具有抗愛滋病毒作用的冬凌草提取物及其應用的製作方法
2023-12-03 03:50:46 1
專利名稱：具有抗愛滋病毒作用的冬凌草提取物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及愛滋病防治藥物，具體涉及具有愛滋病毒抑制活性的天然植物藥提取物，更具體地涉及冬凌草提取物抗愛滋病毒的活性部位。
背景技術：
愛滋病是由其致病源愛滋病毒(HIV)引起的一種對人類健康造成巨大危害的傳染病，又稱世紀絕症。現已共識，要從根本上防治愛滋病，疫苗是最好的選擇。一個理想的疫苗應該是廣譜、高效、低毒、價廉。然而由於愛滋病毒的高度變異及強大的逃逸功能，使得疫苗的研究變得十分艱難，在可預見的將來，這樣的疫苗要獲得成功還有十分長的路要走。因此抗愛滋病毒藥物的研究並使其投向市場服務於感染病毒的患者是一個十分迫切的任務。
迄今為止，由美國FDA公布正式上市的抗愛滋病毒藥物為23個，包括三種類型a、病毒逆轉錄酶抑制劑；b、病毒蛋白酶的抑制劑；c、阻斷細胞與病毒融合的短肽(表1，見下頁)。
表1 抗逆轉錄病毒藥物
另有三十多個新的候選藥物分別在臨床I，II，III期開發中(表2)。
表2 開發中的抗HIV新藥物
臨床用藥的經驗表明，單個藥物的應用很容易對病毒產生耐藥性。根據患者的症狀選用不同類別的藥物進行組合的高效抗逆轉錄病毒療法(HAART)(俗稱「雞尾酒療法」)的發明及運用在很大程度上緩解了患者的發病進程，改善了生活品質，延長了生命。因此，擴大可選擇的新藥陣容是保證治療質量而面臨的新任務。參見如下文獻及網站的資料(這些文獻和資料均引入本說明書作為參考)1.Johnston MLHIV/AIDS疫苗開發——挑戰、進步和未來方向，Reviews in Medical Virology，6(3)123-140，1996。
2.www.ARAS.AB.CA/haart.html3.www.hivandhepatitis.com4.www.fdg.gov通常開發一個新藥至上市需要8～10年，資金達上億美元。一般情況下，一個患者的藥物花費每年在$8,000～12,000之間，個別藥物甚至高達$15,000～20,000。這對大部分普通患者來說是難以承受的，特別對發展中國家的患者來說，更是難以消受。這樣，另闢新徑，尋找一條適合發展中國家的創新藥物同樣迫切與重要。從天然植物藥的提取物中篩選抗HIV的有效成份或有效部位，使其最終成為新藥，是一條可能和可行的道路。同時也為這一領域的研究開闢了一條新路。
本發明者曾通過體外抗愛滋病毒試驗，從大量天然植物藥中篩選到具有愛滋病毒抑制活性的冬凌草。冬凌草為唇形科植物碎米椏(Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara)的乾燥地上部分。夏、秋二季採割，曬乾。本品莖呈方柱形，長80～70cm，表面紅褐色，有柔毛；質硬，斷面淡綠色或黃白色。頁對生，有柄；葉片皺縮，展平後呈卵形或寬卵形，長6.5～13cm，寬3～6cm；先端漸尖，基部寬楔形、截形或近心形，急縮下延至柄，邊緣有粗鋸齒；上表面綠棕色，有腺點，下表面綠色，沿葉脈披疏柔毛。聚傘狀圓錐花序頂生，花小，花萼筒狀鐘形，5齒裂，花冠二唇形。小堅果寬倒卵形，頂端無毛。氣微香，味苦、甘，微寒。具有清熱解毒，活血止痛功效。用於咽喉腫痛，扁桃體炎，蛇蟲咬傷(中國藥典一部，1977版)。
資料表明，冬凌草莖葉含揮髮油，油中成份為α-蒎烯(α-Pinene)、β-蒎烯0.16～1％、檸檬烯(Limonene)0.16％、1.8桉油素(Cineole)0.33％、對-聚傘花素(P-Cymene)0.16％、王醛(Nonaldehyde)1.33％、癸醛(Decanal)1％b-、β-欖香烯(β-Elemene)20.23％、棕櫚酸(Palmatic acid)6.6％。還得到兩種二萜冬凌草甲素(Oridinin)、乙素(Ponicidin)、丙素C20H26O6、丁素C20H30O6、己素、戊素C23H32O6、庚素、辛素以及α-香樹脂醇(α-Amyrin)和五個未知結構成份。此外，根、莖和葉尚含微量元素鐵、鋅、錳、銅、鉻、鎳、鈷、鉬、硒等。
中國發明專利和專利申請CN94110281.4、95100286.4、95113606.2、95112013.1、97121836.6、98111550.0、0113767.3、01115446.2、02125611.x涉及抗腫瘤中藥，其中包含冬凌草；中國發明專利申請CN03118782.x涉及抗炎、抗病毒的中藥，其中也包含冬凌草。然而，這些專利申請揭示的都是一些複方方劑，而且無一提及冬凌草的抗愛滋病毒作用，更無一揭示抗愛滋病毒的活性部位。
本發明者曾通過實驗研究，提取到冬凌草抗HIV的粗提物。將冬凌草粉末用乙醇迴流或室溫浸泡，低速離心所得沉澱再經水提和乙醇沉澱後製成粗提物DBSHH和DBSHE。兩者均有體外抗HIV活性，以DBSHH為佳。用凝膠層析柱Sephadex-G75將DBSHH進一步分離得到DBSHH-1、DBSHH-2、DBSHH-3和DBSHH-4，抗HIV活性以DBSHH-2為佳(CN200410017625.5)。
發明內容
本發明的目的是提供具有抗愛滋病毒活性的冬凌草提取物(DBS)。
本發明的第二個目的是提供冬凌草提取物在製備抗愛滋病藥物上的應用。
本發明提供的抗愛滋病毒的冬凌草提取物包含多糖有效部位，所述多糖有效部位是冬凌草水提醇沉物的脫鞣質部分，所述多糖有效部位無紫外吸收，對碘不顯色，甲醇和丙酮中不溶，Molish反應呈紫紅色。
所述多糖有效部位是冬凌草水提醇沉物脫鞣質部分的醇提物。
所述醇提物是40％、60％、70％、80％或90％EtOH沉澱多糖DBS-40、DBS-60、DBS-70、DBS-80、DBS-90。
所述醇提物中DBS-70多糖經36DM透析袋透析得到DBS-70-6多糖，其平均分子量為7900，含四種單糖鼠李糖，阿拉伯糖，半乳糖及葡萄糖，它們之間的摩爾比為1.0∶2.2∶1.4∶1.0。
所述多糖有效部位的製備方法是將DBS水提醇沉物溶解於水中，再用明膠溶液沉澱完全，脫去鞣質，得到澄清溶液。
所述DBS脫鞣質部分用終濃度為40％、60％、70％、80％、90％乙醇沉澱得到沉澱多糖DBS-40、DBS-60、DBS-70、DBS-80、DBS-90。
所述DBS-70多糖用36DM透析袋透析72小時，再經冷凍乾燥後，得到DBS-70-6多糖。
圖1為多糖DBS-70-6分子量測定的色譜圖。
圖2為多糖DBS-70-6的氣相色譜分析圖。
具體實施例方式
下面實施例對本發明作進一步闡述，但這些實施例絕非對本發明有任何限制。本領域技術人員在本說明書的啟示下對本發明實施中所作的任何變動都將落在權利要求書的範圍內。
實施例1 冬凌草提取物的製備DBS水提醇沉物169克，加入2000ml水溶解，加入400ml明膠溶液(3.2g明膠溶於600ml水中形成溶液)。靜置過夜，使之沉澱完全。離心棄去沉澱，得到透明澄清溶液。取少量澄清液，滴加明膠溶液若無沉澱產生，說明鞣質等多酚類物質沉澱完全。
實施例2 冬凌草提取物的細胞毒性試驗在一96孔培養板中，將製備物，即實施例1所得澄清液系列稀釋，每三孔為一樣品，然後加入適量實驗室T-細胞株MT-2。在CO2培養箱37℃培養3天後，對細胞進行染色，測定OD值，經閱讀軟體轉換成或細胞生存百分率。如果植被物毒性很強，則細胞會全部或大部死亡，活細胞生存百分率為零或很低；反之，製備物無毒性或低毒性，活細胞生存百分率則接近100或很高。見表1。
表1
實施例3 冬凌草提取物抗愛滋病毒實驗在一96孔培養板中，根據實施例2所得的結果，選擇製備物起始濃度作系列稀釋。加適量滴度的實驗室愛滋病毒株(HIV-IIIB)與細胞株MT-2。在CO2培養箱37℃培養6天左右後，對細胞進行染色，測OD值，經閱讀軟體轉換成未感染細胞百分率。如果製備物對病毒無抑制作用，則被感染的細胞最終成多核巨細胞而破裂死亡(合胞體)；如有抗病毒作用，則有不同程度的未感染細胞存活。以存在50％未感染細胞的製備物濃度為有效濃度。見表2。
表2
經上述抗HIV篩選，實施例1所得提取物為抗愛滋病毒的有效部位。此部位紫外無吸收，對碘不顯色，甲醇和丙酮中不溶，Molish反應呈紫紅色，顯示為多糖化合物。
實施例4 冬凌草提取物的初步分離經Sepabead SP825大孔樹脂對冬凌草提取物進行初步分離，洗脫液依次為水、10％EtOH、20％EtOH、30％EtOH、50％EtOH，從而得到五個洗脫流份。
實施例5 冬凌草提取物洗脫流份的細胞毒性試驗本實施例參照實施例2的步驟進行，其中製備物為實施例4所得的五個洗脫流份。
實施例6 冬凌草提取物洗脫流份的抗愛滋病毒實驗本實施例參照實施例3的步驟進行，其中製備物最大濃度為實施例5所得的最大濃度。
分別測試抗HIV活性，結果顯示實施例4所得五個洗脫流份均呈陽性，而且抗病毒作用未表現出明顯差異。這說明DBS多糖化合物的抗HIV作用不是由其中的某一類多糖引起，而是全部多糖都具有這方面的作用。見表3。
表3
實施例7 冬凌草提取物的純化DBS脫鞣質部分(多糖)以適量水完全溶解，加入無水乙醇，使乙醇的終濃度為40％，部分多糖發生沉澱，將其離心，所得沉澱命名為粗多糖DBS-40，上清液定量加入無水乙醇，使乙醇的終濃度為60％，又有部分多糖發生沉澱，將其離心，得到粗多糖DBS-60；同法分別得到70％、80％、90％EtOH沉澱多糖DBS-70、DBS-80、DBS-90。
經抗HIV活性測試，顯示DBS-40、DBS-60、DBS-70、DBS-80、DBS-90均呈現抗病毒作用。
實施例8 DBS多糖化合物的透析根據實施例2的結果，從實驗的可操作性和實驗難度考慮，選擇對DBS-70、DBS-90進行透析處理。採用36DM透析帶(購自國藥集團化學試劑有限公司，20050907)透析72小時(透析緩衝液為自來水)，除去小分子物質。DBS-90透析後，透析袋內無殘餘；DBS-70透析後，透析袋內有殘餘，將其冷凍乾燥，得到DBS-70-6較為純淨多糖組分。
實施例9 DBS多糖化合物DBS-70-6的分子量測定根據實施例3的結果，採用HP GPC法測定，以0.1M KH2PO4作為流動相，進樣量是40μl，標準右旋糖酐作為標準品，分子量分別為21400、84400、133800、2000000。由標準品的分子量的對數對其在柱上的保留時間作圖，得到標準曲線y＝-0.4109x+8.8121(R2＝0.9999)，同時測定DBS多糖化合物DBS-70-6在柱上的保留時間，結果顯示保留時間為11.952分鐘。根據標準曲線，由此保留時間11.952分鐘，換算得到DBS多糖化合物分子量為7900。
實施例10 多糖DBS-70-6的組成稱取10mg樣品於試管中，加入3ml 2M三氟乙酸，充氮後封管，120℃水解2h，減壓濃縮去TFA後，溶於水，室溫下加入25mg硼氫化鈉，還原4h，加入冰醋酸中和，再用冰醋酸-甲醇(1∶9)混合液反覆多次蒸去生成的硼酸，所得粉末經充分乾燥後，用醋酐於110℃乙醯化2h。然後經氣相色譜分析(Shimadzu QP-5050-A型氣相儀，5％OV225/AW-DMC-Chromosorb W填充柱)其成份，檢測到四種單糖，即鼠李糖，阿拉伯糖，半乳糖及葡萄糖，它們之間的摩爾比為1.0∶2.2∶1.4∶1.0，並且糖醛酸反應呈陰性。
圖1及圖2顯示氣相色譜結果。其中
權利要求
1.抗愛滋病毒的冬凌草提取物，包含多糖有效部位，所述多糖有效部位是冬凌草水提醇沉物的脫鞣質部分，所述多糖有效部位無紫外吸收，對碘不顯色，甲醇和丙酮中不溶，Molish反應呈紫紅色。
2.如權利要求1所述的冬凌草提取物，其中所述多糖有效部位是冬凌草水提醇沉物脫鞣質部分的醇提物。
3.如權利要求2所述的冬凌草提取物，其中所述多糖有效部位是40％、60％、70％、80％或90％EtOH沉澱多糖DBS-40、DBS-60、DBS-70、DBS-80、DBS-90。
4.如權利要求3所述的冬凌草提取物，其中所述多糖有效部位是DBS-70多糖經36DM透析袋透析所得的DBS-70-6多糖，其平均分子量為7900，含四種單糖鼠李糖，阿拉伯糖，半乳糖及葡萄糖，它們之間的摩爾比為1.0∶2.2∶1.4∶1.0。
5.權利要求1所述冬凌草提取物在製備抗愛滋病藥物上的應用。
全文摘要
本發明提供具有抗愛滋病毒作用的冬凌草提取物，系冬凌草水提醇沉物的脫鞣質部分。經抗HIV檢測，此部位顯示活性。此部位無紫外吸收，對碘不顯色，甲醇和丙酮中不溶，Molish反應呈紫紅色，顯示為多糖化合物。通過不同濃度的乙醇沉澱多糖，得到沉澱多糖DBS－40、DBS－60、DBS－70、DBS－80、DBS－90。將DBS－70多糖經36DM透析袋透析得到DBS－70－6多糖，其平均分子量為7900，含四種單糖鼠李糖，阿拉伯糖，半乳糖及葡萄糖，它們之間的摩爾比為1.0∶2.2∶1.4∶1.0。本發明還提供所述冬凌草提取物在製備抗愛滋病藥物上的應用。
文檔編號A61P31/00GK101045079SQ20061002527
公開日2007年10月3日 申請日期2006年3月30日 優先權日2006年3月30日
發明者周金濤 申請人:深圳博愛生藥業有限公司