從離子交換和分級分離樹脂中除去汙染物的一種酶促方法
2023-12-08 08:38:56 1
專利名稱：從離子交換和分級分離樹脂中除去汙染物的一種酶促方法
背景技術：
發明領域本發明涉及酶加工工藝的寬廣領域。更特別地是，本發明涉及一種通過用酶處理法從樹脂尤其是離子交換和分級分離樹脂中除去汙染物的方法。本發明還涉及利用事先用酶清洗過的樹脂來生產純化的穀物增甜劑，尤其是穀物糖漿和高果糖穀物糖漿的一種方法。
相關技術的描述在分析化學中，樹脂為分離有機或無機離子或非離子樣品提供了有力工具。樹脂通常地包含在柱子或管道中。樹脂加工自交聯聚苯乙烯之類的物質，它們被化學地交聯在一起，也稱DVB(二乙烯基苯)，有大孔(大孔洞)和凝膠(小孔)的形式。食品加工中所用的其它樹脂來自丙烯酸酯類。通過再生該樹脂，樹脂通常可再利用。被汙染物造成去活化或汙染會破壞樹脂。除熱不穩定性(脫磺酸基作用或喪失官能作用)之外，離子性、顆粒性沉積物和聚合性物質也會引起汙染。
離子交換樹脂是一種合成的有機聚合物，它常常是基於交聯的聚苯乙烯，通過加入帶電荷基團產生懸浮於水溶液中時將交換抗衡離子的諸材料，從而衍生出該物質。陽離子交換樹脂具有固定的酸性取代基，該酸性取代基是基於諸如強酸交換劑磺酸或弱酸交換劑羧酸之類物質。陰離子交換樹脂具有固定的、基於如季銨或乙氧胺基或銨類等弱鹼性交換劑的取代基。其它功能基團可被附著到樹脂骨架上以使其更具選擇作用。樹脂的衍生化程度和交聯度決定了離子交換的總容量。
一種稱為層析的技術是基於各物質在液相和固相間的分配能力而用來分離各種物質的混合物。離子交換層析被定義為這樣一類層析，其中的固相支持物是一種用於分離帶電分子或離子的混合物的離子交換材料。這可在製備級水平上進行，或作為高壓液相層析的一種變更形式。
層析分離決定於交換潛力、洗脫劑、柱長度及加樣量、流速、顆粒大小和溫度的不同。層析分離能被用於廣闊的用途中，包括穀物增甜劑，如穀物糖漿(eoru syrup,CSU)和高果糖穀物糖漿(high fructose cornsyrup,HFCS)的純化。通過水解玉米澱粉可製得穀物增甜劑。對已製得的成分給出一葡萄糖當量(dextrose equivalent,D.E.)數，它決定於反應所允許的轉化程度。此數值越低，轉化的程度也越低。越高的D.E.數值表示越完全的轉化，92D.E.表示完全從穀物澱粉轉化成了葡萄糖(穀物糖)。高果糖穀物糖漿能用酶轉化至97D.E.，並分級成97-99D.E.。多年來穀物增甜劑已被用來製備冰琪淋和酸乳酪水果。需穀物增甜劑摻入的一系列原因中有兩個原因是最主要的。首先，穀物增甜劑給製成的產品以理想的形狀或「口感」，這是單用蔗糖所不能達到的。其次，某些穀物增甜劑每磅比蔗糖可摻入更高的甜度，因而使用它們更便宜。顯而易見，由於穀物增甜劑的重要價值，用來再生可用於製備純化的穀物增甜劑的樹脂的改進方法將是十分有益的。目前，離子交換和分級分離層析是純化穀物增甜劑時可選擇的方法，然而，裝樹脂的柱或管道經常會被汙染，並且難於清洗。
目前選擇的用來再生樹脂的方法包括化學藥品的使用。通常使用的化學藥品包括下述但並不局限於這些鹽酸(HCl)、氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化銨(NH4OH)和碳酸鈉(Na2CO3)。首先，用衝洗劑(常用水)衝洗樹脂，然後進行一系列化學處理步驟。然而，有時即使經化學處理或再生後，樹脂仍被微生物(如細菌)所汙染，這種情況並不少見。
本發明的一個目的就是，在酶從未被利用的一個加工領域內，提供一種利用酶特別是蛋白酶、脂肪酶、糖酶和α-澱粉酶的作用來清洗樹脂的方法。本發明特別適於清洗用於純化穀物增甜劑的離子交換和分級分離樹脂。
發明概述本發明涉及一種用於清洗樹脂、尤其是離子交換和分級分離樹脂的酶促方法。該方法可單獨使用或與化學方法聯合使用。對於包含了需分級分離或離子交換處理的汙染物如蛋白質、糖類、脂類和殘留的未轉化澱粉等的液體，該方法可提高它們的產量。此發明還涉及在穀物增甜劑，尤其是穀物糖漿和高果糖穀物糖漿的生產中樹脂的用途。
諸優選實施方案的描述本發明涉及從樹脂尤其是離子交換和分級分離樹脂中除去汙染物的一種酶促方法。將諸酶暴露於已汙染的樹脂內，並選擇性地在指定的特定時間內使酶再循環通過樹脂。酶再循環的時間長短是一個生產要素。用於處理樹脂的時間越短，清洗樹脂所需的酶劑量就越大。
本發明可將酶的新用途與傳統化學處理方法聯合起來，從而從樹脂中除去汙染物。酶有一特徵的最適pH，在此pH值時它們的活性最高。酶的pH-活性曲線反映了酶催化位點中重要的質子供體或質子受體基團處於所要求的離子化狀態時的pH值。酶的最適pH不必與正常環境的pH值一致，環境pH值可稍高或稍低於最適pH。
本發明能與可在pH1-9，更優選pH6-8之間，尤其更優選pH6.5-7.5和最適溫度90-180F，更優選120-130F條件下作用的諸現有蛋白酶、脂肪酶、糖酶和α-澱粉酶一起使用。
只要是本領域的技術人員就會懂得多種酶可用於本發明中，用哪一種酶取決於造成問題的汙染物。以下的酶類是常規使用的，現只提供作為例子，並不希望限制了本發明的範圍。以下酶的通用名後的括號中是它們的商品名。
蛋白酶/肽酶(Alcalase,Neutrase,Flavourzyme)β-葡聚糖酶(Finizym,Ceveflo)脂肪酶(Palatase,Lipozyme)α-澱粉酶(BAN,Termamyl L型)糖酶(Viscozyme)多酶複合物包括以下種類但不局限於此α-澱粉酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶(Ceremix)、糖酶(Viscozyme)為了本申請的諸目的，蛋白酶/肽酶被定義為可水解(斷裂)蛋白質成短鏈、可溶性肽和胺基酸的一類酶。
β-葡聚糖酶被定義為可水解β-葡聚糖(1,4-β-葡聚糖，1,3-β葡聚糖)成為寡糖和雙糖的一類酶。1,4-β和1,3-β的標示是指分子中此類酶所作用的碳原子間的化學鍵。
寡糖被定義為化學連接在一起的葡聚糖分子的短鏈。這些鏈的長度通常是3-5個葡萄糖單元。
雙糖被定義為連接在一起的兩個葡萄糖單元。這在β-葡聚糖酶作用中只少量形成。
脂肪酶被定義為可在1,3-酯化學連接位點將短鏈和長鏈脂肪酸水解成甘油單酯或甘油雙酯和脂肪酸的一類酶。短鏈甘油三酯指具有不超過12個碳分子的側鏈的甘油三酯，即十二烷酸的酯及碳原子數比它小的酯。長鏈脂肪酸指具有12個以上碳分子的脂肪酸，即十二烷酸以上的酯。
α-澱粉酶被定義為可隨機水解直鏈澱粉和支鏈澱粉中的α-1,4糖苷鍵，導致形成可溶性糊精和寡糖的一類酶。α-1,4糖苷鍵指構成澱粉的諸葡萄糖分子間的化學聯接。一個葡萄糖分子的第1號碳原子鍵合到毗鄰分子的第4號碳原子上。正是此鍵被α-澱粉酶所攻擊，產生澱粉的降解產物-糊精和寡糖。
有兩種基本類型的澱粉直鏈澱粉和支鏈澱粉。直鏈澱粉嚴格地由α-1,4糖苷鍵構成，可被α-澱粉酶所分解。支鏈澱粉是第二類澱粉，它由α-1,4-糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵構成。α-澱粉酶不能切斷1,6鍵，所以支鏈澱粉較難被α-澱粉酶水解。
糖酶被定義為一類範圍較廣的、可水解非澱粉類多糖(β-1,4-α-1,4-α-1,5)的酶。這類酶包括阿拉伯聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、半纖維素酶和木聚糖酶。阿拉伯聚糖酶將阿拉伯聚糖水解成寡阿拉伯聚糖和阿拉伯糖(arabanose)。纖維素酶將纖維素水解成寡纖維素和cellubiose。半纖維素酶將半纖維素水解成寡戊聚糖和戊聚糖。木聚糖酶將木聚糖水解成寡木聚糖和木糖。
如果鑑別出了兩種或更多汙染物，應核對所用每一種酶的最適pH和溫度，如果有可能，這些酶可作為多酶複合物一起加入。當兩種酶聯合使用時，很少有可能兩種酶都在它們的最適pH和溫度條件下被使用。在這種情況下，可採用兩種酶均具有相對高活性的一個共有的重疊區域。如果該兩種或多種酶的pH和溫度最適值有很大差異，那麼可將它們逐次加入。通常，該兩種或多利酶使用比率大約與汙染物比率相同。多酶複合物的例子包括下述但並不局限於這些糖酶，包括阿拉伯聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、半纖維素酶和木聚糖酶(Viscozyme)α-澱粉酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶(Ceremix)本領域技術人員懂得，隨著研究的進展及具有更大耐受性(特別是在低pH範圍內)的酶的鑑定出來，本領域技術人員會將這些酶用於本發明中。
在本發明的另一優選實施方案中，在酶促處理前進行汙染物的鑑定。儘管此步驟並非清洗所絕對必需的，但它可節省錢和時間，避免無效酶的使用和不成功的清洗。因為通常酶對它們的底物都具有高度的專一性，所以理想的情況是，在汙染物被鑑定後，才挑選用來處理該樹脂的酶或酶混合物。然而，本領域技術人員知道，確定樹脂中汙染物的來源有時比較困難，或者是不可能的。因此，酶的選擇有時必須在對汙染物不了解的情況下進行。
在本發明的另一個優選實施方案中，在用一種或多種酶處理之前，將樹脂的pH調到所選酶的最適pH範圍內。
如果要處理的是陽離子樹脂，樹脂的容量應用NaOH或Na2CO3完全耗盡直至pH達到6-8的水平，最適為6.5-7.5。如果用Na2CO3來耗盡樹脂，必須多加小心，因為在該單元內會形成CO2，從而提高了管內的總壓力。
在去甜(sweetening off)後，就可對弱或強鹼性陰離子樹脂進行處理。如果管內pH大於7.5，應用HCl來完成樹脂的耗盡。
在本發明的另一個優選實施方案中，在用一種或多種酶除去仍在進行反應(如離子交換)的汙染物起始濃度前，用清洗劑(如水)徹底清洗樹脂。在糖類和穀物的溼法碾磨工業中，此步驟被稱為「去甜」(「sweeteningoff」)。在本申請中，去甜被定義為，在進行化學和或酶處理前，從樹脂和管道中清洗掉糖漿、糖、酒或其它基於糖類的液體，直至管道或單元中的有機碳總量在百萬分之3500即3500ppm以下，更優選2500ppm以下。殘餘糖漿被定義為在「去甜」後保留在管道中的糖漿。在本申請中，「汙染物的起始濃度」被限定為汙染物含量大於2500ppm，更優選1000ppm，還要更優選100ppm。本申請中，「汙染物的殘餘量」被限定為汙染物量少於2500ppm，更優選1000ppm，還要更優選100ppm。
該清洗劑即水並不要求是可飲用的，儘管優選最純的水。任選地，可將鹽加入水中以協助該「去甜」過程。優選地，水應被軟化，或者，有可能的話，應該使用回收自蒸發器的冷凝水。在糖類和穀類溼法碾磨工業中，選用的是冷凝水。
將樹脂暴露於該清洗劑中，直至進行離子交換的殘留的汙染物起始量被清除掉。在糖類和穀類溼法碾磨工業中，這種用清洗劑進行的清洗或「去甜」過程必須持續到留在該單元中的可檢測到的總有機碳(total organiccarbon,TOC)含量最大不超過2000ppm，更優選含量少於1000ppm，還要更優選含量少於100ppm。為了本申請的目的，「總有機碳」(TOC)被定義為樣品中所有有機碳的測量值。因為是以二氧化碳的形式測量有機碳的最終氧化，所以在燃燒艙中燃燒一個小樣品，測量散出的二氧化碳含量，再從中減去無機碳導致的量，就可以確定總有機碳含量。保留在該單元中的總有機碳或殘餘糖的這些含量應不會干擾清洗過程。含量大於2000ppm就有可能干擾此過程。清洗劑的使用也使得本領域技術人員在用一種或多種酶處理汙染物前可調節樹脂的溫度。所用清洗劑的溫度應在或稍高於所選酶的最適溫度範圍，因為pH的調節會降低管道內溫度。
在本發明的另一優選實施方案中，在處理完成後，用一種溶液(通常是水)來衝洗該酶溶液直至管中酶濃度被衝洗乾淨。
在本發明的另一優選實施方案中，用熟知的化學步驟對樹脂進行再生。用於再生的典型濃度和化學藥品包括對弱鹼性陰離子類型樹脂，用4％NaOH溶液(96-112kg/m3)和5％Na2CO3溶液(112-118kg/m3)在40℃再循環30-60分鐘。對強鹼性陰離子樹脂，用4％氫氧化鈉溶液(112-120kg/m3)和7％碳酸鈉溶液(80-96kg/m3)在40℃再循環30-60分鐘。
上面是對本發明的綜合描述，其內容可參照某些實施例而更好地理解，本文中所包括的這些實施例僅用來舉例說明本發明，不應理解為限定本發明。
實施例實施例1．樹脂中汙染物的測定程序如果在選擇用於處理汙染物的酶及進行處理之前就鑑定出樹脂中汙染物的類型，就可以節省不必要花費的時間和金錢。用常規方法進行汙染物的分析。通常地，本領域技術人員會認識到有諸如下述的樹脂汙染物蛋白質；脂類如脂肪和油；纖維如纖維素、半纖維素；β-葡聚糖；澱粉如直鏈澱粉、支鏈澱粉；或其它糖類，如arabose或xylanose。本領域技術人員常用以下步驟來鑑定樹脂中所存在的汙染物。應在瓶中過濾樹脂後對所有汙染物進行分析。僅對溶液進行測定。測定通常是嚴格的，且包含將與樹脂反應的強氧化劑。
將2克樹脂樣品放於燒杯中，燒杯內已有一磁力攪拌棒，加入水至總體積200ml。調節溶液的pH和溫度到所選酶的最適pH範圍內。該酶已事先稱重以使其在溶液中的總百分率相當於該溶液總重量的3-5％。這一步的目的是要確定汙染物的成份。每一樣品僅用一種酶進行檢查。將該溶液混合30-60分鐘，然後恰當地分析汙染的來源。
可用許多種方法過行分析，其中大部分方法均為特殊工業中的「標準方法」。對於穀類溼法碾磨廠或糖類提煉廠中所用的樹脂來說，最可能的汙染物是蛋白質、澱粉、β-葡聚糖、脂肪和脂類，其中蛋白質最多。
蛋白質的分析能用凱氏方法完成，該方法來自穀類精製者協會公司成員的標準分析方法穀類澱粉(未修飾)，方法B-48。凱氏法有許多變更方法，但這一方法是適當的，並且很靈敏。
脂肪和脂類的分析可用天然脂肪(可用已烷抽提)方法完成，該方法來自穀類精製者聯合協會公司諸成員的標準分析法；飼料，方法G-11。該程序有其它變更程序，但這一方法是最適用的。
β-葡聚糖(穀類纖維)的分析可用該天然纖維方法完成，該方法來自穀類精製者聯合協會公司諸成員的標準分析法；飼料，方法G-12。該程序有其它變更程序，但這一方法是最適用的。
β-葡聚糖(穀類纖維)的分析可用該天然纖維方法完成，該方法來自穀類精製者聯合協會公司諸成員的標準分析法；飼料，方法G-12。該程序有其它變更程序，但這一方法是最適用的。
β-葡聚糖(穀類纖維)的分析可用該天然纖維方法完成，該方法來自穀類精製者聯合協會公司諸成員的標準分析法；飼料，方法G-12。該程序有其它變更程序，但這一方法是最適用的。
澱粉的分析可通過將幾滴標準碘溶液加入該樹脂溶液中而完成。如果加入碘溶液後，燒瓶中形成紫色、綠色或藍色，那麼其中存在天然形式的澱粉。實施例2．酶處理條件汙染物可任意選擇性地用實施例1的方法進行鑑定。儘管這並不必需，但它使得能對處理汙染物的酶進行適當選擇，並可選用合適的化學處理方法。汙染總量用佔樹脂加汙染物總重的百分比來估算和表示。用清洗劑，如水清洗對該離子交換管道中的樹脂進行去甜，直至殘餘汙染物或汙染物濃度(經歷離子交換的物質)，如穀物糖漿或高糖穀物糖漿已降低到可接受的水平，通常是1000-2500ppm總有機碳。儘管更低的水平是更理想的。
調節樹脂的pH至所選酶的pH範圍內。例如，若選擇細菌蛋白酶，則該pH範圍是5-9，更優選pH5.5-7.5，且溫度範圍是20-75℃，更優選40-60℃。若選擇植物蛋白酶，如木瓜蛋白酶，則pH範圍是2.5-10，優選pH3-9.5，且溫度範圍是30-60℃，更優選38-55℃。
用於調節pH的化學藥品包括但並不局限於氫氧化鈉、鹽酸、氨和碳酸鈉。將合適的酶與水混合再加入汙染物中。其劑量取決於汙染的類型和程度。該酶通過離子交換管道再循環一段適當的時間。再循環時間取決於所用的酶、與最適酶條件的接近程度以及汙染程度。循環時間通常是1-24小時。完成處理後，用一種溶液(通常是水)衝洗該酶溶液，直至管中酶含量已被衝盡。此時樹脂可選擇性地用標準的化學步驟進行再生。用於再生樹脂的典型濃度和化學藥品包括對弱鹼性陰離子型樹脂，用4％氫氧化鈉溶液(96-112kg/m3)和5％碳酸鈉溶液(112-118kg/m3)，在40℃再循環30-60分鐘。對強鹼性陰離子樹脂，用4％氫氧化鈉(112-120kg/m3)和7％碳酸鈉溶液(80-96kg/m3)，在40℃再循環30-60分鐘。實施例3．穀物谷蛋白汙染物的酶促處理本實施例闡述了用於從陽離子或陰離子交換樹脂中除去穀物谷蛋白汙染物的方法，該蛋白質不能用化學藥品處理或水除去。
首先將樹脂用傳統化學方法處理。此化學試驗性衝洗的步驟是，用7％鹽酸(1N)循環通過陰離子樹脂(Dowex88)和4％(1N)的氫氧化鈉環流通過陰離子樹脂(Dowex66)，時間為4小時，溫度為120F，這與植物條件相似。衝洗掉柱中的化學藥品，隨後進行適當調整以備酶的衝洗試驗。
用水衝洗(去甜)樹脂，調節至最適酶作用溫度。用5％碳酸鈉溶液調節管道內pH至6.8，這接近酶的最適pH。
所用酶是0.5L肽酶(Neutrase)。每1500ft3樹脂中加30kg肽酶。這一酶含量估計為汙染物總量的1％。該酶通過吸入陽離子和陰離子管道而被加入。該溶液再循環通過此管道，總循環時間長4小時。隨後從管中衝洗掉該酶。用標準方法分析衝洗下來的酶樣品中的總蛋白質含量。〖凱氏分析(穀物精製者協會成員的標準分析方法，方法B-48)〗。每循環1小時收集分析溶液，得到以下結果。已減去了樣品中會被檢測為蛋白質的酶的蛋白質量。時間溶液中的蛋白質％溶液中的蛋白質％(只用HCl和NaOH洗) (用酶清洗)1 0.2％ 0.5％2 0.3％ 0.8％3 0.7％ 1.1％4 0.7％ 1.4％
酶加入5分鐘內，管道中溶液呈混濁褐色外觀。這一作用是極其顯著的，因為在進行酶處理之前，隔著管子的可視玻璃都能看到管中存在的蛋白質。在經過兩種處理後，再看不到蛋白質塊，且樹脂單元的作用時間降低了70％，回復到正常。從此實施例中可清楚地看到，酶處理法比現有技術中所用的化學處理法有效得多。酶處理法的有效率要高100％。
權利要求
1．從樹脂中除去一種或多種汙染物的一種酶促方法，該方法包括用一種或多種酶處理該樹脂。
2．權利要求1的酶促方法，它還包括在酶處理前，用衝洗劑從樹脂中除去起始濃度的一種或多種汙染物，使汙染物達到殘留水平。
3．權利要求1的酶促方法，它還包括調節樹脂的pH以適應一種或多種酶的最適pH範圍。
4．權利要求1的酶促方法，它進一步包括在酶處理後用第二種清洗劑從樹脂中除去一種或多種酶。
5．權利要求2的方法，其中用清洗劑處理後存在的殘留汙染物的量是2500ppm或更少。
6．權利要求2的方法，其中用清洗劑處理後存在的殘留汙染物的量是1000ppm或更少。
7．權利要求1的方法，其中用清洗劑處理後存在的殘留汙染物的量是100ppm或更少。
8．權利要求2的方法，其中所述清洗試劑是水。
9．權利要求1的方法，其中的一種酶是一種蛋白酶。
10．權利要求1的方法，其中的一種酶是一種β-葡聚糖酶。
11．權利要求1的方法，其中的一種酶是一種脂肪酶。
12．權利要求1的方法，其中的一種酶是一種α-澱粉酶。
13．權利要求1的方法，其中的一種酶是一種糖酶。
14．權利要求1的方法，其中使用了兩種或更多種的酶。
15．權利要求13的方法，其中用選自下述成員的兩種或多種酶處理樹脂蛋白酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶、α-澱粉酶和糖酶。
16．權利要求15的方法，其中所述兩種酶是α-澱粉酶和β-葡聚糖酶。
17．權利要求4的方法，其中最適pH範圍在1-9.5之間。
18．權利要求4的方法，其中最適pH範圍在3-8之間。
19．權利要求4的方法，其中最適pH範圍在6-8之間。
20．權利要求4的方法，其中最適pH範圍在6.5-7.5之間。
21．權利要求1的方法，其中所述樹脂是一種陰離子樹脂。
22．權利要求21的方法，其中所述陰離子樹脂是一種強鹼。
23．權利要求21的方法，其中所述陰離子樹脂是一種強酸。
24．權利要求1的方法，其中所述樹脂是一種陽離子樹脂。
25．權利要求24的方法，其中所述陽離子樹脂是一種強酸。
26．權利要求24的方法，其中所述陽離子樹脂是一種強鹼。
27．權利要求1的方法，其中所述樹脂也進行了化學處理。
28．權利要求27的方法，其中所述化學處理是用鹽酸、氫氧化鈉或碳酸納進行的。
29．權利要求1的方法，其中所述樹脂是一種離子交換樹脂。
30．權利要求1的方法，其中所述樹脂是一種分級分離樹脂。
31．一種生產穀物增甜劑的方法，其中將所述穀物增甜劑過一種已用酶處理的樹脂，直至該穀物增甜劑已被純化。
全文摘要
本發明涉及一種用於清洗樹脂尤其是離子交換和分級分離樹脂的酶促方法。該方法可單獨使用或與諸化學方法聯合使用。對於包含有汙染物的液體,例如需要進行分級分離或離子交換處理的諸蛋白質、糖類、脂類和殘餘的未轉化的澱粉,本方法均能提高其產量。本發明還涉及用於生產穀物增甜劑,尤其是穀物糖漿和高果糖穀物糖漿的樹脂的用途。
文檔編號A23L1/22GK1226843SQ97196893
公開日1999年8月25日 申請日期1997年7月3日 優先權日1996年7月30日
發明者J·斯萊德 申請人:諾沃挪第克生物化學北美公司