基於dna限制性內切酶雙酶切的長牡蠣基因組簡化方法
2023-12-08 07:47:36 1
基於dna限制性內切酶雙酶切的長牡蠣基因組簡化方法
【專利摘要】本發明涉及獲得牡蠣基因組序列信息的方法，具體的說是一種基於DNA限制性內切酶雙酶切的長牡蠣基因組簡化方法。利用EcoRI和HinfI內切酶雙酶切長牡蠣基因組DNA，酶切片段加上帶有上述內切酶的粘性末端的接頭，而後通過PCR擴增連接上接頭的酶切片段，進而獲得酶切片段的序列信息。本發明的優點在於可以大幅度地降低長牡蠣基因組的複雜情況，只需要較低的成本就可以獲得足夠深度的分子標記，為研究長牡蠣的序列差異提供有利的工具。而且這兩種酶所獲得的酶切片段在基因組上均勻分布，所能獲得的分子標記能夠均勻分布於基因組上，這非常有利於進行遺傳與變異分析。
【專利說明】基於DNA限制性內切酶雙酶切的長牡蠣基因組簡化方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及獲得牡蠣基因組序列信息的方法，具體的說是一種基於DNA限制性內 切酶雙酶切的長牡蠣基因組簡化方法。
【背景技術】
[0002] 分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平 遺傳多態性的直接的反映。理想的分子標記需要以下幾點特徵：1)具有高的多態性，2)共 顯性遺傳，3)能明確辨別等位基因；4)遍布整個基因組；5)表現為中性，不影響目標性狀 的表達，與不良性狀無連鎖；6)檢測手段簡單、快速；7)開發成本和使用成本儘量低廉。幾 種得到廣泛應用的分子標記包括：限制性酶切片段長度多態性（RFLP)、擴增片段長度多態 性（AFLP)、短片段重複（SSR)、單核苷酸多態性（SNP)等。分子標記用途廣泛，可以應用於 遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關係鑑別、基因克隆等方面，如何低成本地獲得 高質量的分子標記對於上述應用具有非常重要的意義。隨著DNA測序技術的發展，測序成 本的降低，SNP受到了越來越多的關注。SNP不僅具有普通分子標記的特點，還精確到單個 核苷酸的多態性，這對於研究遺傳物質變異與生物性狀之間的關聯具有非常重要的作用， 甚至可能發現導致生物性狀發生差異的關鍵突變位點。長牡蠣的基因組已經公布，公布的 數據顯示，長牡蠣基因組具有非常高的雜合度，平均每l〇〇bp就有一個SNP位點，如此多的 SNP非常有利於研究長牡蠣中的分子標記。長牡蠣基因組大小約為560M，對於100隻長牡 蠣以上的項目來說，如果採用全基因組重測序的策略來獲得長牡蠣所有個體中的SNP位點 的話，成本仍然是非常高的。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種基於DNA限制性內切酶雙酶切的長牡蠣基因組簡化方 法。
[0004] 為實現上述目的，本發明採用的技術方案為：
[0005] -種基於DNA限制性內切酶雙酶切的長牡蠣基因組簡化方法，利用EcoRI和Hinfl 內切酶雙酶切長牡蠣基因組DNA，酶切片段加上帶有上述內切酶的粘性末端的接頭，而後通 過PCR擴增連接上接頭的酶切片段，進而獲得酶切片段的序列信息。
[0006] 所述接頭一條帶有barcode序列用以區分每個個體；且另一條為Y型接頭。
[0007] 所述barcode序列長度可為4-9個鹼基，barcode的設計應該滿足以下條件：1)每 兩個barcode之間至少有兩個鹼基是不同的，2)帶有barcode的完整的接頭不應該創造出 新的EcoRI和Hinfl的酶切位點，3)如果使用了多個barcode,那麼這些barcode上四種鹼 基（A、T、C、G)所佔比例要一致。
[0008] 所述接頭1為帶有EcoRI的粘性末端5' -AATT-3';接頭2帶有Hinfl的粘性末端 5, -ANT-3，。
[0009] 所述接頭1為：
[0010] 5' -GATCTACACTCTTTCCCTACACGACG ;TCTTCCGATCTXXXXX-3'
[0011] 3' 一 CTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAXXXXXTTAA - 5'
[0012] 接頭2為：
[0013] 5'-GATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3'
[0014] CGAATTTCAGGGGCGAGAAGGCTAGATNA-5，
[0015] 其中 XXXXX 為 barcode 序列，N 為 A、T、C 或 G。
[0016] 所述取A260/A280為1. 8-2. 0的長牡蠣基因組DNA，利用EcoRI和Hinfl內切酶在 37°C，酶切2h，使基因組DNA被酶切為酶切片段，再在65°C下處理20min使酶失活，而後維 持在8°C。
[0017] 將所述接頭1和2混合，混合後加入酶切產物並在反應體系中22°C下反應2h，使 酶切片段連接上粘性末端的接頭，再在65°C反應20min，使酶失活，而後維持在8°C。
[0018] 所述PCR擴增連接上接頭的酶切片段的引物為：
[0019] 正向引物，
[0020] 5 ' -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '
[0021] 反向引物，
[0022] 5' -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAA-3'。
[0023] 本發明所具有的優點：
[0024] 本發明利用EcoRI和Hinfl這兩種限制性內切酶雙酶切長牡蠣基因組DNA，然後利 用T4DNA連接酶為酶切片段連接接頭。針對接頭序列設計一對引物，這對引物可將兩端帶 有不同酶切識別位點的酶切片段擴增出來。將擴增後的PCR產物利用DNA測序儀測序，獲 得這些酶切片段的信息，從而獲得簡化後的長牡蠣基因組信息。
[0025] 本發明的優點在於可以大幅度地降低長牡蠣基因組的複雜情況，只需要較低的成 本就可以獲得足夠深度的分子標記，為研究長牡蠣的序列差異提供有利的工具。而且這兩 種酶所獲得的酶切片段在基因組上均勻分布，所能獲得的分子標記能夠均勻分布於基因組 上，這非常有利於進行遺傳與變異分析。
[0026] 本發明採用簡化基因組的方法，不僅成本大大降低，而且獲得的SNP質量也會大 幅度提升。本發明在低成本地獲得高質量的SNP位點，採用DNA限制性內切酶雙酶組合酶 切牡蠣基因組DNA，為酶切片段連接上帶有粘性末端的接頭後，通過PCR擴增，得到簡化的 牡蠣基因組，然後利用第二代測序技術，得到簡化的牡蠣基因組序列信息，主要應用於遺傳 圖譜構建、群體遺傳結構分析、重要性狀的關聯分析等研究目的中。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發明實施例提供的提取的四隻長牡蠣的基因組DNA電泳圖；其中，a代表 個體1 ;b代表個體2 ;c代表個體3 ;d代表個體4 ;M代表2K Marker。由圖可以看出4個個 體的DNA完整度很好，無降解，符合實驗要求。
[0028] 圖2為本發明實施例提供的對長牡蠣基因組DNA用EcoRI與Hinfl雙酶切後的酶 切產物電泳圖，以未酶切的長牡蠣基因組DNA作為對照；其中Ml為100bp ladder，M2為2K Marker ;1和2代表個體1的未酶切的基因組DNA，3為個體1的酶切後的基因組DNA ;4和 5代表個體2的未酶切的基因組DNA，6為個體2的酶切後的基因組DNA ;7和8代表個體3 的未酶切的基因組DNA，9為個體3的酶切後的基因組DNA ;10和11代表個體4的未酶切的 基因組DNA，12為個體4的酶切後的基因組DNA。由圖中可以看出，4個個體的酶切後的基 因組DNA片段呈彌散分布，片段中沒有主帶，且4個個體之間一致性好，符合實驗要求。
[0029] 圖3為本發明實施例提供的4個個體的酶切片段連上接頭後用PCR擴增引物進行 PCR擴增後的PCR產物電泳圖。其中Μ代表2K Marker，1代表個體1，2代表個體2, 3代表 個體3,4代表個體4。從圖上可以看出擴增產物主要分布於200bp-1000bp之間，且4個個 體之間一致性好，符合實驗要求。
【具體實施方式】
[0030] 以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
[0031] 本發明基於EcoRI與Hinfl雙DNA限制性內切酶組合的簡化長牡蠣基因組的方 法，利用EcoRI和Hinfl這兩種內切酶雙酶切長牡蠣基因組DNA，為酶切片段加上帶有這兩 種酶的粘性末端的接頭，通過PCR擴增連接上接頭的酶切片段，然後利用Illumina公司生 產的第二代測序儀Illumina Hiseq2000通過100PE的測序方式獲得酶切片段的序列信息。
[0032] 實施例1
[0033] 1)按照月桂酸鈉-酚氯仿異戊醇法提取長牡蠣個體的基因組DNA，具體步驟如 下；
[0034] a)配置月桂酸鈉抽提緩衝液，成分為：Tris-Hcl(pH8. 0)100mmol/L ; NaC1100mmol/L;EDTA(pH8.0)20mmol/L;月桂酸鈉（分子式為（C15H28Na03N)l% ;配製方 法：準確稱取NaC15. 844g，月桂酸鈉10g置於1000mL燒杯中，加入100ml Tris-Hcl(lM)以 及40mLEDTA(0. 5M)、800mlddH20,用鹽酸調節pH至8. 0,定容至1000mL，滅菌後室溫保存。
[0035] b)用剪刀剪取30mg的牡蠣組織（可為鰓、閉殼肌、外套膜），加入用液氮預冷的研 缽中，加入液氮，迅速研磨至粉末，期間保證樣品一直處於液氮中，以防DNA降解。
[0036] c)將研磨好的粉末加入盛有700ul月桂酸鈉抽提緩衝液的1. 5ml離心管中，顛倒 緩慢搖勻，一直到溶液變澄清。
[0037] d)向上述1. 5ml離心管中加入700ul預冷（-20 °C )的酚：氯仿：異戊醇 (25:24:1 (v: v))混合液，緩慢地搖勻。
[0038] e)將上述離心管於12000 rpm，4°C離心10min，取出離心管後，小心吸取上清液 400ul加入新的1. 5ml離心管。
[0039] f)向上述含有400ul上清液的離心管中加入400ul的預冷（_20°C )的異丙醇，上 下緩慢顛倒數次，待液體混合均勻。
[0040] g)將此離心管至於_20°C冰箱中靜置30min。
[0041] h)將上述離心管於12000rpm，4°C離心10min，會看到白色沉澱。
[0042] i)體倒掉，加入 lml70% 乙醇，於 12000rpm，4°C離心 10min。
[0043] j)體倒掉，加入 lml70% 乙醇，於 12000rpm，4°C離心 10min。
[0044] k)液體，將離心管至於室溫下晾乾，等到白色沉澱變得無色透明時，向離心管中加 入100ul的EB溶解緩衝液溶解DNA。
[0045] 而後測量DNA純度與濃度，所使用的儀器為Thermo公司生產的Nanodrop2000,評 價純度的指標為A 26(i/A28(i，即：測量DNA在260nm波長的吸光度與在280nm波長處的吸光度 的比值，比值應處於1. 8-2. 0之間；取A26Q/A28Q為1. 8-2. 0的四隻長牡蠣的基因組DNA進行 電泳檢測；見圖1 ;
[0046] 2)利用EcoRI與Hinfl雙酶切長牡蠣基因組DNA，獲得酶切片段，將酶切後的產物 用1 %的瓊脂糖凝膠檢測，電泳結果見圖2 ;
[0047] 具體，取步驟1)中符合要求的DNA200ng用於酶切，酶切條件為，37攝氏度2h，65 攝氏度20min，維持在8攝氏度；其中，酶切體系為20ul，由3ul的酶切緩衝液，200ng的DNA， 10U的EcoRI，10U的Hinfl，用純水補充至20ul。
[0048] 所述，酶切緩衝液為New England Biology (NEB)公司生產的CutSmart,所用 EcoRI為NEB公司生產的EcoRI-HiFi, Hinfl為NEB公司生產的Hinfl。
[0049] 3)為酶切產物連接接頭；為一端為EcoRI產生的粘性末端，另一端為Hinfl產生 的粘性末端的酶切片段加上接頭；所述接頭中帶有barcode用以區分每個個體；以及Y型 接頭。
[0050] 其中，4隻長牡蠣用到4種不同的barcode序列，分別是：1號個體為AGAGC，2號個 體為TTGTT，3號個體為CGCGT，4號個體為ATTCT。
[0051] 可以根據具體簡化擴增牡蠣其它片段時選用其它不同的barcode序列。
[0052] 具體的接頭有兩種，接頭1帶有EcoRI的粘性末端5'-AATT-3';接頭2帶有Hinfl 的粘性末端5' -ANT-3' ；連接接頭時，接頭1與接頭2的用量不同，接頭1為0. lpmol，接頭 2為15pmol ;使用時按照比例將這兩種接頭配成混合液；
[0053] 所述接頭1為：
[0054] 5' -GATCTACACTCTTTCCCTACACGACG ;TCTTCCGATCTXXXXX-3'
[0055] 3'-CTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAXXXXXTTAA - 5'
[0056] 接頭2為：
[0057] 5'-GATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGiTCTTCCGATCT-3'
[0058] CGAATTTCAGGGGCGAGAAGGCTAGATNA-5' 。
[0059] 連接接頭的反應體系如下：
[0060] 上述酶切產物：20ul ;
[0061] 接頭混合液：5ul ;
[0062] 連接反應體系：15ul;
[0063] 其中連接反應體系如下：
[0064] T4DNA 連接酶：0· 5ul (200U);
[0065] ATP(lOmM) ：4ul ；
[0066] T4DNA連接酶緩衝液：2ul ;
[0067] 純水：8. 5ul ;
[0068] 連接條件為：22攝氏度2h ;65攝氏度20min ;維持在8攝氏度；
[0069] 所述T4DNA連接酶為NEB公司生產的T4DNA連接酶，所述T4DNA連接酶緩衝
[0070] 液為NEB公司生產的T4DNA連接酶緩衝液，所述ATP為NEB公司生產的ATP。
[0071] 4)PCR擴增連接上接頭的酶切片段，PCR擴增所用引物如下：
[0072] 正向引物：
[0073] 5 ' -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '
[0074] 反向引物：
[0075] 5' -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAA-3，
[0076] PCR擴增程序為：
[0077] 95 攝氏度：30s;
[0078] {95攝氏度：30s ;62攝氏度：20s ;68攝氏度：30s ;} 16個循環；
[0079] 72 攝氏度：5min ;
[0080] 4攝氏度：維持溫度；
[0081] 5)電泳檢測PCR產物，電泳結果見圖3 ;用磁珠法（Beckman Agencourt AMPure XP)純化PCR產物；將純化後的PCR產物用Illumina公司生產的第二代測序儀Illumina Hi Seq2000通過100PE的測序方式獲得序列信息。
[0082] 前述的基於DNA限制性內切酶雙酶切的長牡蠣基因組簡化方法，其中所述為酶切 產物連接上接頭，接頭上帶有標識每個個體身份的barcode序列，用以區分測序儀產生的 序列信息，並將序列信息歸給每個牡蠣。將上述4個牡蠣個體的PCR擴增產物根據質量濃度 按照1 :1 :1 :2的比例進行混合；混合樣品利用Illumina公司生產的Hiseq2000採用100PE 的方式進行測序。
[0083] 分析測序結果，將測序結果與長牡蠣參考基因組進行比對，並分析測序reads數 據比對到基因組上的情況。測序reads數及比對情況如表1所示：
[0084] 表1 4個長牡蠣個體測序數據分析結果統計
[0085]
【權利要求】
1. 一種基於DNA限制性內切酶雙酶切的長牡蠣基因組簡化方法，其特徵在於：利用 EcoRI和Hinfl內切酶雙酶切長牡蠣基因組DNA，酶切片段加上帶有上述內切酶的粘性末端 的接頭，而後通過PCR擴增連接上接頭的酶切片段，進而獲得酶切片段的序列信息。
2. 按權利要求1所述的基於DNA限制性內切酶雙酶切的長牡蠣基因組簡化方法，其特 徵在於：所述接頭中帶有barcode序列用以區分每個個體；以及Y型接頭。
3. 按權利要求2所述的基於DNA限制性內切酶雙酶切的長牡蠣基因組簡化方法，其特 徵在於：所述接頭1為帶有EcoRI的粘性末端5' -AATT-3' ；接頭2帶有Hinfl的粘性末端 5, -ANT-3，。
4. 按權利要求3所述的基於DNA限制性內切酶雙酶切的長牡蠣基因組簡化方法，其特 徵在於： 所述接頭1為：其中XXXXX為barcode序列， 5'-GATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTXXXXX-3' 3' 一 CTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAXXXXXTTAA - 5' 接頭2為： 5'-GATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3' CGAATTTCAGGGGCGAGAAGGCTAGATNA-5，。
5. 按權利要求1所述的基於DNA限制性內切酶雙酶切的長牡蠣基因組簡化方法，其特 徵在於：所述取A260/A280為1. 8-2. 0的長牡蠣基因組DNA，利用EcoRI和Hinfl內切酶在 37°C，酶切2h，使基因組DNA被酶切為酶切片段，再在65°C下處理20min使酶失活，而後維 持在8°C。
6. 按權利要求1所述的基於DNA限制性內切酶雙酶切的長牡蠣基因組簡化方法，其特 徵在於：將所述接頭1和2混合，混合後加入酶切產物並在反應體系中22°C下反應2h，使酶 切片段連接上粘性末端的接頭，再在65°C反應20min，使酶失活，而後維持在8°C。
7. 按權利要求1所述的基於DNA限制性內切酶雙酶切的長牡蠣基因組簡化方法，其特 徵在於：所述PCR擴增連接上接頭的酶切片段的引物為： 正向引物， 5 ' -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 ' 反向引物， 5' -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAA-3'。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232620SQ201410491321
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月23日 優先權日:2014年9月23日
【發明者】王金鵬, 李莉, 亓海剛, 杜雪地, 張國範 申請人:中國科學院海洋研究所