養皿裡，37℃下孵育45min，倒去培養皿裡封閉緩衝液，加入TBST緩衝液，使硝酸纖維素膜浸入其中，輕輕轉動幾下，再棄去TBST緩衝液；3)、加抗體把硝酸纖維素膜浸入含0.1％甘蔗宿根矮化病特異性抗血清和1％脫脂奶粉的TBST緩衝液中，37℃下孵育2h，再用TBST緩衝液洗膜3次，每次3min；4)加酶標抗體把硝酸纖維素膜浸入含0.01％鹼性磷酸酶標記抗體和1％脫脂奶粉的TBST緩衝液中，37℃下孵育2h，用TBST緩衝液洗膜4次，每次3min；5)加底物顯色把硝酸纖維素膜轉入底物/緩衝液BCIP/NBT二片加20ml雙蒸水溶解中顯色5～10min，取出後用蒸餾水衝洗，自然乾燥；6)結果判別肉眼觀察或顯微鏡觀察判別，感染甘蔗宿根矮化病菌的樣品組織斑上呈紫紅色，不感染的組織斑上不顯色。
2、 根據權利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法，其特徵在於TBST 緩衝液由PH8.0的Tris-HC16. 05g+NaCl 2. 92g+1000ml雙蒸水，再按重量計加 入0.5mlTween20。
3、 根據權利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法，其特徵在於封閉 緩衝液為TBST中按重量計加入5%脫脂奶粉。
4、 根據權利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌檢測方法，其特徵在於所用的 酶標抗體為羊抗兔鹼性磷酸酶標記抗體Goat Anti Robbit。
5、 根據權利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法，其特徵在於所用 的底物BCIP/ NBT是5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氮藍四唑。
全文摘要
一種甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法，1.將待測樣本組織斑印在硝酸纖維素膜上；2.分別依次把硝酸纖維素膜轉移至含0.1％甘蔗宿根矮化病特異性抗血清的封閉緩衝液中孵育；3.把硝酸纖維素膜轉移至含0.01％鹼性磷酸酶標記抗體、1％脫脂奶粉的TBST緩衝液中孵育；4.把硝酸纖維素膜轉入底物/緩衝液中顯色；5.結果判別硝酸纖維素膜顯色後組織斑上呈紫紅色即可確定檢測樣本中有甘蔗宿根矮化病菌存在，組織斑不顯色則檢測樣本中沒有甘蔗宿根矮化病菌；該方法能快速準確的檢測甘蔗宿根矮化病菌，檢測結果易於目測判斷，且操作簡單，取樣少，節省勞力，結果可靠，不易受汙染，不需特殊儀器，也不需特殊條件，適合于田間大批量樣品檢測。
文檔編號G01N21/77GK101363852SQ200810058999
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月27日 優先權日2008年9月27日
發明者盧文潔, 吳才文, 李文鳳, 羅志明, 黃應昆 申請人:雲南省農業科學院甘蔗研究所