一種增加細胞激動素產率的方法
2023-12-06 08:22:36 2
專利名稱：一種增加細胞激動素產率的方法
技術領域：
本發明涉及以提高了的產率製備細胞激動素的方法，其中誘導和生產是在不同的溫度和PH值條件下完成的。
細胞激動素在活生物組織和細胞功能之間的相互聯繫及調節方面起著重要的作用。「細胞激動素」(「Cytokin」)包括由活細胞產生並分泌到其周圍環境中的所有具生活學活性的分子或分子集團。例如，其中包括白細胞介素、幹擾素(IFNs)、脂皮質素(lipocartin)、腫瘤壞死因子等。
在適當誘導因子參與下，活細胞還能在試管內產生細胞激動素。上述誘導因子可以是病毒、植物血凝素、促細胞分裂劑、佛波醇酯、離子載體，合成的核糖核酸等。可見，可通過適當方法工業化生產天然的生物活性物質。
也可以通過所謂天然方法，即使用基因操作來製備細胞激動素，其中將人和動物細胞置於營養溶液中使之在誘導劑的作用下產生細胞激動素，然後再從培養基中回收細胞激動素。有關製備方法已在文獻中有所記載如使用糖皮質激素誘導劑製備脂皮質素〔參見B.Rothhut等，FEBSLett.219，169(1987)〕;使用PMA誘導劑製備B細胞刺激因子(IL-4)〔參見J.HuLi等，J.EXP.Med.，165，157(1987)〕;使用伴刀豆球蛋白A誘導劑製備白細胞介素2〔參見K.Kato等，Biochem.Biophys.Res.Commun.127，182(1985)〕;以及使用仙臺病毒誘導劑製備α幹擾素〔參見K.Cantell等，MethodsEnzymol.72，29(1981)〕等方法。
上述方法的共同特點是，細胞激動素的誘導和產生過程是在同一條件下進行的。
發明是基於這樣一個認識即在最合適的誘導條件下，也會較早地出現生產抑制因素，而這一因素可藉助適當調整環境條件得以避免。
使用本發明的方法，能夠在體外條件下顯著地增加各種細胞產生之細胞激動素的產率。
通常可通過用一種或幾種誘導劑處理相應的細胞，然後再保溫一定時間來製備細胞激動素。可用已知方法來回收分泌到營養液中的細胞激動劑。
本發明的目的是通過減小細胞激動素合成抑制因子的作用，從而提高細胞激動素的產量。
根據本發明的方法，可按適當的時間間隔改變保溫條件，以阻止抑制因子的影響，從而大大提高細胞激動素的產量。
我們發現，在細胞激動素合成的指數期之後，延緩細胞激動素合成的生化過程會更為加強。從指數期開始，細胞激動素產生對保溫條件改變的敏感性較小，而且比上述減慢合成過程所受到抑制作用亦較小。因此，可以通過適當改變保溫條件及選擇合適的時間來延長生產間期。
下列實施例將更為詳細地闡明本發明。
在沒有提及調節pH值的地方，pH值為生理值，即7.2～7.4。
實施例1通過改變保溫的pH值增加人白細胞α幹擾素的產率。
用0.83%氯化銨溶液經幾次溶血去除汙染的紅細胞，得到純化的血沉棕黃層(Buffy coat，從新鮮人血中分離的富含白細胞組份)，然後將所得的白細胞以1×107個細胞/ml的濃度懸浮於含有無機鹽、葡萄糖及1mg/ml無γ球蛋白人血清的適當營養液中。向上述懸浮液內加入200IU/ml人白細胞α幹擾素，將混合溶液於37℃下保溫2小時。然後再向細胞懸浮液內加入100HA單位/ml的仙臺病毒，並將混合溶液於37℃下保溫2小時。
2小時後，向含有細胞懸浮液的小瓶內加入一定量的Tris-HCl緩衝液，將其PH值調到7，然後保溫20小時。經離心從營養溶液內分離出白細胞。如此製得的幹擾素粗品的抗病拘Ъ畚 00，000IU/ml，即是說比沒加緩衝液調PH值所製得的幹擾素抗病毒效價高兩倍。
實施例2改變保溫溫度和PH值以增加人白細胞γ幹擾素和白細胞介素2的產率。
可在同一細胞培養物中同時製備γ幹擾素和白細胞介素2。
由新鮮血沉棕黃層製得的白細胞或在先前製備幹擾素時用過的白細胞，均可用於該生產過程。可按實施例1中所述的方法製備的細胞懸液。
將白細胞以1×107～2×107細胞/ml的濃液懸浮於含有1mg/ml無γ球蛋白人血清的已知營養溶液中。可於37℃下加入10～20μg/ml伴刀豆球蛋白A、或1～10μg/ml植物血凝素、或20～10μg/ml mesereine，或0.5～2μg A 23187離子載體、或5～30ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯進行誘導。加入誘導劑3小時後，將含有白細胞的小瓶置於30℃恆溫箱中，將PH調到7後保溫該混合溶液。保溫後，離心以從含γ幹擾素和白細胞介素2(IL-2)的營養液中分離出細胞。
γ幹擾素的抗病毒效價為15，000IU/ml，白細胞介素2的抗病毒效價為1，300IU/ml。這些效價比在恆定溫度37℃下未用緩衝液調PH製得的產物的效價高2～2.5倍。
實施例3改變保溫溫度以增加脂皮質素的產率用0.83%氯化銨溶液經幾次溶血去除汙染的紅細胞，由新鮮人血中製得純化的血沉棕黃層。然後將所得的純白細胞以1×107個細胞/ml的濃度懸浮於不含血清的營養溶液中，用1μM地塞米松處理並於37℃下保溫2小時。再將保溫溫度調到30～32℃繼續保溫15至20小時。接著以離心法從營養液中除去白細胞。所得上清液即為脂皮質素的粗製品，其對角叉菜膠誘發的炎症有很強的抗炎作用。在非恆定溫度下製得的脂皮質素粗品比在恆定溫度下製得的脂皮質素的抗炎作用高2～2.5倍。抗炎作用的大小是按Winter等人(Pract.Soc.Exp.Biol.Med.，111，644(1962))所述的方法通過小鼠體內的角叉菜膠試驗測定的。
權利要求
1.一種以較高產率製備細胞激動素的方法，其包括在不同的溫度和/或PH值條件下完成誘導和生產過程。
2.根據權利要求1的方法，其包括在誘導期間比在生產期間使用了較低的pH和/或保溫溫度。
3.根據權利要求1或2的方法，其包括在生產過程中將保溫的pH值調到7和/或將保溫溫度調到15～40℃，較好20～35℃，最好25～32℃。
4.根據權利要求1至3中任一項的方法，其包括在細胞激動素合成開始後改變保溫的pH值和/或溫度。
5.根據權利要求1至4中任一項的方法，其包括在細胞激動素合成的指數期內改變保溫的pH值和/或溫度。
全文摘要
本發明涉及一種以增加的量製備細胞激動素的方法，其中於不同的溫度和/或pH值條件下完成誘導和生產過程。
文檔編號C07K14/52GK1036794SQ8910202
公開日1989年11月1日 申請日期1989年3月3日 優先權日1988年3月4日
發明者樊恩·彼特夫, 萊斯奧·巴爾, 佐爾特·帕爾 申請人:Egis哥斯查亞