米那普侖(1s,2r)對映體在藥品製備方面的用途的製作方法

2023-11-04 13:12:22

專利名稱：米那普侖(1s,2r)對映體在藥品製備方面的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及富含米那普侖(milnacipran)空間構型(1S，2R)對映體的對映體混合物和/或其至少一種代謝物及其藥學上可接受的鹽的用途，該用途是製備用來預防或治療機能紊亂的藥品，這種紊亂通過雙重抑制5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NA)的再吸收得到控制，同時限制心血管紊亂和/或器官和/或組織毒性的風險。更具體地，根據本發明的對映體混合物用來治療抑鬱症、慢性疲乏症候群和尿失禁。
米那普侖(Z(±)-2-(氨甲基)-N，N，-二乙基-1-苯基環丙烷甲醯氨)是由PIERRE FABRE MEDICAMENT Research Centre(Castres，France)合成，也稱為TN-912、dalcipran、minalcipran、米達普侖(midalcipran)或midalipran是一種已知的5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NA)再吸收的雙重抑制劑。在美國專利US4478836中公開了米那普侖及其製備方法。在Merck Index的第12版中可以找到與米那普侖有關的其它信息，登記號為No.6281。
5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NA)再吸收的雙重抑制劑與一類公知的抗抑鬱劑相應，該抗抑鬱劑選擇性地抑制5-羥色胺和去甲腎上腺素的再吸收。作為例子，文拉法辛和度洛西汀也是5-羥色胺和去甲腎上腺素的雙重抑制劑。研究已表明米那普侖對去甲腎上腺素再吸收的抑制與對5-羥色胺再吸收的抑制比率大約為2∶1(Moret et al.，1985 Neuropharmacology 24(12)1211-1219；Palmier et al.，1989，Eur JClin Pharmacol 37235-238)。
美國專利4,478,836描述了米那普侖在治療中樞神經系統紊亂，尤其是抑鬱症方面的用途。專利申請WO01/26623描述了與苯丙氨酸和酪氨酸一起使用米那普侖在治療適應症如疲勞、疼痛症候群、慢性疲乏症候群、纖維肌痛和過敏性腸症候群中的用途。專利申請WO01/62236描述了一種含有米那普侖的組合物，其和一種或幾種抗毒蕈鹼劑一起用於許多適應症，包括抑鬱症。申請WO97/35574描述了一種藥學組合物，其含有米那普侖和咪唑克生，作為相關產品同時、單獨或在時間上交錯用於治療抑鬱症及其各種形式，以及使用抗抑鬱劑的紊亂。米那普侖也被指明可用來治療尿失禁(FR2759290)。
米那普侖分子含有兩個不對稱碳，產生了兩種不同的空間構型(1S，2R)和(1R，2S)。因為上述空間構型不可疊加，從而使米那普侖分子顯示光學異構性。
因此，鹽酸米那普侖以兩種光學活性對映體的形式存在右旋對映體或Z-(1S，2R)-2-(氨甲基)-N，N，-二乙基-1-苯基環丙烷甲醯氨鹽酸鹽和左旋對映體Z-(1R，2S)-2-(氨甲基)-N，N，-二乙基-1-苯基環丙烷甲醯氨鹽酸鹽。米那普侖以其鹽酸鹽形式(也稱作F2207)目前在市場上作為一種含血清素和產生去甲腎上腺素的抗抑鬱藥以外消旋混合物的形式銷售(IXEL，PIERRE PABRE MEDICAMENT，France)。F2695和F2696分別代表鹽酸米那普侖(F2207)的右旋(1S，2R)和左旋(1R，2S)對映體 可採用文獻(Bonnaud et al.，1985，Journal ofChromatography，vol.318398-403；Shuto et al.，Tetrahedron letters，1996Vol.37641-644；Grard et al.，2000，Electrophoresis 2000 213028-3034；Doyle and Hu，2001，Advanced Synthesis and Catalysis，Vol.343299-302)中描述的方法分離這兩種對映體。
現在，發明人已在人身上進行了對米那普侖的外消旋物和兩種對映體的藥物代謝動力學研究，採用了對映體選擇性分析方法。因此，他們已經證實了在體內不存在對映體的外消旋作用。
此外，儘管已經解決了外消旋物，但未採用當前可用的現代方法如通過遙測術進行心血管測量或用於預測性的藥理毒理學體外基因組分析，對兩種對映體的藥理學和毒理學特性進行分析。
如同任何活性物質一樣，抗抑鬱藥可誘導有害結果或某些毒副作用，這些基本上是源於藥物的藥理學性質和劑量、病人的個體差異(基因多態性、功能器官機能不全、性別、年齡)或藥物的相互作用。因此，抗抑鬱藥是僅次於催眠藥和鎮定劑後的第三種最常見的容易引起中毒的產品(Nores et al.，1987 Therapie 42555-558)。過量服用抗抑鬱劑的風險是嚴重的，因為其可致死。在服用抗抑鬱劑引起急性中毒的原因中，應當提到小孩的意外攝食(較多情況由於某些抗抑鬱劑用來治療遺尿)、企圖自殺、醫師的意外用藥過量、老年病人的伴隨藥物、與年齡相關的生理學和藥物代謝動力學變化(心機能不全、肝和/或腎機能不全......)和先天性遺傳的或藥物誘導的代謝減慢(酶抑制)。因此，繼小孩之後，在被治療的病人中，老年人代表了第二大危險群體。與腎和/或肝的清除減少相關，老年人具有較高的血漿濃度，中毒的風險更加嚴重(Meadoer-Woodruff et al.，1988 J.clim.Psychopharmacol.828-32)。
在服用米那普侖治療期間觀察到的不良副作用(大體上是良性的)通常出現在治療的第一周或前兩周並隨後減少，與抑鬱症的改善平行。在單藥治療或與其它擬精神藥物一起使用時，最常報導的有害事件為頭昏眼花、汗多、焦慮、熱潮和排尿困難。報導較少的有害事件為噁心、嘔吐、口乾、便秘、震顫、心悸、興奮和皮疹。而且，已經知道在具有心血管病病史的病人或那些同時接受心臟病治療的人中，米那普侖可增加心血管有害事件的發生率(高血壓、低血壓、直立性低血壓、心悸)。因此，在患有高血壓或心臟病的病人中，推薦增加醫務監督，因為以外消旋混合物形式存在的米那普侖有可能增加心率。在單藥治療中，在為數很少的、過量服用米那普侖單藥治療中(劑量從800mg到1g)，觀察到的主要症狀為嘔吐、呼吸紊亂和心動過速(韋氏(Vidal)詞典，第78版，2002)。另一種由米那普侖偶然誘導的有害事件為轉氨酶水平升高，反映為某種肝中毒。
在服用米那普侖治療期間或之後，有可能發生一定數量的不良臨床表現的危險群體是小孩、老年人、患有肝和/或腎機能不全的病人、接受可誘導器官和/或組織毒性尤其是肝和/或腎毒性治療的病人、接受心臟病治療或可誘導心血管副作用治療的病人、具有心血管病病史和/或患有心血管紊亂的病人，尤其是那些患有心律失調、血壓紊亂(低或高血壓)的病人以及患有心臟病的病人。
為了在更大程度上預防對接受米那普侖治療的病人可形成危險(無論多小)的可能副作用的出現，本發明人現在已驚人地且出乎意料地發現，基本上對引起5-羥色胺和去甲腎上腺素再吸收的選擇性抑制活動起作用的米那普侖的(1S，2R)對映體比外消旋混合物誘導出更少的心血管副作用和較少的器官和/或組織毒性，尤其是肝。特別是，本發明人發現，對狗進行米那普侖的(1S，2R)對映體給藥後比進行外消旋混合物給藥所導致的心率和血壓的增加要少，尤其是心臟舒張血壓。而且，本發明人發現，在採用初生鼠肝細胞的實驗模型中，米那普侖的(1S，2R)對映體(F2695)鹽酸鹽比米那普侖的(1R，2S)對映體鹽酸鹽(F2696)具有更好的基因組毒性圖形。本發明人也證實了(1R，2S)對映體(F2696)具有與採用羥甲金黴素獲得的相似的基因組毒性圖形，羥甲金黴素由於其相對的肝毒性而被用作精神調理性物質對照品。
因此，本發明的目的在於使用富含(1S，2R)對映體的米那普侖對映體混合物，優選基本上純的F2695對映體及其藥學上可接受的鹽，來製備用來預防或治療失調症狀的藥物。該症狀可通過雙重抑制5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NA)的吸收來控制，同時限制心血管紊亂的風險和/或限制器官和/或組織毒性的風險。
術語「心血管紊亂」可理解為單獨給藥或與其它活性物質聯合給藥時帶來的不良心血管副作用。
為實現本發明的目的，術語「副作用」可理解為在除給藥區域之外的另一個區域內的可預知的藥物活性，當它限制了藥物的使用時，該作用是討厭的或不受歡迎的。
術語「毒性」可理解為可對器官或組織進行有害誘導作用的藥物性質，尤其是米那普侖代謝過程中涉及的器官或組織，特別是米那普侖的肝和/或腎代謝，更特別是米那普侖首次通過肝臟期間。優選地，器官毒性為心臟毒性並且所述組織毒性為肝和/或腎毒性。
為了實現本發明的目的，詞語「同時限制心血管紊亂的風險」或「同時限制毒性風險」可理解為對病人給藥後，預防這些風險大大增加的事實。
為了實現本發明的目的，術語「米那普侖的(1S，2R)對映體」表示米那普侖的(1S，2R)對映體及其藥學上可接受的鹽。優選米那普侖的(1S，2R)對映體(F2695)鹽酸鹽。「米那普侖的(1R，2S)對映體」表示米那普侖的(1R，2S)對映體及其藥學上可接受的鹽，如鹽酸鹽(F2696)。「外消旋混合物」表示重量比為50∶50的米那普侖的(1S，2R)對映體和米那普侖的(1R，2S)對映體及其藥學上可接受的鹽。
為了實現本發明的目的，「富含(1S，2R)對映體的米那普侖對映體混合物」指米那普侖的(1S，2R)對映體和(1R，2S)對映體的混合物，其中，(1S，2R)對映體與(1R，2S)對映體的質量比大於1∶1。在富含(1S，2R)對映體的米那普侖對映體混合物中，(1S，2R)對映體與(1R，2S)對映體的質量比優選大於或等於55∶45，更優選大於60∶40，甚至更優選大於75∶25，甚至更優選大於80∶20。採用特別有利的方式生產，(1S，2R)對映體與(1R，2S)對映體的質量比優選大於82∶18，在更有利的方式中大於84∶16，在甚至更有利的方式中大於86∶14，在甚至更有利的方式中大於88∶12，在甚至更有利的方式中大於90∶10。採用優選的方式生產，(1S，2R)對映體與(1R，2S)對映體的質量比大於91∶9，在更優選的方式中大於92∶8，在甚至更優選的方式中大於93∶7，在甚至更優選的方式中大於94∶6，在甚至更優選的方式中大於95∶5，在甚至更優選的方式中大於96∶4，在甚至更優選的方式中大於97∶3，在甚至更優選的方式中大於98∶2，在甚至更優選的方式中大於99∶1，在甚至更優選的方式中大於99.5∶0.5。在特別優選的方式中，富含(1S，2R)對映體的米那普侖對映體混合物基本上是純的，即含有重量百分比近似為100％的(1S，2R)對映體。
代謝物的用途也屬於本發明的範圍，優選在體內有活性的米那普侖代謝物及其藥學上可接受的鹽，如Z-(±)苯基-1-氨甲基-2-環丙烷羧酸鹽酸鹽(F1567)
分子量277.7性狀白色晶體熔點230℃平板色譜介質二氧化矽溶劑丁醇/乙醇/水(6/2/2)展開紫外線和茚三酮Rf0.6(±)苯基-3-亞甲基-3-4-吡咯烷酮-3(F1612) 分子量173.2性狀白色晶體熔點70℃平板色譜介質二氧化矽溶劑苯/二氧雜環乙烷/乙醇(90/25/4)展開紫外線和碘Rf0.46Z(±)-(對羥基苯基)-1-二乙基氨基羰基-1-氨甲基-2-環丙烷鹽酸鹽(F2782)
分子量298.82性狀白色晶體熔點250℃平板色譜介質二氧化矽溶劑丁醇/乙醇/水(6/2/2)展開紫外線和碘-茚三酮Rf0.42Z(±)-苯基-1-乙基氨基羰基-1-氨甲基-2-環丙烷草酸鹽(F2800) 分子量308.33性狀白色晶體熔點150℃平板色譜介質二氧化矽溶劑CHCl3/甲醇/NH4OH(90/9/1)展開紫外線和茚三酮Rf0.40Z(±)-苯基-1-氨基羰基-1-氨甲基-2-環丙烷鹽酸鹽(F2941) 分子量226.74
性狀白色晶體熔點245℃平板色譜介質二氧化矽溶劑CHCl3/甲醇/NH4OH(80/18/2)展開紫外線和茚三酮Rf0.30正如米那普侖一樣，這些代謝物具有兩個不對稱碳，產生了兩種不同的空間構型(1S，2R)和(1R，2S)。因為這些空間構型為不可疊合，因此這些代謝物也顯示空間異構性。在米那普侖代謝物的兩種對映體的對映體混合物中，兩種對映體的比率與上述米那普侖對映體相同。
因此，本發明涵蓋這些活性代謝物、它們的對映體及其藥學上可接受的鹽，以及它們作為藥物治療本專利所述紊亂的用途如抑鬱症、疼痛、纖維肌痛和尿失禁。根據本發明的代謝物為外消旋體形式或優選為富含最具活性的對映體(1S，2R)的對映體混合物形式。在優選的方式中，使用的活性代謝物來自F2695對映體並且為活性代謝物的對映體(1S，2R)。在更優選的方式中，它是Z-(對羥基苯基)-1-二乙基氨基羰基-1-氨甲基-2-環丙烷鹽酸鹽(F2782)的對映體(1S，2R)。術語「活性代謝物」可理解為代表一種衍生物，其來自於米那普侖在體內或體外的代謝物，並具有抑制5-羥色胺和去甲腎上腺素再吸收的能力；優選F2782、F2941、F2800、F1612和F1567。
因此，本發明的目的是使用一種對映體混合物，優選富含米那普侖的至少一種代謝物的對映體(1S，2R)，優選自F2782、F2941、F2800、F1612和F1567及其藥學上可接受的鹽，來製備用於預防或治療紊亂或症狀的藥物，該紊亂或症狀可通過雙重抑制對5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NA)再吸收進行治療，，同時限制心血管紊亂的風險和/或限制器官和/或組織毒性，尤其是心臟、肝和/或腎毒性。
使用富含對映體(1S，2R)的米那普侖對映體混合物，優選基本上純的F2695對映體，及其至少一種代謝物，優選自F2782、F2941、F2800、F1612和F1567，並優選富含對映體(1S，2R)，來製備用來預防或治療紊亂或症狀的藥物，該紊亂或症狀可通過雙重抑制對5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NA)的再吸收而實現治療，同時限制心血管紊亂的風險和/或限制器官和/或組織毒性，特別地，心臟、肝和腎毒性也處於本發明的範圍內。
「藥學上可接受的鹽」代表所有的保留活性物質的功效和性質並且不導致副作用的鹽。優選地，這些為礦物或有機酸的藥學上可接受的鹽。作為實例，但並非局限於此如鹽酸鹽和溴酸鹽這樣的滷鹽、延胡索酸鹽、馬來酸鹽、草酸鹽、檸檬酸、甲基磺酸鹽、穀氨酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽及其可能的水合物。
為了實現本發明的目的，術語「對映體混合物」表示富含對映體(1S，2R)的米那普侖對映體混合物及其藥學上可接受的鹽，和/或米那普侖至少一種代謝物的對映體混合物，優選富含對映體(1S，2R)及其藥學上可接受的鹽。
根據本發明的對映體混合物，優選基本上純的F2695對映體，不管是出於治療和/或預防目的，對需要上述治療的所有類型的病人進行給藥。對於治療目的，其目的是根除或改善要治療的症狀和/或一種或多種相關症狀。對於預防目的，其目的是預防要治療的症狀和/或一種或多種相關症狀的出現。儘管如此，根據本發明的對映體混合物尤其適用於有危險的病人群體，他們在服用外消旋體形式的米那普侖期間或之後有可能出現某些不利的臨床表現。這些群體主要是小孩、老年人、患有肝和/或腎機能不全的病人、接受了誘導肝和/或腎器官和/或組織毒性治療的病人、接受心臟病治療的病人、接受了誘導心血管副作用治療的病人、具有心血管疾病(例如，心肌梗塞)病史和/或患有心血管紊亂的病人如心律失調(心動過速、心動過緩、心悸)、血壓紊亂病人(低或高血壓)或患有心臟病的病人。
在具有如心律失調症狀，以及本發明特別適用的、用於治療患有這類疾病的危險病人的眾多紊亂或症狀中，應當提及相應於心跳節律加速的心動過速(當心率為80-100/分鐘時，心動過速為適中的，當其超過100時為嚴重的)、心悸、期外收縮(偶發性的、頻繁的或心肌梗塞期間)、心房纖維性顫動、撲動和心房心動過速、心動過緩、心機能不全和心肌梗塞。
在具有如血壓紊亂症狀，以及本發明特別適用的、用於治療患有這類疾病的危險病人的眾多紊亂或症狀中，應當提及動脈高血壓、惡性動脈高血壓、肺動脈高血壓、門靜脈高血壓、陣發性的原發性高血壓、低血壓、直立性低血壓和顱內高血壓。
有利地，通過給藥根據本發明的對映體混合物，並且優選通過給藥基本上純的F2695對映體，可以限制心血管紊亂的風險，這些心血管紊亂如下 以毫米汞柱(mmHg)測量的心臟舒張和/或心臟收縮血壓升高；更具體地，這是心臟舒張血壓升高，和/或， 心律失調，尤其是病人的心率升高。
心臟收縮血壓為血壓最高值，對應於測量血壓期間在肱骨動脈聽到第一次心聲的時刻。心臟收縮為心臟循環的間隔，這期間心腔收縮，引起血液排出。心臟舒張血壓為血壓最低值，對應於測量血壓期間，血壓計的套子被放氣時，心聲在肱骨動脈內的消失。心臟舒張為心臟循環的間隔，這期間心腔充血。心臟舒張和/或心臟收縮血壓升高是指以全身動脈高血壓(及其變形)為特徵的血壓升高，其症狀可以如下頭疼、疲勞、輕微的感覺中樞失調如頭昏眼花、耳鳴、心悸、鼻出血、精神錯亂或嗜睡、抽筋、手足麻木或麻刺。全身動脈高血壓(及其變形)可引起嚴重的實際上為致命的併發症腦血管意外傷害、左心室心力衰竭、腎衰竭、局部缺血性心臟病(心肌梗塞、絞痛及其變形)。根據目前的經驗，當他/她的心臟舒張血壓高於90mmHg並且他/她的心臟收縮血壓高於140mmHg時，病人被視為患有動脈高血壓。
有利地，通過給藥根據本發明的對映體混合物而可以限制其風險的毒性為器官毒性，尤其是心臟毒性和/或組織毒性，特別是肝和/或腎毒性。組織毒性可以通過黃疸的存在或試驗標記物而證實。
根據本發明的對映體混合物在治療動物，尤其是需要這種治療的家庭寵物或飼養的動物的獸藥中的使用也落入本發明的範圍內。
由於它們的藥學性質，尤其是作為5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NA)再吸收的雙重抑制劑，對映體混合物特別適用於製備用來預防和/或藥物治療以下描述的許多紊亂和症狀(症候群)的藥物，同時限制心血管紊亂的風險和/或限制器官和/或組織毒性，尤其是心臟、肝和/或腎毒性。
在這些紊亂或症狀中，應當提及中樞神經系統紊亂，如在「TheDiagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-IV(DSM-IV)，1995美國精神病學協會」中定義的。作為實例，但並非局限於此，應當提及下述紊亂和症狀抑鬱症尤其是深度抑鬱症、抵抗性抑鬱症、老年抑鬱症、精神病性抑鬱症、採用幹擾素治療引起的抑鬱症、抑鬱狀態、燥狂抑鬱症候群、季節性的抑鬱發作、與大眾健康狀況相關的抑鬱發作、與改變心情物質相關的抑鬱發作、兩極細胞疾病、精神分裂症、廣泛性焦慮症、鬱悶和衰弱狀態、與壓力相關的疾病、恐慌發作、恐怖症尤其是廣場恐怖症、強迫觀念與行為紊亂、行為紊亂、對抗性紊亂、創傷後的壓力紊亂、免疫系統抑鬱症、疲勞和伴隨性的疼痛症候群、慢性疲勞症候群、纖維肌痛和其它功能性的軀體紊亂、孤獨症、具有由於公眾健康狀況引起的注意力缺陷特徵的紊亂、飲食紊亂、神經性貪食症、神經性厭食、肥胖、精神障礙、冷漠、偏頭痛、疼痛並且尤其是慢性疼痛、應激性腸症候群、心血管疾病並且尤其是在心肌梗塞或高血壓中的焦慮抑鬱症症候群、抑制神經疾病和相關的焦慮抑鬱症症候群(阿爾茨海默氏病、慢性進行性(Huntington)舞蹈病、帕金森病)、尿失禁尤其是與壓力和遺尿有關的尿失禁、藥癮並且尤其是對菸草特別是對尼古丁、對酒精、對麻醉藥、對藥物、對用於脫離這些成癮狀態的止痛劑的焦慮癮。
更具體地，本發明的目的在於使用根據本發明的對映體混合物，優選基本上純的F2695對映體，來製備用於治療或預防抑鬱症或抑鬱狀態的藥物，同時限制心血管紊亂的風險和/或限制器官和/或組織毒性，尤其是肝和/或腎毒性。在本發明文中，術語「抑鬱症」可理解為症狀群，其一方面具有心理方面，由悲觀情感紊亂、道德痛苦、死亡或自殺想法、精神抑制組成，另一方面為運動原短缺的身體方面，尤其是由運動原活性下降、食慾紊亂、便秘、睡眠紊亂和體重控制紊亂組成。因此，抑鬱症相應於病理心理狀態，結合了痛苦的心情改變以及精神和運動原活性的減弱。術語「抑鬱狀態」可理解為精神狀態，其特徵在於神經心理毒性下降，表現為疲乏、疲勞傾向、氣餒和悲觀傾向，有時伴隨有焦慮。
而且，更具體地，本發明的目的在於使用根據本發明的對映體混合物，優選基本上純的F2695對映體，來製備用於治療或預防纖維肌痛和/或慢性疲勞症候群的藥物，同時限制心血管紊亂風險和/或限制器官和/或組織毒性，尤其是肝和/或腎毒性。纖維肌痛症候群為一種慢性症候群，其特徵為痛苦感和清晨堅硬燒傷感，主要影響關節和圍關節的纖維組織，以及深度疲勞感。纖維肌痛包括一個症狀群。最常見的為不可恢復性的睡眠、頭痛、消化紊亂、抑鬱狀態、肌肉痙攣、面部疼痛、麻木等。慢性疲勞症候群的特徵為衰竭或疲勞。最常見的症狀為虛弱、痙攣和/或肌肉疼痛、嗜睡、發燒、絞痛、記憶力喪失和/或集中困難、失眠、抑鬱症。
此外，更具體地，本發明的目的在於使用根據本發明的對映體混合物，優選基本上純的F2695對映體，用於製備用來治療或預防疼痛並且尤其是慢性疼痛的藥物，同時限制心血管紊亂風險和/或限制器官和/或組織毒性，尤其是肝和/或腎毒性。疼痛可以與各種紊亂和/或創傷有關。它可以是急性或慢性的。流行病學研究已經證明了慢性疼痛與焦慮和抑鬱症之間的關係。因此，患有慢性疼痛的病人可出現導致抑鬱症的感情問題，並且，在更壞的情況下，發展到自殺傾向。如果他/她抱怨疼痛的時間超過6個月，病人被視為處於慢性疼痛中。在慢性疼痛的各種形式中，作為實例，但並非局限於此，應當提及以下這些與纖維肌痛相關的疼痛和/或在纖維組織、肌肉、腱和其它部位中所引起的疼痛、腹痛和應激性腸症候群中的腹瀉以及下背疼痛。
此外，更具體地，本發明的目的在於使用根據本發明的對映體混合物，優選基本上純的F2695對映體，用來製備用於治療或預防尿失禁並且尤其是與壓力和遺尿相關的尿失禁的藥物，同時限制心血管紊亂風險和/或限制器官和/或組織毒性，尤其是肝和/或腎毒性。
通過對動物，優選人，給藥有效治療量的根據本發明的對映體混合物，優選基本上純的F2695對映體，單獨或與至少一種其它活性物質一起，可以實現對上述紊亂的預防和治療學的治療。在大多數情況下，這種治療用於人，然而，也適用於動物，尤其是飼養的動物(牲畜、齧齒動物、家禽、魚......)以及家畜(狗、貓、兔子、馬.....)。
如上所述，有利地，在治療上述紊亂時，可以將富含(1S，2R)對映體的米那普侖對映體混合物和/或其至少一種代謝物及其藥學上可接受的鹽對同時、單獨或在時間上交錯接受至少一種其它活性化合物的病人進行給藥。
優選地，作為藥物來使用本發明的目的還包括a)富含米那普侖(1S，2R)對映體的對映體混合物和/或其至少一種代謝物及其藥學上可接受的鹽，和b)至少一種選自擬精神藥物(psychotropics)活性化合物，尤其是抗抑鬱藥和抗毒蕈鹼藥，它們作為相關產品，同時、單獨或在時間上交錯用於治療或預防抑鬱症尤其是深度抑鬱症、對抗性抑鬱症、老年抑鬱症、精神病抑鬱症、採用幹擾素治療引起的抑鬱症、抑鬱狀態、燥狂抑鬱症候群、季節性的抑鬱發作、與大眾健康狀況相關的抑鬱發作、與改變心情物質相關的抑鬱發作。
術語「擬精神藥物」可理解為表示一種天然的或人工物質，能夠更改精神活動，其活動基本上施加在中樞神經系統和精神狀態上。擬精神藥物分為三組1)精神抑制藥(催眠藥、精神安定劑和抗焦慮藥)，2)精神興奮劑(抗抑鬱劑和精神增強劑)，和3)精神性睡眠困難藥(幻覺劑)。
優選地，所述擬精神藥物為一種抗抑鬱劑。作為實例，但並非局限於此，該抗抑鬱劑選自(i)單胺氧化酶抑制劑(MAOIs)，如異煙醯異丙肼、巴吉林、selegine，(ii)5HT1D-拮抗劑，如舒馬普坦、腎上腺素和去甲腎上腺素(α和β類交感神經藥物)(iii)三環抗抑鬱劑，如丙咪嗪、氯米帕明(iv)選擇性的5-羥色胺再吸收抑制劑(SSRIs)，如氟西汀，(v)選擇性的去甲腎上腺素再吸收的抑制劑，如坦達明、氟洛克生、米氮平，(vi)5-羥色胺和去甲腎上腺素再吸收的抑制劑，如文拉法辛和度洛西汀。作為實例，但並非局限於此，該抗毒蕈鹼劑選自託特羅定、丙哌凡林、奧昔布寧、trospium、darifenacine、替米維林、異丙託銨。
優選地，作為藥物使用本發明的目的也包括a)所述富含米那普侖(1S，2R)對映體的對映體混合物和/或其至少一種代謝物及其藥學上可接受的鹽，和b)至少一種其它活性物質，選自可誘導器官毒性的活性化合物和可誘導組織毒性尤其是肝和/或腎毒性的活性化合物，或與一種或多種活性物質一起用來治療肝或腎機能不全，它們作為相關產品，同時、單獨或在時間上交錯用於治療或預防症狀或紊亂，該症狀或紊亂可通過雙重抑制5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NA)的再吸收來治療。
優選地，本發明的目的也包括將如下物質用作藥物a)所述富含米那普侖的(1S，2R)對映體的對映體混合物和/或其至少一種代謝物及其藥學上可接受的鹽，和b)至少一種其它活性物質，選自可誘導心血管副作用的活性化合物或用來治療心臟病的化合物，它們作為相關產品，同時、單獨或在時間上交錯用於治療或預防症狀或紊亂，該症狀或紊亂可通過雙重抑制5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NA)的再吸收來治療。
有利地，所誘導的心血管副作用為以上提到的那些，更具體地為動脈高血壓、低血壓、心律失調(心動過速、心動過緩、心悸)。
本發明的目的也包括含有上述相關產品的藥學組合物。
在本發明文中，根據本發明的對映體混合物，優選基本上純的F2695對映體，如前所述，單獨或與其它活性物質一起，以優選但並非是一種限定方式，經由口腔途徑、經鼻途徑、經皮的、直腸的、腸內的或腸胃外的、採用肌內的、皮下的或靜脈內注射途徑給藥。
當單獨給藥時，根據本發明的對映體混合物，優選基本上純的F2695對映體，可以自身或以藥物組合物的方式給藥，其中，所述對映體混合物或其藥學上可接受的鹽，與一種或幾種介質、藥學上可接受的賦形劑和/或稀釋劑組合或混合，專門用於提高生物利用度。
當根據本發明的對映體混合物，並優選基本上純的米那普侖(1S，2R)對映體F2695，與其它活性物質一起給藥時，所述混合物和其它活性物質可以以相同的或不同的形式製成一種混合物，或者為單獨的。他們可以通過相同或不同的路徑給藥。
採用一種或多種生理上可接受的介質，包括賦形劑、輔藥和添加劑，如防腐劑、穩定劑、潤溼劑或乳化劑，本發明的藥學組合物可以製成本領域技術人員公知的常規形式。選擇的製備方法取決於預期的給藥途徑。
在通過注射給藥的情況下，優選使用水溶液，尤其是生理上可接受的緩衝液，如漢克氏(Hank’s)溶液、林格(Ringer』)溶液或生理鹽水。在經皮或通過黏膜給藥的情況下，優選使用跨黏膜的適當滲透劑。所述滲透劑為本領域技術人員公知的。在口服給藥的情況下，根據本發明的藥學組合物優選以單位劑量或多劑量方式給藥，混合物中含有本領域技術人員公知的適當藥學介質。適當的單位劑量給藥方式特別包括有可能帶槽的片劑、膠囊、粉末、顆粒、口服液或懸浮液和氣溶膠。適當的多劑量給藥方式特別包括可飲用的點滴、乳劑和糖漿。
在製備片劑時，根據本發明的對映體混合物，優選基本上純的F2695對映體，與藥學上可接受的賦形劑一起製備，賦形劑尤其是如聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯半乳糖、聚乙烯乙二醇、動物膠、雲母、澱粉、乳糖、硬脂酸鎂、阿拉伯膠或其類似物。作為實例，片劑含有以下賦形劑磷酸氫鈣二水合物、鈣羧甲醚纖維素、聚烯吡酮K30、無水膠狀二氧化矽、硬脂酸鎂、雲母。片劑也可以布衣，即塗布有多種物質如蔗糖的幾個塗層，以方便吞咽或保存。塗層也可以含有染料或著色劑，以便區分和對片劑定性，例如，相應於它們的劑量強度。為了改變活性物質的釋放率，片劑也可以或多或少的合成製劑形式存在。所述片劑的活性物質的釋放可以是快速的、持續的或延時的，取決於預期的吸收。因此，根據本發明的對映體混合物，優選基本上純的F2695對映體，可以製成如在專利EP939626中描述的方法獲得的藥物形式，用於持續釋放。該藥物形式以多粒子的形式存在，含有大量的小顆粒並在體外具有確定的釋放圖形。
通過採用植入管或通過經皮傳輸，尤其是皮下的或肌內的，經由肌內注射或經皮的皮膚接觸，根據本發明的對映體混合物的釋放可以為延時的和/或控釋的。特別地，所述混合物隨後與適當的疏水的或聚合的物質以及離子交換樹脂一起製備。
根據本發明的對映體混合物，優選基本上純的F2695對映體，病人的給藥量取決於被治療的狀況、預期效果，尤其是治療或預防效果、健康狀況和病人的年齡，特別是他/她的心血管疾病醫療史、治療條件和給藥方法。在病人中，用於有效治療或預防用途的需要給藥的數量可以根據動物模型或本領域公知的數據來確定，例如，在治療人抑鬱症期間獲得的使用米那普侖的外消旋混合物的量。
在治療性和/或預防性地治療以上提到的紊亂時，尤其是抑鬱症、抑鬱狀態、纖維肌痛、慢性疲勞症候群、疼痛，根據本發明的藥物給藥劑量優選一次或多次攝取0.01-10mg/kg體重/天，更優選一次或多次攝取0.05-5mg/kg體重/天，並且甚至更優選一次或多次攝取0.1-1mg/kg體重/天。在特別有利的方式中，以上述劑量給藥所述醫藥產品時，分為每日2次，優選膠囊形式。作為實例，根據本發明的對映體混合物，優選基本上純的F2695對映體，優選以膠囊形式給藥，每個膠囊大約含有6.75mg、12.5mg、25mg、50mg活性物質。
通過以下的實施例，本發明的其它特徵、目的和優勢將會變得顯而易見。本發明並非局限於這些特定的實施例，其僅僅作為實例而被提供並且應當對照附圖來閱讀。
附1單次給藥後的心率變化(Δ值)。
***相對於去離子水，p≤0.001**相對於去離子水，p≤0.01*相對於去離子水，p≤0.05Δ相對於F2207，p≤0.05圖2單次給藥後的心率變化(絕對值)。
***相對於去離子水，p≤0.001**相對於去離子水，p≤0.01*相對於去離子水，p≤0.05Δ相對於F2207，p≤0.05圖3各種治療對心臟舒張血壓平均值的影響(連續治療5天後，在最後一次攝取後超過6小時的平均值)。
圖4各種治療對心臟收縮血壓平均值的影響(連續治療5天後，在最後一次攝取後超過6小時的平均值)。
圖5計算毒性指數的方法示意圖。毒性指數為所有上升和下降調節基因的總和(與用戶定義的誘導因子有關)。
圖6a、6b、6c初生鼠肝細胞的MTT分析。濃度以μM表示。
實施例實施例1米那普侖及其對映體的藥物代謝動力學研究在多種動物和人身上，對米那普侖(F2207)及其對映體(F2695和F2696)鹽酸鹽進行了藥物代謝動力學研究。
在動物中給藥外消旋物或一種單一的對映體後，研究了每一對映體的藥物代謝動力學。F2695和F2696對映體的血漿濃度在測試的動物物種中近似相等(猴和鼠)。
在人身上進行的藥物代謝動力學研究涉及12個健康的受試者，通過給藥外消旋物或單獨給藥兩種對映體之一而得以進行。結果顯示出每種對映體的藥物代謝動力學圖形與是否單獨給藥或以外消旋物的形式給藥無關，進而表明了對映體間不存在相互作用(表1)。
表1米那普侖鹽酸鹽(F2207)及其兩種對映體F2695和F2696的主要藥物代謝動力學變化表。
Cmax直接根據試驗數據進行估計的最大血漿濃度Tmax到達最大血漿濃度的時間AUC0-∞在血漿濃度曲線下的面積，與外推到無窮時的時間有關T1/2血漿濃度下降的終點半衰期
這些發現表明在所研究的物種中未檢測到F2695或F2696對映體的生物轉化。
實施例2米那普侖及其對映體的生化研究在體外研究了米那普侖鹽酸鹽(F2207)的兩種對映體(F2695和F2696)對5-羥色胺和去甲腎上腺素的吸收以及在鼠大腦中對帕羅西汀的結合的影響。
2.1材料和方法2.1.1鼠丘腦下部的勻漿(P2)對去甲腎上腺素的吸收P2的製備將200-300g的雄性斯普拉-道來氏(Sprague-Dawley)鼠打暈並砍頭，迅速取出丘腦下部。在Potter S上，在每分鐘轉數為800rpm，通過將兩個丘腦下部在4ml 0.32M的蔗糖中完全地來回經過16次而實現均勻化，隨後在1000g離心10min以除去細胞碎片。上清液在10000g離心20min並將因此得到的P2回收在4ml 0.32M的蔗糖中，在杜恩斯勻漿器上進行均勻化。
吸收3H-(1)-NA採用了13Ci/mmol(安瑪西亞(Amersham))。
該吸收在磷酸緩衝液(每升含有8g NaCl、1.21g K2HPO4和0.34gKH2PO4)中進行，使用前用O2/CO2的混合物(95％/5％)預氧化30min。
向放置在37℃水浴中的5ml塑料管中加入-100μl緩衝液或抑制劑，-700μl緩衝液(含有25μM的巴吉林)-100μl P2。
溫度平衡後，加入100μl最終濃度為50nM的3H-NA使反應開始。
剛好10min後，加入2.5ml冷藏緩衝液停止反應，並通過GF/F過濾器進行過濾。然後，用2.5ml冷藏緩衝液清洗試管和過濾器各一次。接著，將過濾器引入貝克曼(Beckman)迷你瓶中，並在加入3mlInstagel(惠普公司生產)液體閃爍體後，用Tricard惠普公司的液體閃爍計數器測量放射性。
當存在10-5M DMI時，測定非專門吸收(NS)。
採用以下公式計算抑制百分比[(總吸收-NS)-(存在抑制劑時的吸收-NS)]/(總吸收-NS)從抑制百分比的平均曲線圖形上測定IC50(4次分析)，與抑制劑濃度的對數有關。
2.1.2對5-羥色胺的吸收該方法是對Gray和Whittaker(1962，J.Anat.，9679-97)的方法的發展。在蔗糖溶液中將腦組織均勻化後，將突觸前終末從軸突脫離並靠近形成通過亞細胞分離而獲得的突觸體。
採用了重量為180-200g的雄性斯普拉-道來氏(詹維爾(Janvier))鼠。將動物殺死後，取出丘腦下部，稱重，並在0.32M的蔗糖中於0℃下在杜恩斯勻漿器上進行均勻化。
勻漿在1000g離心10min(2400rpm-Hettich，Rotenta)。回收上清液並在10000g離心20min(8000rpm-貝克曼，J2-21型M轉軸J14)。在濃度為50mg/mL的蔗糖中回收殘留物(稱為P2部分)。
以下物質在37℃下培養5min√350μl冷藏緩衝液(136mM NaCl、2.4mM KH2PO4和6.9mMK2HPO4，pH 7.2)，使用前預氧化30min，√50μl膜(最終為5mg/ml)，√50μl西酞普蘭(最終為10-5M)，用於非專門吸收，√50μl3H-5-HT(最終為50nM)，(NEN，法國，28.4Ci/mmol)。
剛好在開始培養5min後，用沃特曼(Whatman)GF/F過濾器上的真空過濾停止反應(用2.5ml冷藏緩衝液預稀釋，隨後用2.5ml清洗3次)。
用帶有安全乳化劑(惠普公司)的液體閃爍器測量(惠普公司Tricarb 4640)過濾器上收集的放射性。
通過將抑制百分比變換為曲線圖來測定IC50，與產品濃度的對數相應(一式兩份，6個濃度)。
2.1.3帕羅西汀的結合採用了重量為180-200g的雄性斯普拉-道來氏(詹維爾)鼠。收集幾隻鼠的丘腦下部並在杜恩斯勻漿器上於5ml冷藏緩衝液(50mMTris-HCl，120mM NaCl，5mM KCl，pH 7.5)中進行均勻化並且將勻漿在30000g離心10min(27000rpm-貝克曼.L5-50E，轉軸T40)。在5ml緩衝液中回收穫得的殘留物並在相同的條件下再次離心。在相同的緩衝液中回收新的殘留物並最終在杜恩斯勻漿器上重新均勻化，組織濃度為10mg/ml。在20℃下，將膜懸浮液(100μl)用濃度為0.1nM(最終的)的3H-帕羅西汀(NEN，法國，28.6Ci/mmol)培養2小時，最終體積為1ml。培養2小時後，通過沃特曼GF/F過濾器的真空過濾而停止反應，過濾器事先用0.05％的聚乙基烯亞胺溶液預處理30min(用4ml冷藏緩衝液預稀釋，隨後用4ml清洗試管2次)。採用液體閃爍光譜儀(惠普公司，Tricarb 4640)測量放射能，以安全乳化劑(惠普公司)作為閃爍劑。
將總結合和存在10μM氟西汀時保留的總結合之間的差別定義為專門的3H-帕羅西汀結合。
通過將抑制百分比變換為曲線圖而測定IC50，與產品濃度的對數有關(一式兩份，6個濃度)。
2.1.4使用的產品F2207批號為10-CTN3 key P118F2695批號為PL-I-205F2696批號為PL-I-204C。
2.2結果曲線圖上顯示出F2207及其兩種對映體對5-羥色胺和去甲腎上腺素的吸收以及帕羅西汀結合的影響，縱坐標上為相應的抑制百分比(％)，橫坐標上為F2207、F2695和F2696的濃度(M)(數據未示出)。一式兩份測定的、相應於每種產品濃度的抑制百分比數值為四次單獨試驗的平均結果。
根據這些曲線對三種產品測定了IC50值並顯示在表2中。
表2對3H-5-羥色胺、3H-去甲腎上腺素的吸收抑制以及3H-帕羅西汀結合的抑制
在這三次藥理學分析中，三種化合物為活性的，然而，區別存在於-在去甲腎上腺素的吸收中F2695的活性為F2207的2倍。
F2695的活性為F2696的25倍。
-在5-羥色胺的吸收中F2695的活性為F2207的3倍。
F2695的活性為F2696的12倍。
-在帕羅西汀結合中F2695的活性為F2207的2倍。
F2695的活性為F2696的10倍。
在這些藥理學分析中，三種化合物是有活性的但是(1R，2S)形式(F2696)和外消旋體(F2207)的活性較低。米那普侖的(1S，2R)形式(F2695)的活性為F2207的2-3倍。
實施例3口服外消旋鹽酸米那普侖(F2207)及其活性(1S，2R)對映體(F2695)對清醒中狗的心率和血壓的相對活性影響。
3.1介紹目的是設計研究F2207和F2695 a)通過口服單次給藥後對心率的影響(n＝28隻狗)，以及b)一式兩份，通過口服對狗給藥5天後對心臟收縮和心臟舒張血壓的影響(n＝6隻狗)。
在裝有植入管的雌性動物中(國際數據科學)，在相同的F2207和F2695藥學活性劑量下進行本研究，允許通過遙測法獲取有關心率和血壓參數的數據。對於每次研究，將動物分成3個治療組-第一組(對照組)用去離子水處理，-第二組用F2207以20mg/kg/天的劑量處理，-第三組用F2695以10mg/kg/天的劑量處理。
3.2方法給定少量的同時被裝備動物的數目(最多為8個)，所用設備紀錄道的數目(8道)，為了組成均勻的處理組，在4次研究中進行了總的評價，將每次研究分為三個系列(用三種產品中的每一種處理每隻動物)，通過淘汰期採用再初始化探針分開。每個系列本身採用兩個階段進行-第一階段期間，用去離子水處理所有動物以使它們適應密封裝置和採用胃管口服處理，-第二階段期間，動物接受各自的處理(對於心率，單次給藥，研究號為894/926/935/936；對於血壓，給藥5天，研究號為894)。
下表描述了全部的試驗計劃表3對於遙測法研究的全部試驗計劃，用於研究口服給藥外消旋鹽酸米那普侖(F2207)及其活性(1S，2R)對映體(F2695)對清醒狗的影響。
(在對照組中，n＝27，未紀錄18號動物的探測信號)單次給藥後，在4次研究中分析了各種處理對心率的影響。該分析涉及到以下13個數據的捕獲時間-單次給藥前，-單次給藥後超過6小時的每30min。
穩態時，對於研究號為894的樣品分析了各種處理對血壓、D5、D29和D33的影響(對於每一系列，最終的有效治療天數)。該分析涉及以下的數據捕獲時間-治療前，-治療後超過6小時的每30min。
3.3結果3.3.1關於心率(4次研究共有的)，對於12次每次處理後的試驗，相對於處理前的數值以及對於每個紀錄時間的絕對心率數值，對單獨的頻率變化進行了Tukey測試。
與接受去離子水的控制動物相比，進行了下面的觀察#當對變化值進行統計分析時(

圖1)-從單次給藥F2207(20mg/kg)後的第一個1/2小時心率顯著增加，持續增加到治療後5.5小時(對於總的捕獲時間p≤0.001，除了治療後時間0.5和5.5小時內p≤0.01，以及5.0小時時p≤0.05)，-在給藥F2695後心率增加，但仍保持低於給藥F2207後獲得的增加。而且，在協同給藥F2695後1和4小時時，F2207和F2695之間的影響差異為顯著的(p＜0.05)，
-心率增加，其在F2695(1-4.5小時)下比在F2207(治療後持續到5.5小時)下持續的時期短。
#根據對絕對心率數值進行統計分析，這種相同的研究證明(圖2)-從單次給藥F2207(20mg/kg)後的第一小時心率顯著增加，持續增加到治療後5.5小時(對於1.0-4.5小時的總捕獲時間p≤0.001，除了時間為3.5小時時p≤0.01；以及治療後捕獲時間為5.5小時時p≤0.01)，-給藥F2695後心率增加，但仍然維持在低於給藥F2207後所獲得的增加。而且，在協同給藥F2695後1和4小時時，F2207和F2695之間的影響差異為顯著的(p＜0.05)，-心率增加，其在F2695下(1.0-4.5小時)比在F2207下(治療後持續到5.5小時)持續的時期短。
3.3.2關於血壓(重複給藥的一次研究)，在連續給藥5天後，在最後治療後的6小時，為每隻狗計算了心臟舒張血壓的平均值(圖3和表4)和心臟收縮血壓的平均值(圖4和表5)。經Tukey測試後，用ANOVA分析這些平均血壓值，此時ANOVA可允許進行這種測試(數據未示出)。
下面為觀察到的-重複給藥F2207(20mg/kg/天)或F2695(10mg/kg/天)5天後，與用去離子水處理相比，心臟舒張血壓顯著增加，-重複給藥F2207(20mg/kg/天)5天後，與重複給藥F2695(10mg/kg/天)後相比，平均心臟舒張血壓值有顯著差別，-對心臟收縮血壓無顯著影響；然而，應當指出，重複給藥F26955天後的sBP值接近於用去離子水處理後的sBP值。
在表4和5中分別顯示了單獨的心臟舒張和心臟收縮血壓數據。
表4單獨的心臟舒張壓數心臟舒張壓(以mmHg表示dBP)連續給藥5天後的各個數據 ND未測定表5單獨的心臟收縮壓數據心臟收縮壓(以mmHg表示的dBP)連續給藥5天後的各個數據 ND未測定
3.4結論對裝有遙測設備的清醒狗口服給藥，在4次連續研究中所進行的評估試驗條件下·對於單次給藥並與對照組對比(n＝28)，心率增加非常顯著，並且對於F2207，在劑量為20mg/kg/天時持續；在相等的10mg/kg/天的藥學活性劑量下，對於F2695，它在統計學和臨床學上下降更快。
·在10mg/kg/天的劑量下，在重複給藥5天後的穩態時，在最後治療後超過6小時，F2695對平均心臟收縮血壓不引起任何統計學上的顯著變化，·在相等的藥學活性劑量下(110±4mmHg)，在重複給藥5天後的穩態時，在最後治療後超過6小時，在活性F2695對映體(98±2mmHg)和F2207外消旋物之間，平均心臟舒張血壓出現統計學上的顯著差異。
這些差異清楚地證明了活性F2695對映體對心血管的耐受性更大。
實施例4預測體外毒理學的基因組測試4.1材料和方法在本研究中，對外消旋分子F2207的對映體化合物F2695和F2696以及作為對照品的氯米帕明(在研究中編碼為C218)進行了評定。在初生鼠肝細胞上，首先對對映體F2695和F2696進行初步細胞毒性分析(MTT分析)，以選擇在最終試驗中要採用的三種濃度。
在對培育中的初生鼠肝細胞進行處理後，提取RNA以產生標記的互補DNA探針，該探針隨後在含有682個專用於細胞應力的供選疊接片斷的膜上進行雜交。對於每種產品，通過將已處理細胞的雜交圖形與未處理細胞的雜交圖形進行對比來獲得毒性指數。
4.1.1研究的意圖和目標安全擊打(Safe-Hit)為一種用於預言毒性藥理學的基因組測試，具有靈敏、強烈、可靠、快速並可信等特點，能夠根據對產品毒性潛勢的最佳評定來進行比較和分級。
與控制條件相比較，安全擊打採用的技術具有EXONHIT特性(DATASTMDiffrential Analysis ofTranscripts withAlternativeSplicing)，其允許分離並隨後克隆由特定的生物狀態引起的疊接事件。這允許mRNA異構重整，根據要分離的生物條件區分表達。
安全擊打允許一個化學系列內的分子根據毒性指數進行分級，在以下基本步驟之後進行測定(對每種產品，一式兩份有計劃地進行)-用三種不同濃度的多種產品處理細胞線，由初步細胞毒性分析(MTT分析)進行推導對照濃度相應於80％的細胞發育能力，高10倍的濃度，及當可能時，低10倍的濃度，-製備全部的RNA和相應的放射標記的cDNA探針，-雜交cDNA探針安全擊打微陣列含有682個獨立克隆，相應於由WTp53的過度表達而誘導的基因疊接改變(p53為最普遍存在的細胞應力「介體」，被選取用於發展該方法)，-毒性指數的獲取和測定。
4.1.2細胞在研究中(細胞毒性的初步MTT分析和主測試)使用的細胞為來自初步培養的斯普拉-道來氏鼠的冷藏肝細胞(批號Hep184005和Hep184006-Biopredic)，在標準條件下進行培養。
4.1.2.1培養介質解凍介質具有glutamaxl的萊布維茨(Leibovitz)15介質，向其中加入100IU/ml的青黴素、100μg/ml鏈黴素和0.6M葡萄糖(批號MIL210009-Biopredic)，播種介質具有glutamaxl的Williams E介質，向其中加入100IU/ml的青黴素、100μg/ml鏈黴素和4μg/ml牛胰島素和體積百分比為10％的胎牛血清(批號MIL260005-Biopredic)，發育介質具有glutamaxl的Williams E介質，向其中加入100IU/ml的青黴素、100μg/ml鏈黴素和4μg/ml牛胰島素和50μM的氫化可的松半琥珀酸鹽(批號MIL260005-Biopredic)。
4.1.2.2培養條件37℃，CO2氣氛(5％)，相對溼度(95％)。
4.1.2.3培養步驟
4.1.3細胞毒性測試細胞毒性測試(MTT分析)通過採用比色反應來檢測活細胞，其表明了細胞呼吸作用的完整性意味著線粒體的活性。在活細胞中線粒體酶的影響下，水溶性的MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-取代]-2，5-二苯四唑溴化物)通過分裂而變為非水溶性的紫甲臢(formazan)。甲臢溶解在有機溶劑中並且用分光光度法測量獲得的溶液。測量的吸光度正比於存活細胞的數目。
細胞與5種不同濃度(0-1-10-25-50和100μM)的待測產品接觸16小時。
暴露期之後，加入MTT溶液(在初生肝細胞的發育介質中為0.5mg/ml)3小時。甲臢晶體溶解後，用分光光度計在500nm下讀取多井板，以測定細胞生育能力的百分比。
4.1.4主要的基因組藥理毒理學測試一式兩份，採用將播種的培養器暴露於每一產品中而進行主要研究，以增加試驗之間的一致性並驗證獲得的結果。
4.1.4.1細胞播種和處理播種細胞並用根據初步MTT分析選擇的3個濃度的每種產品培養16小時；兩個對照組(未處理的細胞和單獨的溶劑)加入到該系列中。
4.1.4.2全部RNA的提取和分析處理後，提取RNA並進行如下分析-收集細胞並離心，-根據製造商的操作記錄，採用即用(ready to use)的酚試劑提取(Trizol-批號1106266和1121067-Invitrogen)，-將RNA溶解在水中，-採用分光光度法進行RNA分析(在260、280和300nm測量光密度)，-採用Agilent驗證RNA的質量。
4.1.4.3製備cDNA探針通過放射性逆轉錄來製備cDNA探針(dATP33P-Amersham)。對放射性的cDNA進行定量以確保探針為具有活性的。
4.1.4.4在安全擊打膜上雜交藉助於Q-Pix設備(GENETIX)，將682個DATAS克隆(供選的疊接模式)一式兩份放在由預切割尼龍(Q-BIOgene)製成的安全擊打膜上。在膜上將DNA探針雜交過夜並清洗膜。
4.1.4.5製備cDNA-基質5μg總RNA(對於每個處理系列和每一濃度)，-引物100ng oligo-dTV寡聚核苷酸，用於鼠的第一和第二次雜交(批號12.00，Invitrogen)，-主要混合物10μl第一股5x Premier緩衝液(批號1131226-Invitrogen)，1μl dCTP+dGTP+dTTP 20mM(批號1105201-Invitrogen)，1μl ATP 120μM(批號1105201-Invitrogen)，5μl二硫蘇糖醇(DTT)0.1M(批號133609-Invitrogen)，1μl Out 40U RNase(批號1113345-Invitrogen)，5μl33P dATP 3000Ci/mmol 10m Ci/μl(批號B0239-Amersham)，4μl Superscript II(批號1137806-Invitrogen)，1μl糖原(批號1129328-Invitrogen)。
-步驟將RNA和oligo-dTV在70℃下發育10min並隨後放在冰上。加入27μl MasterMix並在43℃下發育1小時，然後，在50℃下發育15min。加入20μl水、20μl 50mM的EDTA、4μl 10N的NaOH。在65℃下發育20min，然後放在冰上。
定量瞬間成象儀，惠普公司1μl反應混合物，加入8μl醋酸、100μl異丙醇和1μl糖原(20μg/μl)。在-20℃下發育20min。在4℃下，在每分鐘轉數為13000時離心20min。在200μl水中進行重組作為懸浮液。
定量瞬間成象儀，惠普公司1μl反應混合物。
-介質和緩衝液常用緩衝液清洗緩衝液120X SSC(Invitrogen) 2X SSC
50X Denhardt`s50％(w/v)硫酸葡聚糖(ICN)20％SDS(v/v)(Quantum biotech.)10mg/ml鮭魚精子DNA(Q-Biogene)預雜交緩衝液清洗緩衝液26X SSC(Invitrogen)2X SSC10X Denhardt`s0.1％SDS10％硫酸葡聚糖0.5％SDSH2O雜交緩衝液 清洗緩衝液35X SSC(Invitrogen)0.5X SSC5X Denhardt`s 0.1％SDS0.1％SDSH2O清洗緩衝液41X SSC0.1％SDS-預雜交在雜交管中等分5ml預雜交緩衝液，加入相應體積的鮭魚精子DNA，最終濃度為100μg/ml，在5X SSC中浸泡膜，將膜放入雜交管並在65℃下預雜交2小時。
-雜交除去預雜交緩衝液並用10-20ml 5X SSC清洗，除去5X SSC，用5ml緩衝液+鮭魚精子DNA代替，在95℃下將RT探針變性5min，隨後放在冰上1min，離心以便重組，隨後在試管中回收適當體積的變性RT探針(100000-200000cpm/ml)，在55℃下發育過夜。
-清洗
用10-20ml清洗緩衝液1清洗膜，除去該緩衝液並用50ml清洗緩衝液2代替，在35℃下發育30min，然後除去並替換，同時用緩衝液4清洗，在55℃下發育30min，隨後倒掉最後的清洗緩衝液，從試管中除去膜，將它們置於盒子上並允許獲得物持續3小時。
4.1.4.6圖象的獲得與分析將膜放在屏幕上(FX Imaging ScreenK-Bio-rad)3小時。接著，採用個人分子成像儀FX(Bio-rad)讀取膠片。採用安全擊打讀取軟體(COSE)分析膠片。
4.1.4.7毒性指數的計算將所有的數據轉移到自動計算程序中，與未被處理的對照組相對照，其將各種膜歸一化並計算毒性指數，對於特定濃度的特定化合物，其相當於上升和下降調節的基因總和。隨後，將兩次安全擊打分析的結果進行比較並結合起來以評定所測試的各種化合物的潛在毒性。用戶可修改的兩種參數包含在毒性指數的計算中。
·背景閾值(BT)消除(smoothes out)微弱信號，其靠近背景噪音並且對顯著的基因表達無貢獻。因此，這決定著檢測閾值。
·誘導因子(IF)如下確定相對於控制樣品，對於上升和下降調節的克隆，將其作為倍增因數來測定。這種參數值通常為2或小於2，以獲取相關結果。逐漸增加IF值來選擇那些向上或向下調節越來越強的克隆。
通過將參考圖形(R未處理的細胞)和試驗圖形(E)對比而繼續計算毒性指數的步驟，並進行以下步驟(參見圖5，用於示意性地綜述步驟)-將獲得的所有數值轉化為對數值，-為一式兩份分析中的每一個計算平均對數值(MiR和MiE)，-對所有信號(＝Di)用MiR-MiE產生一個矩陣，-通過從MiE中減去14個最接近的Di(＝NMiE)數值的平均值而將各個MiE數值歸一化，-將歸一化數值與對照值(Ci＝NMiE-MIR)對比，-Ci(＝Fi)的指數轉化，
-將Fi與用戶選擇的誘導因子進行比較·如果Fi＞IF，基因被視為向上調節的，·如果1/IF＜Fi＜IF，基因被視為無變化，·如果Fi＜1/IF，基因被視為向下調節的。
4.2MTT分析的結果在暴露16小時的初生鼠肝細胞上一式三份進行這些分析。
氯米帕明，指的是C218，在100μM時顯示出明顯的毒性，這是由於將細胞暴露16小時後未觀察到細胞生育能力。相反，在25μM時未觀察到毒性。在50μM時，細胞發育能力大於80％，與基因組藥理毒理學的研究完全吻合。在本次分析中，F2695和F2696化合物未顯示細胞毒性，即使濃度為100μM。
為了進行基因組的藥理毒理學評定，採用了相同化合物的3個濃度允許獲得80％細胞發育能力(C)的濃度和與(C)×10和(C)/10相應的濃度。
為了對比F2695和F2696的能力以便在所進行的分析中產生評分，在每一測試中使用了相同的濃度1μM、10μM和100μM。對於氯米帕明，採用的濃度為1μM、10μM和50μM的。參見圖6a、6b和6c。
4.3初生鼠肝細胞的結果如上所述，測定了毒性指數(IT)。在兩次獨立試驗中，僅考慮那些相對於對照組發生變化的克隆，僅考慮那些信號比背景閾值(BT)高兩倍的克隆。相對於未處理的對照組，採用兩階微分(誘導因子-IF)進行兩次獨立分析-相對於未處理的對照組，因子至少為1.7。該因子為1.7代表最弱的數值，其可使相對於兩個未處理的對照組，允許有不能獲得的指數。
-相對於未處理的對照組，因子至少為2。該因子為2允許考慮最強的信號。
4.3.1相對於未處理的對照組，誘導因子為1.7(表6)
表6向上和向下調節的克隆，採用了初生鼠的肝細胞(誘導因子＝1.7)
上＞1.7下＜0.588
獲得了以下毒性指數
因此，可建立以下順序，毒性由最大到最小C218(氯米帕明)＞F2696＞＞＞F2695。
在本研究中編碼為C218的對照分子-氯米帕明顯示出相對於測試濃度的信號數目增加在濃度為1、10和50μM(在初步細胞毒性測試中定義的最大濃度)時，信號分別為9、15和28個。正如人們在邏輯上所期望的，在較高濃度下也發現了在較低和中等濃度下出現的所有信號。
在濃度為1和10μM時，F2695不引起在本研究中測試的682個潛在應力信號中的任何一個。在最高濃度100μM時，僅檢測到兩個信號，其一為與C218共有的，但其意義未知。
F2696顯示出相對於測試濃度的信號數目增加在濃度為1、10和100μM時，信號分別為2、5和22個。在較高濃度下也發現了在較低和中等濃度下出現的所有信號。22個信號中沒有一個是與F2695共有的。相反，在較低和中等濃度下出現的信號(5個中含有在低濃度下出現的2個)為5個，其組成了開始用低劑量1μM的氯米帕明所檢測到的9個信號中的一部分。在高濃度100μM時，檢測到F2696的26個信號中的9個是在用50μM氯米帕明所鑑定的28個信號中。
從定性的觀點，應當強調F2696和氯米帕明對線粒體轉錄的影響，尤其是對Cox1和細胞色素b的影響。採用F2695時未出現這些信號(G05/G09/I01位置)。
4.3.2相對於未處理的對照組，誘導因子為2(表7)
表7向上和向下調節的克隆，採用了初生鼠的肝細胞(誘導因子＝2)
上＞1.7下＜0.588
獲得了以下的毒性指數
根據這些參數，可提出以下排列順序，毒性由最大到最小C218(氯米帕明)＞F2696＞＞＞＞＞F2695。
鑑於在因子為2時表達過度和表達不足的克隆，F2695未誘導出任何信號，即使濃度為100μM。根據1μM F2696弱信號消失的事實確定了濃度對信號出現的影響，而其在先前的誘導因子為1.7。
從定性的觀點也確定了F2696和氯米帕明對Cox1和細胞色素b的影響(G05/G09/I01位置)。
F2695為F2207的藥學活性對映體，在本測試中無顯著影響，儘管氯米帕明被用作陽性對照參考品。
相反，F2696為F2207的藥學非活性對映體，顯示了信號圖形，其在數量上和性質上都接近氯米帕明的信號圖形，並且未顯示出與F2695相同的信號。
所有這些證明了活性F2695對映體具有較高的毒性基因組圖形，其在該試驗模型中比F2696具有非常顯著的更好的安全係數。
4.4結論採用初生培養的鼠肝細胞，在F2207的對映體F2695和F2696分子(濃度為10、50和100μM)以及C218(氯米帕明，濃度為1、10和50μM)上進行的基因組藥理毒理學研究得到了濃度相關的應力信號和毒性指數。這些研究證實了基因組的藥理毒理學測試可證明在處理條件(濃度、處理持續時間)下的應力信號的能力，在標準的細胞發育能力分析如MTT分析中，該處理條件不引起任何毒性。
本研究闡明了幾個重要事實·在初生鼠肝細胞模型中，只有F2695即F2207的藥學活性對映體不誘導顯著的毒性指數；·F2696，即F2207的非活性對映體以及氯米帕明，即對照性的精神調理物質，誘導出顯著的指數，包含非常類似或常見的應力信號。在本系統中，氯米帕明作為陽性對照參考分子，誘導出的應力信號的數目最大，從最低濃度開始就觀察到明顯的指數。在本課題中，有興趣指出的是，氯米帕明在人體上可誘導出一定數目的有害事件，如心動過速、直立性低血壓、心臟傳導或心律紊亂以及意想不到的肝炎。在意外地過量服用氯米帕明的情況下，可觀察到昏厥、血液紊亂和嚴重的心血管表現。
未推斷常見的病理生理學機理，有興趣指出的是，F2696顯示出與氯米帕明非常相似或共有的應力信號，並且也誘導出有害事件，如先前提到的心血管紊亂。
因此，可合理地推斷出所觀察到的信號與任何抗抑鬱劑或者廣義上的治精神病藥的圖形無關。相反，所述信號實際上應當被視為「應力信號」(尤其是F2696引起涉及蛋白合成和轉譯初始因子的基因表達減少)。所有這些證明了活性F2695對映體具有較高的毒性基因組圖形，其在該試驗模型中比F2696具有非常明顯的更好的安全係數。
權利要求
1.米那普侖(Z(±)-2-(氨甲基)-N，N，-二乙基-1-苯基環丙烷甲醯氨)的對映體混合物和/或其至少一種代謝物及其藥學上可接受的鹽的用途，所述的混合物富含(1S，2R)對映體，用於製備藥物，該藥物通過雙重抑制5-羥色胺和去甲腎上腺素的再吸收而治療或預防症狀或紊亂，同時限制心血管紊亂的風險。
2.根據權利要求1的用途，其特徵在於心血管紊亂對應於血壓升高和/或心率增加。
3.根據權利要求2的用途，其特徵在於所述血壓升高對應於心臟舒張血壓升高。
4.根據權利要求1-3中任一項的用途，其也限制器官和/或組織毒性的風險。
5.根據權利要求4的用途，其特徵在於所述器官毒性為心臟毒性，所述組織毒性為肝和/或腎毒性。
6.根據權利要求1-5中任一項的用途，其特徵在於米那普侖的(1S，2R)對映體為Z-(1S，2R)-2-(氨甲基)-N，N，-二乙基-1-苯基環丙烷甲醯氨鹽酸鹽(F2695)。
7.根據權利要求1-6中任一項的用途，其特徵在於所述代謝物選自Z-苯基-1-氨甲基-2-環丙烷羧酸鹽酸鹽(F1567)，苯基-3-亞甲基-3-4-吡咯烷酮(F1612)，Z-(對羥基苯基)-1-二乙基氨基羰基-1-氨甲基-2-環丙烷鹽酸鹽(F2782)，Z-苯基-1-乙基氨基羰基-1-氨甲基-2-環丙烷草酸鹽(F2800)，和Z-苯基-1-氨基羰基-1-氨甲基-2-環丙烷鹽酸鹽(F2941)。
8.根據權利要求7的用途，其特徵在於所述代謝物為Z-(對羥基苯基)-1-二乙基氨基羰基-1-氨甲基-2-環丙烷鹽酸鹽(F2782)。
9.根據權利要求1-8中任一項的用途，其特徵在於在所述混合物中，(1S，2R)對映體與(1R，2S)對映體的質量比大於95∶5((1S，2R)∶(1R，2S))，優選大於99∶1((1S，2R)∶(1R，2S))，甚至更優選大於99.5∶0.5((1S，2R)∶(1R，2S))。
10.根據權利要求1-9中任一項的用途，其特徵在於所述對映體混合物基本上為純的Z-(1S，2R)-2-(氨甲基)-N，N，-二乙基-1-苯基環丙烷氨甲醯鹽酸鹽(F2695)。
11.根據權利要求1-9中任一項的用途，其特徵在於所述對映體混合物基本上為純的鹽酸Z-(對羥基苯基)-1-二乙基氨基羰基-1-氨甲基-2-環丙烷(F2782)。
12.根據權利要求1-11中任一項的用途，其特徵在於所述藥物預期用來治療或預防選自以下的紊亂或症狀抑鬱症尤其是深度抑鬱症、抵抗性抑鬱症、老年抑鬱症、精神病性抑鬱症、採用幹擾素治療引起的抑鬱症、抑鬱狀態、燥狂抑鬱症候群、季節性的抑鬱發作、與大眾健康狀況相關的抑鬱發作、與改變心情物質相關的抑鬱發作、兩極細胞疾病、精神分裂症、廣泛性焦慮症、鬱悶和衰弱狀態、與壓力相關的疾病、恐慌發作、恐怖症尤其是廣場恐怖症、強迫觀念與行為紊亂、行為紊亂、對抗性紊亂、創傷後的應力紊亂、免疫系統抑鬱症、疲勞和伴隨性的疼痛症候群、慢性疲勞症候群、纖維肌痛和其它功能性的軀體紊亂、孤獨症、具有由於公眾健康狀況而引起注意力缺陷特徵的紊亂、過度興奮引起的注意力紊亂、飲食紊亂、神經性貪食症、神經性厭食症、肥胖、精神障礙、冷漠、偏頭痛、疼痛並且尤其是慢性疼痛、應激性腸症候群、心血管疾病並且尤其是在心肌梗塞或高血壓中的焦慮抑鬱症症候群、抑制神經疾病和相關的焦慮抑鬱症症候群(阿爾茨海默氏病，慢性進行性舞蹈病，帕金森病)、尿失禁尤其是與壓力和遺尿有關的尿失禁、藥成癮並且特別是對菸草尤其是對尼古丁、對酒精、對麻醉藥、對藥物、對用於脫離這些成癮狀態的止痛劑的焦慮癮。
13.根據權利要求12的用途，其特徵在於所述紊亂選自抑鬱症尤其是深度抑鬱症、抵抗性抑鬱症、老年抑鬱症、精神病性抑鬱症、採用幹擾素治療引起的抑鬱症、抑鬱狀態、燥狂抑鬱症候群、季節性的抑鬱發作、與大眾健康狀況相關的抑鬱發作、與改變心情物質相關的抑鬱。
14.根據權利要求12的用途，其特徵在於所述紊亂選自疲勞和相關的疼痛症候群、慢性疲勞症候群、纖維肌痛和其它機能性的軀體紊亂。
15.根據權利要求12的用途，其特徵在於所述紊亂選自尿失禁，尤其是與壓力和遺尿有關的尿失禁。
16.根據權利要求12的用途，其特徵在於所述症狀選自藥成癮，包括對菸草、尼古丁、酒精、麻醉藥、藥物和/或用於脫離這些成癮狀態的止痛劑的焦慮癮。
17.根據權利要求1-16中任一項的用途，所述病人選自小孩、老年人，患有肝和/或腎機能不全的病人，接受可引起肝或腎器官和/或組織毒性治療的病人，接受心臟病治療的病人，接受可引起心血管副作用治療的病人，具有心血管病病史和/或患有心血管紊亂的病人。
18.根據權利要求17的用途，其特徵在於所述心血管疾病和/或心血管紊亂病史選自心肌梗塞、心律失調(心動過速、心動過緩、心悸)、血壓紊亂(低或高血壓病人)和心臟病。
19.根據權利要求1-18中任一項的用途，其特徵在於所述藥物包括a)富含米那普侖(1S，2R)對映體的對映體混合物和/或其至少一種代謝物及其藥學上可接受的鹽，和b)至少一種活性化合物，選自擬精神藥物，尤其是抗抑鬱劑和抗毒蕈鹼劑，作為相關產品，用於同時、單獨或在時間上交錯治療或預防抑鬱症尤其是深度抑鬱症、抵抗性抑鬱症、老年抑鬱症、精神病性抑鬱症、採用幹擾素治療引起的抑鬱症、抑鬱狀態、燥狂抑鬱症候群、季節性的抑鬱發作、與大眾健康狀況相關的抑鬱發作、與改變心情物質相關的抑鬱發作。
20.根據權利要求1-18中任一項的用途，其特徵在於其中，所述藥物包括a)富含米那普侖(1S，2R)對映體的對映體混合物和/或其至少一種代謝物及其藥學上可接受的鹽，和b)至少一種其它活性物質，選自可誘導器官毒性的活性化合物和可誘導細胞毒性尤其是肝和/或腎的活性化合物，作為相關產品，同時、單獨或在時間上交錯用於通過雙重抑制對5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NA)的再吸收來治療或預防的症狀或紊亂。
21.根據權利要求1-18中任一項的用途，其特徵在於所述藥物包括a)富含米那普侖(1S，2R)對映體的對映體混合物和/或其至少一種代謝物及其藥學上可接受的鹽，和b)至少一種其它活性物質，選自可誘導心血管副作用的活性化合物，作為相關產品，同時、單獨或在時間上交錯用於通過雙重抑制對5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NA)的再吸收來治療或預防的症狀或紊亂。
全文摘要
本發明涉及富含米那普侖的(1S，2R)對映體的對映體混合物和/或其至少一種代謝物及其藥學上可接受的鹽在製備用來預防或治療病變的藥品方面的用途，該病變可通過雙重抑制5－羥色胺(5－HT)和去甲腎上腺素(NA)的再捕獲治療，同時限制心血管紊亂和/或組織和/或器官毒性的風險。
文檔編號A61K31/165GK1750817SQ200480004208
公開日2006年3月22日 申請日期2004年2月16日 優先權日2003年2月14日
發明者J·德雷尼奧古, R·格魯斯 申請人:皮埃爾法布雷醫藥公司