一種U6、miR92a及miR21的三重RT‑qPCR檢測方法及試劑盒與流程

2023-11-05 11:58:32 2

本發明屬於生物檢測領域，涉及u6、mir92a及mir21三種mirna進行單管三重逆轉錄的檢測方法及逆轉錄後進行單管雙重定量的檢測方法及試劑盒。

背景技術：

微rna(mirna)是一類非編碼單鏈小分子rna，長度為20～24個核苷酸，位於基因組的非編碼區，具有高度保守性，時序性和組織特異性。mirna在發育、細胞增殖、凋亡、脂類代謝、激素分泌及腫瘤發生等多種生理和病理過程中發揮重要作用。

mir21是較早發現的人類mirna之一，在多種生物及哺乳動物多種組織中的廣泛存在。大量研究表明，mir21可作為原癌基因在多種腫瘤中高表達並參與細胞的增生、分化、凋亡等過程，在腫瘤的發生發展中具有重要作用。因此，檢測mir21的含量對腫瘤的診斷、治療和預後等具有重要意義。

mir92a可調控人體細胞中參與細胞分化、凋亡、遷移、免疫等過程中的相關基因表達；另一方面多種腫瘤和疾病，如心血管系統疾病中，存在mir92a的表達異常情況。因此mir92a含量可作為一種生物標誌物，為相關疾病的診療提供參考，檢測mir92a含量具有重要基礎和臨床意義。

由於mirna序列短、沒有poly(a)尾巴、在細胞內的表達水平比較低，且許多同源mirna(如let-7家族)序列相似度高，僅差1～2個鹼基，使設計的分析探針雜交效率低。為了提高雜交反應的親合性和檢測靈敏度，丹麥exiqon公司的鎖核酸(lockednucleicacid，lna)技術被應用於mirna的分析研究。目前，基於鎖核酸(lna)等技術的支撐，科學家研究出了多種有效的mirna檢測方法，如northernblotting、微陣列法(mirnaarray)、克隆和測序法、實時螢光定量pcr(rt-qpcr)法等。

rt-qpcr更加簡單方便，不需標記、操作簡單、成本較低、並且靈敏度極高；能在短時間內獲得結果，可檢測多個mirna的表達，需要的rna量較少，因而被廣泛用於組織中mirna表達譜的構建。

目前mirna逆轉錄成cdna的方法主要有三種：引物延伸逆轉錄法；引物加尾法；莖環引物逆轉錄法。延伸及加尾兩種方法操作簡單，一種引物可逆轉錄多種mirna，但後續的定量依賴經過修飾的定量引物，特異性不高；莖環引物克服了mirna序列短的缺點，引入莖環序列，進一步增加了rna-dna鏈互補配對的鹼基數，提高了其熱穩定性，逆轉錄效率增加。但逆轉錄反應後，逆轉錄酶對後續的qpcr有明顯的抑制作用。qpcr採用的信號檢測模式主要有兩種：sybrgreen螢光染料法和taqman探針法，後者特異性更好。

目前，莖環引物逆轉錄法中，每種mirna都需要設計一個特異的反轉錄引物。若需要對樣本中的多個mirna進行定量，逆轉錄需分管進行，步驟繁瑣，從反轉錄到定量pcr，工作量較大。另外，對mirna進行定量時，往往需要一個內參基因，單管單重定量時，反應條件不穩定，加樣有誤差，定量不準確，且耗時耗力，較為繁瑣。此外莖環引物及定量引物在同一體系中，引物二聚體嚴重，易引起過度擴增。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr檢測方法，使u6、mir92a及mir21的三重逆轉錄在同一反應管中進行，使得多個mirna逆轉錄時，步驟更簡潔，轉錄效率和特異性更高；且mir21和u6、mir92a和u6分別進行單管雙重定量，使得mir21和mir92a的定量檢測誤差更小，步驟更簡便，定量結果更準確，可靠。

為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是提供一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr檢測方法及試劑盒，實現對u6、mir92a及mir21的快速準確定量，應用極為方便。

一個方面，本發明提供了用於u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的逆轉錄莖環引物組。

所述的逆轉錄莖環引物組包括以下3條引物序列：引物stem-loopprimer21，其核苷酸序列如seqidno：1所示：5』-ctcaactgctctgctccagtcgcggattcagttgagtcaacat-3』；引物stem-loopprimer92a，其核苷酸序列如seqidno：2所示：5』-gtcgtatccagtcgtcgctccgactcgcgctggatacgacacaggccg-3』；引物stem-loopprimeru6，其核苷酸序列如seqidno：3所示：5』-gtcgtatccagctctgctccagtcgcggattctggatacgacaaaata-3』。

另一個方面，本發明提供了一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的定量檢測引物組和定量檢測探針組。

所述的定量檢測引物組和定量檢測探針組是：定量檢測引物組1和定量檢測探針組1；和/或定量檢測引物組2和定量檢測探針組2。

所述的定量檢測引物組1包括以下4條定量檢測引物：定量pcr上遊引物m2102，其核苷酸序列如seqidno：4所示：5』-ccccggtagcttatcagactg-3』；定量pcr下遊引物m2103，其核苷酸序列如seqidno：5所示：5』-ctcaactgctctgctccagt-3』；定量pcr上遊引物u602，其核苷酸序列如seqidno：6所示：5』-ctcgcttcggcagcaca-3』；定量pcr下遊引物u603，其核苷酸序列如seqidno：7所示：5』-aacgcttcacgaatttgcgt-3』；

所述的定量檢測探針組1包括以下2條定量檢測探針：探針m2104，其序列為seqidno：8(5』-gttgactcaactgaatccgcg-3』)所示的核苷酸序列或其互補的核苷酸序列；探針u604，其序列為seqidno：9(5』-agaagattagcatggcccct-3』)所示的核苷酸序列或其互補的核苷酸序列；

探針m2104和探針u604的核苷酸序列的5』端標記有不同的螢光基團，所述的螢光基團分別選自fam、hex、vic中的一種；探針m2104和探針u604的核苷酸序列的3』端標記有猝滅基團mgb。

所述的定量檢測引物組2包括以下4條定量檢測引物：定量pcr上遊引物序列m9202，其核苷酸序列如seqidno：10所示：5』-ccctgtattgcacttgtcc-3』；定量pcr上遊引物序列m9203，其核苷酸序列如seqidno：11所示：5』-gtcgtatccagtcgtcgc-3』；定量pcr上遊引物u602，其核苷酸序列如seqidno：6所示：5』-ctcgcttcggcagcaca-3』；定量pcr下遊引物u603，其核苷酸序列如seqidno：7所示：5』-aacgcttcacgaatttgcgt-3』；

所述的定量檢測探針組2包括以下2條定量檢測探針：

探針m9204，其序列為seqidno：12(5』-cggcctgtgtcgtatcca-3』)所示的核苷酸序列或其互補的核苷酸序列；探針u604，其序列為seqidno：9(5』-agaagattagcatggcccct-3』)所示的核苷酸序列或其互補的核苷酸序列；

探針m9204和探針u604的核苷酸序列的5』端標記有不同的螢光基團，所述的螢光基團分別選自fam、hex、vic中的一種；探針m2104和探針u604的核苷酸序列的3』端標記有猝滅基團mgb。

另一個方面，本發明提供了一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr檢測試劑盒。

所述的試劑盒包括本發明所述的逆轉錄莖環引物組、定量檢測引物組和定量檢測探針組。

所述的試劑盒還包括酶系、pcr反應試劑和定量標準品。

所述的酶系包括mmlvdna聚合酶、tfldna聚合酶和stoffel片段；

所述的pcr反應試劑包括：

ph8.3～8.5的tris-h2so4，ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸，檸檬酸鈉，(nh4)2so4，mgso4，聚氧乙烯月桂醚，乙醯化牛血清白蛋白和dntp。

所述的定量標準品為：定量標準品1和/或定量標準品2；根據mirna及莖環引物序列，分別合成mir21質粒、mir92a質粒和u6質粒。mir21質粒含有如seqidno：13(5'-ctcaactgctctgctccagtcgcggattcagttgagtcaacatcagtctgataagcta-3』)所示核苷酸序列；mir92a質粒含有如seqidno：14(5'-gtcgtatccagtcgtcgctccgactcgcgctggatacgacacaggccgggacaagtgcaata-3』)所示核苷酸序列；u6質粒含有如seqidno：15(5'-aacgcttcacgaatttgcgtgtcatccttgcgcaggggccatgctaatcttctctgtatcgttccaattttagtatatgtgctgccgaagcgagcac-3')所示核苷酸序列。計算質粒拷貝數，u6、mir92a和mir21質粒分別稀釋至e5、e4、e3、e2拷貝數/μl。將同濃度的u6、mir21質粒混合，即得到同時含u6、mir21質粒且u6、mir21質粒濃度分別為5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl的定量標準品1；將同濃度的u6、mir92a質粒混合，即得到同時含u6、mir92a質粒且u6、mir92a質粒濃度分別為5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl的定量標準品2。

再一個方面，本發明提供了一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的檢測方法，所述的檢測方法指利用本發明所述的u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的逆轉錄引物組、定量檢測引物組和定量檢測探針組，及所述的酶系、pcr反應體系和定量標準品，使用rt-qpcr技術對u6、mir92a及mir21進行定量分析；

所述的檢測方法包括以下步驟：

(1)提取mirna：取待測全血樣本，提取樣本的mirna；

(2)逆轉錄mirna：

a、以步驟(1)提取的mirna作為模板，各逆轉錄莖環引物使用不同濃度，按以下配比配製premix：

b、將上述premix溫和混勻，70℃預熱5分鐘，立即轉入冰上5分鐘，得到premix-1；

c、按以下配比配製rtmix：

其中，rt-pcr反應液包括：ph8.3～8.5的tris-h2so442～65mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸9～32mm、檸檬酸鈉2～4.3mm、(nh4)2so49～23mm、mgso43.5～9mm、質量百分比為0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質量體積比為0.01％～0.1％的乙醯化牛血清白蛋白；

d、將步驟(2)-c配製的rtmix與步驟(2)-b中得到的premix-1混合，普通pcr儀進行逆轉錄，得到逆轉錄的cdna；

其中，逆轉錄時使用的pcr反應程序為：25℃，5分鐘；42℃，60分鐘；70℃，15分鐘；4℃，保存；

(3)雙重定量pcr：

a、分別以步驟(2)-d得到的cdna、以及定量標準品為模板，按以下配比配製mir21和u6單管雙重定量及mir92a和u6單管雙重定量反應體系：

其中，定量pcr反應液包括：ph8.3～8.5的tris-h2so442～65mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸10～30mm、檸檬酸鈉2～4.3mm、(nh4)2so49～23mm、mgso43.5～9mm、質量百分比為0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質量體積比為0.01％～0.1％的乙醯化牛血清白蛋白、dntp0.2～0.5mm、定量檢測引物組600～1000nm和定量檢測探針組150～300nm；

酶混合液包括：等體積的tfldna聚合酶和stoffel片段。

b、單管雙重定量反應體系配製好後，利用定量pcr儀進行擴增，所用的定量程序為：第一步：37℃，5分鐘；94℃～96℃8～12分鐘；第二步：94℃～95℃15～30秒，62℃～68℃15～50秒，68℃～72℃20～40秒，4～8個循環；第三步：93℃～95℃15～20秒，62℃，15～30，68℃～72℃，20秒，10個循環；第四步：93℃～95℃，15秒，52℃～62℃，15秒，68℃～72℃，30～60秒，40個循環；

c、定量分析：

mir21和u6單管雙重定量分析：在定量pcr儀的不同螢光通道分別讀取mir21和u6的擴增曲線；根據5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl定量標準品1的擴增結果，分別繪製mir21和u6的標準曲線；利用該標準曲線，計算步驟(2)-d得到的cdna中mir21和u6的定量值；以mir21的定量值除以u6的定量值，即得本待測全血樣本中mir21的相對含量。

mir92a和u6的單管雙重定量分析：在定量pcr儀的不同螢光通道分別讀取mir92a和u6的擴增曲線；根據5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl定量標準品2的擴增結果，分別繪製mir92a和u6的標準曲線；利用該標準曲線，計算步驟(2)-d得到的cdna中mir92a和u6的定量值；以mir92a的定量值除以u6的定量值，即得本待測全血樣本中mir92a的相對含量。

在一個優選的實施方案中，所述的rt-pcr反應液包括：ph8.3的tris-h2so442mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸9mm、檸檬酸鈉2mm、(nh4)2so49mm、mgso43.5mm、質量百分比為0.10％的聚氧乙烯月桂醚、質量體積比為0.01％的乙醯化牛血清白蛋白；

在另一個優選的實施方案中，所述的rt-pcr反應液包括：ph8.5的tris-h2so465mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸32mm、檸檬酸鈉4.3mm、(nh4)2so423mm、mgso49mm、質量百分比為0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質量體積比為0.1％的乙醯化牛血清白蛋白；

在另一個優選的實施方案中，所述的rt-pcr反應液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸18mm、檸檬酸鈉3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、質量百分比為0.10％的聚氧乙烯月桂醚、質量體積比為0.1％的乙醯化牛血清白蛋白；

在一個優選的實施方案中，所述的定量pcr反應液包括：ph8.3的tris-h2so442mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸9mm、檸檬酸鈉2mm、(nh4)2so49mm、mgso43.5mm、質量百分比為0.10％的聚氧乙烯月桂醚、質量體積比為0.01％的乙醯化牛血清白蛋白、dntp0.2mm、定量檢測引物組600nm和定量檢測探針組150nm；

在另一個優選的實施方案中，所述的定量pcr反應液包括：ph8.5的tris-h2so465mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸32mm、檸檬酸鈉4.3mm、(nh4)2so423mm、mgso49mm、質量百分比為0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質量體積比為0.1％的乙醯化牛血清白蛋白、dntp0.5mm、定量檢測引物組1000nm和定量檢測探針組300nm；

在另一個優選的實施方案中，所述的定量pcr反應液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸18mm、檸檬酸鈉3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、質量百分比為0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質量體積比為0.01％～0.1％的乙醯化牛血清白蛋白、dntp0.2mm、定量檢測引物組800nm和探定量檢測針組200nm；

在一個優選的實施方案中，所述的定量程序為：第一步：37℃，5分鐘；94℃8分鐘；第二步：94℃15秒，62℃15秒，68℃20秒，4個循環；第三步：93℃15秒，62℃15秒，68℃20秒，10個循環；第四步：93℃15秒，52℃15秒，68℃30秒，40個循環；

在另一個優選的實施方案中，所述的定量程序為：第一步：37℃，5分鐘；96℃12分鐘；第二步：95℃30秒，68℃50秒，72℃40秒，8個循環；第三步：95℃20秒，62℃30秒，72℃20秒，10個循環；第四步：95℃15秒，62℃15秒，72℃，60秒，40個循環；

在另一個優選的實施方案中，所述的定量程序為：第一步：37℃，5分鐘；95℃，10分鐘；第二步：95℃，15秒，65℃，15秒，72℃，20秒，5個循環；第三步：95℃，15秒，62℃，15秒，72℃，20秒，10個循環；第四步：95℃，15秒，52℃，15秒，72℃，40秒，40個循環。

與現有技術相比，本發明的有效效果為：

1、本發明提供了mir21、mir92a、u6的逆轉錄莖環引物。這三個逆轉錄莖環引物可在同一反應管中逆轉錄擴增mir21、92a和u6，實現了單管三重逆轉錄，使得mir21、92a和u6的逆轉錄步驟大大簡化，克服了現有技術中莖環引物逆轉錄時，一種莖環引物只能逆轉錄一種cdna，擴增多基因時，需分別擴增，分管操作步驟繁瑣的缺點。

2、本發明提供的mir21、mir92a、u6的逆轉錄莖環引物，增加了rna-dna鏈互補配對的鹼基，提高了其熱穩定性，逆轉錄效率增加。

3、本發明優化了逆轉錄酶的使用方法，降低了對後續定量pcr的抑制。

4、本發明提供了高靈敏和高特異性的定量檢測引物序列和定量檢測探針、與之相匹配的pcr反應程序和條件，並提供了mir21和u6、mir92a和u6進行單管雙重定量的檢測方法，避免了現有技術中qpcr單管單重定量時的操作誤差，使得定量結果更準確，定量結果更可靠。同時，單管雙重定量使得定量步驟更加簡潔，縮短檢測時間的同時還節省了檢測試劑和檢測費用。

5、本發明提供的mir21和u6、mir92a和u6單管雙重定量的檢測方法，可檢測到5e拷貝數/μl定量標準品中的mir21和mir92a，檢測靈敏度和特異性高。

6、本發明引入了stoffel片段和tfldna聚合酶的雙聚合酶的擴增方法。其中stoffel片段為去除5』-3』外切酶活性結構域的taqdna聚合酶，去除5』-3』外切酶活性的同時，恢復了少量3』-5』外切酶的校正活性，彌補了tfldna聚合酶特異性不足的缺陷。而tfldna聚合酶則提供切除taqman探針的5』-3』外切酶活性。另一方面，stoffel片段和tfldna聚合酶耐抑制劑能力都較強，使得根據本發明的rt-qpcr反應體系中可以加入更多的模版，靈敏度提升。

7、本發明引入的tris-3-(n-嗎啉基)丙磺酸-檸檬酸鈉緩衝液替代常規的tris-hcl緩衝液，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強，避免了普通rt-qpcr方法特異性不高的缺點。

附圖說明

圖1從左到右依次為5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl定量標準品1的擴增結果曲線，fam通道為mir21通道，hex通道為u6通道。

圖2mir21和u6單管雙重定量繪製的mir21和u6標準曲線及待測樣本定量值，fam通道為mir21通道，hex通道為u6通道。

圖3從左到右依次為5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl定量標準品2的擴增結果曲線，fam通道為mir92a通道，hex通道為u6通道。

圖4mir92a和u6單管雙重定量繪製的mir92a和u6標準曲線及待測樣本定量值，fam通道為mir92a通道，hex通道為u6通道。

圖5從左到右依次為對比例1的5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl定量標準品1的mir21的擴增結果曲線。

圖6從左到右依次為對比例1的5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl定量標準品2的mir92a的擴增結果曲線。

具體實施方式

以下實施例的說明只是用於幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護範圍內。對所公開的實施例的下述說明，使本領域專業技術人員能夠實現或使用本發明。對這些實施例的多種修改對本領域的專業技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發明的精神或範圍的情況下，在其它實施例中實現。因此，本發明將不會被限制於本文所示的這些實施例中，而是可以應用於符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的更寬的範圍。

除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同意義。

以下實施例中未作具體說明的分子生物學試驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行；所述試劑盒生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。

實施例1一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的檢測試劑盒

該試劑盒包括：u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的逆轉錄莖環引物組。

逆轉錄莖環引物組包括：

引物stem-loopprimer21：5』-ctcaactgctctgctccagtcgcggattcagttgagtcaacat-3』；

引物stem-loopprimer92a：5』-gtcgtatccagtcgtcgctccgactcgcgctggatacgacacaggccg-3』；

引物stem-loopprimeru6：5』-gtcgtatccagctctgctccagtcgcggattctggatacgacaaaata-3』。

實施例2一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的檢測試劑盒

該試劑盒包括：(1)實施例1所述的u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的逆轉錄莖環引物組；(2)u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的定量檢測引物組和定量檢測探針組。

定量檢測引物組包括：

定量檢測引物組1和定量檢測探針組1；

和定量檢測引物組2和定量檢測探針組2。

定量檢測引物組1包括：

定量pcr上遊引物m2102：5』-ccccggtagcttatcagactg-3』；定量pcr下遊引物m2103：5』-ctcaactgctctgctccagt-3』；定量pcr上遊引物u602：5』-ctcgcttcggcagcaca-3』；定量pcr下遊引物u603：5』-aacgcttcacgaatttgcgt-3』；

定量檢測探針組1包括：

探針m2104：5』-gttgactcaactgaatccgcg-3』和探針u604：5』-agaagattagcatggcccct-3』；

探針m2104的核苷酸序列的5』端標記有fam螢光基團，探針u604的核苷酸序列的5』端標記有hex螢光基團，所述的螢光基團為；探針m2104和探針u604的核苷酸序列的3』端標記有猝滅基團mgb。

定量檢測引物組2包括：

定量pcr上遊引物序列m9202：5』-ccctgtattgcacttgtcc-3』；定量pcr下遊引物序列m9203：5』-gtcgtatccagtcgtcgc-3』；定量pcr上遊引物u602：5』-ctcgcttcggcagcaca-3』；定量pcr下遊引物u603：5』-aacgcttcacgaatttgcgt-3』；

定量檢測探針組2包括：

探針m9204：5』-cggcctgtgtcgtatcca-3』和探針u604：5』-agaagattagcatggcccct-3』；

探針m9204核苷酸序列的5』端標記有fam螢光基團，探針u604的核苷酸序列的5』端標記有hex螢光基團；探針m2104和探針u604的核苷酸序列的3』端標記有猝滅基團mgb。

實施例3一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的檢測試劑盒

該試劑盒包括：

(1)實施例1中的逆轉錄莖環引物組；

(2)實施例2中的定量檢測引物組和定量檢測探針組；

(2)酶系：mmlvdna聚合酶、tfldna聚合酶和stoffel片段；

(3)pcr反應試劑：ph8.5的tris-h2so4，ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸，檸檬酸鈉，(nh4)2so4，mgso4，聚氧乙烯月桂醚，乙醯化牛血清白蛋白和dntp。

(4)定量標準品：定量標準品1和定量標準品2。

根據mirna及莖環引物序列，在上海捷瑞生物工程有限公司合成mir21質粒、mir92a質粒和u6質粒。mir21質粒含有如seqidno：14(5'-ctcaactgctctgctccagtcgcggattcagttgagtcaacatcagtctgataagcta-3』)所示核苷酸序列；mir92a質粒含有如seqidno：15(5'-gtcgtatccagtcgtcgctccgactcgcgctggatacgacacaggccgggacaagtgcaata-3』)所示核苷酸序列；u6質粒含有如seqidno：16(5'---aacgcttcacgaatttgcgtgtcatccttgcgcaggggccatgctaatcttctctgtatcgttccaattttagtatatgtgctgccgaagcgagcac---3')所示核苷酸序列。dna/rnacopynumbercalculator計算質粒拷貝數，u6、mir92a和mir21質粒分別稀釋至e5、e4、e3、e2拷貝數/μl。將同濃度的u6、mir21質粒混合，即得到同時含u6、mir21質粒且u6、mir21質粒濃度分別為5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl的定量標準品1；將同濃度的u6、mir92a質粒混合，即得到同時含u6、mir92a質粒且u6、mir92a質粒濃度分別為5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl的定量標準品2。

實施例4

一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr檢測方法

所述的檢測方法包括以下步驟：

1、提取mirna：待測人全血樣本，編號分別為s1-s24，各取200μl，提取mirna(採用exiqonmirna提取試劑盒，貨號：300112)；

2、逆轉錄mirna：

a、以步驟(1)提取的mirna作為模板，各逆轉錄莖環引物使用不同濃度，按以下配比配製premix：

b、將上述premix溫和混勻，70℃預熱5分鐘，立即轉入冰上5分鐘，得到premix-1；

c、按以下配比配製rtmix：

試劑工作濃度或添加量

rt-pcr反應液8.5μl

200u/μlmmlvdna聚合酶(深圳菲鵬生物)0.5μl；

其中，rt-pcr反應液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸18mm、檸檬酸鈉3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、質量百分比為0.10％的聚氧乙烯月桂醚、質量體積比為0.1％的乙醯化牛血清白蛋白；

d、將步驟(2)-c配製的rtmix與步驟(2)-b中得到的premix-1混合，普通pcr儀進行逆轉錄，得到逆轉錄的cdna；

其中，逆轉錄時使用的pcr反應程序為：25℃，5分鐘；42℃，60分鐘；70℃，15分鐘；4℃，保存；

(3)雙重定量pcr：

a、分別以步驟(2)-d得到的cdna、以及定量標準品1為模板，按以下配比配製mir21和u6單管雙重定量反應體系：

其中，定量pcr反應液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸18mm、檸檬酸鈉3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、質量百分比為0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質量體積比為0.01％～0.1％的乙醯化牛血清白蛋白、dntp0.2mm、定量pcr上遊引物m2102200nm、定量pcr下遊引物m2103200nm、定量pcr上遊引物u602200nm、定量pcr下遊引物u603200nm、探針m2104100nm和探針u604100nm；

酶混合液包括：1μl的tfldna聚合酶(美國abi公司，2u/μl)和1μl的stoffel片段(cetus公司，5u/μl)。

分別以步驟(2)-d得到的cdna、以及定量標準品2為模板，按以下配比配製mir92a和u6單管雙重定量反應體系：

其中，定量pcr反應液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸18mm、檸檬酸鈉3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、質量百分比為0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質量體積比為0.01％～0.1％的乙醯化牛血清白蛋白、dntp0.2mm、定量pcr上遊引物m9202200nm、定量pcr下遊引物m9203200nm、定量pcr上遊引物u602200nm、定量pcr下遊引物u603200nm、探針m9204100nm和探針u604100nm；

酶混合液包括：1μl的tfldna聚合酶(美國abi公司，2u/μl)和1μl的stoffel片段(cetus公司，5u/μl)。

b、單管雙重定量反應體系配製好後，利用定量pcr儀進行擴增，所用的定量程序為：第一步：37℃，5分鐘；95℃，10分鐘；第二步：95℃，15秒，65℃，15秒，72℃，20秒，5個循環；第三步：95℃，15秒，62℃，15秒，72℃，20秒，10個循環；第四步：95℃，15秒，52℃，15秒，72℃，40秒，40個循環；

c、定量分析：

mir21和u6單管雙重定量分析：在定量pcr儀的fam螢光通道讀取mir21的擴增曲線，在hex螢光通道讀取u6的擴增曲線；根據5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl定量標準品1的擴增結果(圖1，從左到右依次為5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl定量標準品1的擴增結果曲線)，分別繪製mir21和u6的標準曲線(結果見圖2)；利用標準曲線，計算步驟(2)-d得到的cdna中mir21和u6的定量值(結果見圖2及表1)；以mir21的定量值除以u6的定量值，即得本待測全血樣本中mir21的相對含量，s1-s24樣本的mir21相對含量結果見表1。

表1

mir92a和u6單管雙重定量分析：在定量pcr儀的fam螢光通道讀取mir92a的擴增曲線，在hex螢光通道讀取u6的擴增曲線；根據5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl定量標準品的擴增結果(圖3，從左到右依次為5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl定量標準品2的擴增結果曲線)，分別繪製mir92a和u6的標準曲線，結果見圖4；利用標準曲線，計算步驟(2)-d得到的cdna中mir92a和u6的定量值(結果見圖4及表2)；以mir92a的定量值除以u6的定量值，即得本待測全血樣本中mir92a的相對含量，s1-s24樣本的mir92a相對含量結果見表2。

表2

對比例1一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的檢測方法

以5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl定量標準品1和定量標準品2為模板，以taqdna聚合酶(5u/μl，neb公司)為酶混合液，分別進行mir21和u6單管雙重定量和mir92a和u6單管雙重定量pcr，方法同實施例4。mir21擴增結果見圖5，mir92a擴增結果見圖6。由圖1和圖5、圖3和圖6對比分析可知，當模板量為5μl時，使用taqdna聚合酶雖然可以擴增，但是兩個通道會相互抑制，擴增效率明顯降低；而使用stoffel片段、tfldna聚合酶，可以正常擴增，說明本發明所述的酶混合液對模板的耐受能力更強，擴增效率更高。

對比例2一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的檢測方法

以5e4、5e3、5e2、5e拷貝數/μl定量標準品1和定量標準品2為模板，分別進行mir21和u6單管雙重定量和mir92a和u6單管雙重定量pcr，方法基本同實施例4，僅將定量pcr反應液中的ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸18mm和檸檬酸鈉3mm換成ph8.5的tris-hcl66mm。擴增結果顯示，採用本發明所述的tris-h2so4、3-(n-嗎啉基)丙磺酸、檸檬酸鈉組成的緩衝液，擴增效果更好，擴增結果穩定性更好。

sequencelisting

廣州海力特生物科技有限公司

一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr檢測方法及試劑盒

20170413

15

patentinversion3.5

1

43

dna

人工序列

1

ctcaactgctctgctccagtcgcggattcagttgagtcaacat43

2

48

dna

人工序列

2

gtcgtatccagtcgtcgctccgactcgcgctggatacgacacaggccg48

3

48

dna

人工序列

3

gtcgtatccagctctgctccagtcgcggattctggatacgacaaaata48

4

21

dna

人工序列

4

ccccggtagcttatcagactg21

5

20

dna

人工序列

5

ctcaactgctctgctccagt20

6

17

dna

人工序列

6

ctcgcttcggcagcaca17

7

20

dna

人工序列

7

aacgcttcacgaatttgcgt20

8

21

dna

人工序列

8

gttgactcaactgaatccgcg21

9

20

dna

人工序列

9

agaagattagcatggcccct20

10

19

dna

人工序列

10

ccctgtattgcacttgtcc19

11

18

dna

人工序列

11

gtcgtatccagtcgtcgc18

12

18

dna

人工序列

12

cggcctgtgtcgtatcca18

13

58

dna

人工序列

13

ctcaactgctctgctccagtcgcggattcagttgagtcaacatcagtctgataagcta58

14

62

dna

人工序列

14

gtcgtatccagtcgtcgctccgactcgcgctggatacgacacaggccgggacaagtgcaa60

ta62

15

97

dna

人工序列

15

aacgcttcacgaatttgcgtgtcatccttgcgcaggggccatgctaatcttctctgtatc60

gttccaattttagtatatgtgctgccgaagcgagcac97