針對msk1基因的相關製劑在製備5-fu耐藥性檢測試劑及5-fu耐藥逆轉劑方面的應用的製作方法
2023-12-02 20:04:46
針對msk1基因的相關製劑在製備5-fu耐藥性檢測試劑及5-fu耐藥逆轉劑方面的應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於生物醫藥領域，涉及5-FU耐藥性檢測試劑及5-FU耐藥逆轉劑，更具體地說，涉及MSK1相關製劑在製備5-FU耐藥性檢測試劑及5-FU耐藥逆轉劑方面的應用。5-FU藥物耐藥性/敏感性與細胞MSK1表達量之間具有顯著的關聯性。當細胞低表達MSK1時，對5-FU藥物的敏感性高；反之，當細胞高表達MSK1時，對5-FU藥物的敏感性降低。本發明首次提供了MSK1表達量檢測試劑或測試系統在製備5-FU藥物耐藥性/敏感性檢測試劑中的應用；以及MSK1表達抑制劑在製備5-FU藥物增敏劑/耐藥逆轉劑方面的應用。
【專利說明】針對MSK1基因的相關製劑在製備5-FU耐藥性檢測試劑及 5-FU耐藥逆轉劑方面的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物醫藥領域，涉及5-FU耐藥性檢測試劑及5-FU耐藥逆轉劑。
【背景技術】
[0002] 化療藥5-FU用於治療腫瘤已有40餘年，可通過多種途徑發揮作用，其中最主要的 作用方式是作為胸苷酸合成酶抑制劑，阻斷DNA複製的必需原料--胸腺嘧啶的合成。胸 苷酸合成使單磷酸脫氧尿嘧啶（dUMP)發生甲基化從而變成單磷酸胸腺嘧啶（dTMP)。
[0003] 與其它抗腫瘤藥類似，5-FU作用於全身各個系統，快速分裂的細胞（如腫瘤細胞， 亦包括消化道上皮細胞以及生殖細胞）因其核酸合成活動活躍而受到的影響最大。
[0004] 5-FU主要用於結直腸癌以及前列腺癌的治療，數十年前就已建立了標準的化療方 案。結直腸癌對5-FU的耐藥機制主要有固有耐藥和獲得性耐藥兩種，隨著化療方案的進 行，獲得性耐藥一般很難逆轉。
[0005] 因此，在化療前先對患者的5-FU耐藥性進行一定的預測，以及開發5-FU藥物增敏 齊U，具有突出的臨床應用意義。
【發明內容】
[0006] 本發明目的之一在於提供一種5-FU藥物耐藥性/敏感性檢測試劑，可用以判斷患 者對5-FU藥物的耐藥性/敏感性。
[0007] 本發明的另一個目的在於提供一種5-FU藥物增敏劑/耐藥逆轉劑，可用以提高患 者對5-FU藥物的敏感性。
[0008] 發明人通過研究發現，5-FU藥物耐藥性/敏感性與細胞MSK1表達量之間具有顯著 的關聯性。當細胞中MSK1表達量低時，對5-FU藥物的敏感性高；反之，當細胞中MSK1表達 量高時，對5-FU藥物的敏感性降低。
[0009] 本發明首次提供了 MSK1檢測試劑或測試系統在製備5-FU藥物耐藥性/敏感性 檢測試劑中的應用。所述的MSK1檢測試劑可以檢測MSK1的表達量，可以是用以檢測MSK1 mRNA或蛋白量的檢測試劑。
[0010] 優選地，所述的MSK1檢測試劑或測試系統用於製備結直腸癌患者對5-FU藥物的 耐藥性/敏感性檢測試劑。
[0011] 在研究過程中，發明人以結直腸癌細胞作為主要研究對象，發現在結直腸癌細胞 中，MSK1表達量可以作為5-FU藥物耐藥性/敏感性的判斷指標。
[0012] 發明同時提供了一種用於判斷結直腸癌患者對5-FU藥物耐藥性/敏感性的試劑 盒，含有MSK1檢測試劑。
[0013] 同時，發明提供了 MSK1抑制劑在製備5-FU藥物增敏劑/耐藥逆轉劑方面的應用。 MSK1抑制劑可以用作結直腸癌患者對5-FU藥物的藥物增敏劑/耐藥逆轉劑。
[0014] 作為可選的方案，MSK1抑制劑可以是現有的能抑制或降低MSK1表達水平的物質， 例如針對MSK1基因的shRNA幹擾片段、小分子化合物抑制劑等。
[0015] 發明還提供了一種治療癌症的藥物，含有5-FU藥物和MSK1抑制劑。所述癌症為 已知的可採用5-FU藥物進行治療的癌症，例如結直腸癌、消化道腫瘤、乳腺癌、卵巢癌、絨 毛膜上皮癌、子宮頸癌、肝癌、膀胱癌、皮膚癌等。
[0016] 發明人發現，當通過基因工程手段將原本低表達MSK1蛋白的野生型結直腸癌細 胞改造為高表達MSK1蛋白的細胞時，其對5-FU藥物的敏感性降低，IC50值明顯提高。而 當將原本高表達MSK1蛋白的野生型結直腸癌細胞改造為低表達MSK1蛋白的細胞時，則對 5-FU藥物的敏感性提高，IC50值明顯降低，可以降低給藥量。
[0017] 因此，MSK1表達量高低可以作為患者對5-FU藥物敏感性判斷的一個重要指標。同 時，在給患者採用5-FU藥物治療時，同時給以能降低或抑制MSK1蛋白表達的藥物，將能提 高5-FU藥物的敏感性，降低5-FU用藥量及副作用。
[0018] 在化療前先對病人5-FU藥物敏感性的預測，對於不敏感的病人進行一定手段的 幹預，可以進一步減少獲得性耐藥的產生，從而減少由於盲目增大藥物用量而引起的毒副 作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019] 圖1為能表達針對MSK1基因的shRNA幹擾片段的質粒圖譜
[0020] 圖2為能表達對所有基因均無幹擾效果的對照shRNA的質粒圖譜
[0021] 圖3為超表達MSK1基因的質粒的圖譜
[0022] 圖4為未插入外源基因的空載體對照質粒的圖譜
[0023] 圖5為MSK1蛋白表達量的Western鑑定實驗結果，A為HCT116細胞對照組及實 驗組結果；B為Cac 〇2細胞對照組及實驗組結果
[0024] 圖6為半數致死量5-FU濃度比較；A為HCT116實驗組及對照組結果；B為Caco2 實驗組及對照組結果
【具體實施方式】
[0025] 以下實施方式是對本發明作進一步說明，但本發明的實施方式不局限於以下的實 施例介紹，凡依照本發明的原理或理念所作的等同的變化或變通都應視為本發明保護的範 疇。
[0026] 實施例1 MSK1高表達/低表達細胞株的構建
[0027] 本實施例以兩種結直腸癌細胞：野生型Cac〇2(本身為MSK1蛋白低表達細胞）和 野生型HCT116細胞（本身為MSK1蛋白高表達細胞）為研究對象，進一步構建MSK1蛋白高 表達的Caco2細胞（本專利記為Caco2-MSKl細胞），以及MSK1蛋白低表達的HCT116細胞 (本專利記為HCT116-shMSKl細胞）。
[0028] 超表達MSK1基因的質粒構建委託上海生博生物醫藥科技有限公司完成，用於制 備慢病毒後感染野生型Cac 〇2細胞；表達幹擾MSK1基因 shRNA片段的質粒構建委託長沙贏 潤生物技術有限公司完成，直接轉染野生型HCT116細胞；作為對照組所採用的對照細胞， 以空載體對照質粒製備慢病毒後感染野生型Cac 〇2細胞，成為Cac〇2對照細胞（本專利記 為Cac〇2-Ctrl細胞）；另外以對照shRNA質粒（對所有基因均無幹擾效果）轉染野生型 HCT116細胞，成為HCT116對照細胞（本專利記為HCT116-shCtrl)。上述質粒圖譜分別如 圖1-4所示。
[0029] 慢病毒感染Caco2細胞流程：
[0030] 1、六孔板中每孔接種5X 104野生型Caco2細胞，用DMEM/F12培養基（Gibco,貨號 C11330500BT)培養 24h，長到 50% -60%。
[0031] 2、第二天，每孔吸棄300ul培養基。解凍病毒液。
[0032] 3、用培養基直接稀釋病毒液，使得病毒的感染複數（Μ0Ι)為100。
[0033] 4、配製好感染複數（Μ0Ι)為100的病毒液後，向其中加入Polybrene感染添加劑 至終濃度8ug/ml，將病毒液與細胞混勻後放入37°C，C0 2培養箱。
[0034] 5、6h後每孔加入300ul細胞培養液，感染至48h後換液。
[0035] 6、用終濃度為0. 5ug/ml的嘌呤黴素篩選實驗組和對照組細胞。
[0036] 質粒轉染HCT116細胞流程：
[0037] 1、六孔板中每孔接種5X104野生型HCT116細胞，培養24h，長到50% -60%。
[0038] 2、第二天，每孔吸棄2ml培養基，用無血清無雙抗的DMEM/F12培養基（Gibco,貨號 C11330500BT)洗 2 次。
[0039] 3、每孔加入1. 5ml的無血清無雙抗的DMEM/F12培養基，解凍質粒。
[0040] 4、配製轉染試劑：向1ml Opti-mem培養基（Gibco,貨號31985-062)中加入 10 ul I」pofectamine.KlLTX and PLUS?Reagents 化學轉染試劑盒（Invitrogen,貨號： 15338-100)中的PLUS試劑，再加入10ug質粒，混勻，室溫放置10min。取上述混合物750ul， 加入 750ul Opti-mem 培養基和 22. 5ul Lip〇fectamine?LTX and PLUS?Reagents 化學轉 染試劑盒（Invitrogen，貨號：15338-100)中的LTX試劑，吸打混勻，室溫放置30min，即配 制好轉染試劑。
[0041] 5、每孔加入500ul轉染試劑，混勻後放入37°C，C02培養箱。
[0042] 6、6h後換成含血清培養液，轉染至48h後換液，在螢光顯微鏡下觀察螢光。
[0043] 7、用終濃度為lOOOug/ml的G418篩選實驗組和對照組細胞。
[0044] 本實驗室構建的穩定轉染細胞株名稱及定義如下：
[0045] 1、Caco2_Ctrl細胞：野生型Caco2細胞本身為一種MSK1蛋白低表達的細胞， Cac〇2-Ctrl細胞是指用對MSK1蛋白表達無影響的病毒感染野生型Cac〇2細胞後穩定篩選 所得細胞株。即Cac 〇2-Ctrl細胞仍為MSK1蛋白低表達細胞株。
[0046] 2、Caco2_MSKl細胞：野生型Caco2細胞本身為一種MSK1蛋白低表達的細胞， Cac〇2-MSKl細胞是指用可使MSK1蛋白超表達的病毒感染後穩定篩選所得細胞株。即 Caco2-MSKl細胞為MSK1蛋白高表達細胞株。
[0047] 3、HCT116-shCtrl細胞：野生型HCT116細胞本身為一種MSK1蛋白高表達的細胞， HCT116-shCtrl細胞是轉染入對MSK1蛋白表達無影響的質粒後穩定篩選所得細胞株。即 HCT116-shCtrl細胞仍為MSK1蛋白高表達細胞株。
[0048] 4、HCT116-shMSKl細胞：野生型HCT116細胞本身為一種MSK1蛋白高表達的細 胞，HCT116-shMSKl細胞是轉染入幹擾MSK1蛋白表達的質粒後穩定篩選所得細胞株。即 HCT116-shMSKl細胞為MSK1蛋白低表達細胞株。
[0049] 實施例2 MSK1蛋白表達量的Western鑑定實驗
[0050] 對實施例1的4種細胞進行Western鑑定：
[0051] 1、提取蛋白
[0052] (l)900rpmX4min 收集細胞沉澱。
[0053] (2)用PBS緩衝液將細胞洗2遍，棄去上清後加入M-PER細胞裂解液（Thermo Scientific Pierce，貨號 78503)，混勻後冰上放置 30min。
[0054] (3)4°C離心，12000rpm, lOmin，取上清。
[0055] (4)加入 5XSDS buffer，10(TC變性 5min。
[0056] 2、按照Western實驗步驟進行蛋白表達鑑定，大致如下：
[0057] (1)電泳：分離膠電泳條件：80V20min ;濃縮膠電泳條件：120V50min。
[0058] (2)電轉：用半乾轉移儀Oio-rad，型號Bolt-turbo)進行轉膜，條件為20V、 0· 5A、50min〇
[0059] ⑶封閉：用PBST配製5%的脫脂奶粉，完全溶解之後，把帶有目的蛋白的NC膜浸 泡在脫脂牛奶中，室溫下在搖床上封閉lh。
[0060] (4)孵育一抗：按照1:1000比例稀釋MSK1蛋白的抗體（Bethyl，貨號A302-747A)， 按照1:10000比例稀釋Actin蛋白的抗體（Proteintech，貨號60008-1-Ig)，冰上孵育2h 後，4°C過夜。
[0061] (5)洗膜：PBST 洗 3 遍，每次 10min。
[0062] (6)孵二抗：分別用帶螢光的兔抗（LIC0R，貨號926-32211)和帶螢光的鼠抗 (LIC0R，貨號926-68020)孵育帶MSK1蛋白和帶Actin蛋白的膜，避光孵育lh。
[0063] (7)漂洗：用 PBST 洗 3 遍，每次 10min。
[0064] (8)用Odyssey雙色紅外雷射成像系統（LIC0R，型號0DY-3153)掃描。
[0065] 結果如圖5所示。由結果可見，在內參蛋白（Actin)表達一致的情況下，HCT116 細胞實驗中（圖5A)，MSK1蛋白的實驗組（HCT116-shMSKl組）蛋白表達量低於對照組 (HCT116-shCtrl組）；而Caco2細胞實驗中（圖5B)，MSK1蛋白的實驗組（Caco2-MSKl組） 蛋白表達量高於對照組（Caco2-Ctrl組）。Western鑑定結果證明成功構建出抑制MSK1蛋 白表達的HCT116細胞株和超表達MSK1蛋白的Caco2細胞株。
[0066] 實施例3細胞實驗
[0067] 1、使用RTCA實時細胞動態分析儀（Roche，型號Xcelligence)進行細胞動態培 養檢測，在E-plate板上各孔加入100ul帶不同5-FU濃度梯度的培養基，濃度梯度如下： 100uM、50uM、25uM、12. 5uM、6. 25uM、3. 12uM。
[0068] 2、測定基線。
[0069] 3、向E-plate中每孔再加入100ul細胞懸液（含5000個細胞），使得E-plate各 孔中 5-FU 的實際濃度梯度變為：50uM、25uM、12. 5uM、6. 25uM、3. 12uM、l. 56uM。
[0070] 4、啟動儀器進行動態監測，並取實驗組和對照組差異最大的時間點作為計算IC50 的時間點，使用GraphPad Prism 5軟體繪製細胞存活率與5-FU濃度對數值的關係圖。
[0071] 結果如圖6所示。經過換算，測得HCT116-shCtrl組的IC5Q值為5. luM;而 HCT116-shMSKl 組的 IC5(I 值只有 2. 7uM。Caco2-Ctrl 組的 IC5(I 值為 2. 7uM ;而 Caco2-MSKl 組的IC5Q值高達11. 7uM。
[0072] 也即是說，若要使細胞達到半數致死量，HCT116細胞實驗組所需的5-FU濃度更 低，即對5-FU較敏感。而Cac〇2細胞實驗組達到半數致死量所需的5-FU濃度更高，即對 5-FU較不敏感。
[0073] HCT116細胞實驗組（HCT116-shMSKl)是野生型HCT116細胞轉染入對MSK1蛋白表 達起降低作用的質粒後穩定篩選所得細胞株。即HCT116-shMSKl細胞為MSK1蛋白低表達 細胞株，對藥物5-FU更加敏感。
[0074] Caco2細胞實驗組（Caco2_MSKl)是野生型Caco2細胞轉染入對MSK1蛋白表達起 增強作用的質粒後穩定篩選所得細胞株。即Cac 〇2-MSKl細胞為MSK1蛋白高表達細胞株， 對藥物5-FU較不敏感。
[0075] 綜上所述，細胞實驗結果證明，MSK1低表達的結直腸癌細胞對於5-FU藥物的敏感 性較MSK1高表達的結直腸癌細胞更好，通過測定用藥對象的MSK1表達量，可以作為判斷用 藥者對5-FU藥物敏感性的依據之一。
[0076] 降低細胞MSK1的表達可以提高其對5-FU藥物的敏感性。細胞過表達MSK1則降 低其對5-FU藥物的敏感性。通過抑制細胞MSK1蛋白的表達，有利於提高細胞對5-Fu藥物 的敏感性。
【權利要求】
1. MSK1檢測試劑或測試系統在製備5-FU藥物耐藥性/敏感性檢測試劑中的應用。
2. 如權利要求1所述的應用，其特徵在於製備癌症患者對5-FU藥物的耐藥性/敏感性 檢測試劑。
3. 如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述的癌症為結直腸癌。
4. 一種用於判斷癌症患者對5-FU藥物耐藥性/敏感性的試劑盒，其特徵在於含有 MSK1檢測試劑。 5. MSK1抑制劑在製備5-FU藥物增敏劑/耐藥逆轉劑方面的應用。
6. 如權利要求5所述的應用，其特徵在於製備癌症患者對5-FU藥物的藥物增敏劑/耐 藥逆轉劑。
7. 如權利要求6所述的應用，其特徵在於所述的癌症為結直腸癌。
8. 如權利要求5所述的應用，其特徵在於所述的MSK1抑制劑為針對MSK1基因的shRNA 幹擾片段或小分子化合物抑制劑。
9. 一種治療癌症的藥物組合物，其特徵在於含有5-FU藥物和MSK1抑制劑。
10. -種治療結腸癌的藥物組合物，其特徵在於含有5-FU藥物和MSK1抑制劑。
【文檔編號】G01N33/68GK104267188SQ201410431506
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月28日 優先權日:2014年8月28日
【發明者】汪建平, 王磊, 傅新暉 申請人:汪建平, 王磊, 傅新暉