一種重組農桿菌質粒快速鑑定方法
2023-11-11 14:05:27
專利名稱：一種重組農桿菌質粒快速鑑定方法
技術領域：
本發明涉及一種農桿菌的鑑定方法，具體的說是一種重組農桿菌質粒快速鑑定方法，可以直接應用於科學研究領域。
背景技術：
在分子克隆和以農桿菌為介導進行植物遺傳轉化研究中重組農桿菌的質粒提取和純度鑑定是一項常規的實驗操作，質粒是否轉化成功對後續實驗有著重要影響。目前，公知的常規的農桿菌質粒DNA提取方法主要包括鹼裂解法，Mini質粒提取，煮沸法等。基於農桿菌細胞的特殊性，一般在提取時需要加入一定量的裂解酶，並在提取後需要用酚、氯仿等進行純化處理這些方法操作過程較複雜繁瑣，且所使用的藥品多對操作人員有直接或間接的危害。
發明內容
本發明的目的是要提供一種操作過程簡單方便、使用的藥品少、降低對操作人員的傷害，操作時間短的重組農桿菌質粒快速鑑定方法。本發明的目的是這樣實現的，該重組農桿菌質粒快速鑑定方法包括以下步驟
(1)、將質粒PCAMBIA1302轉化進入髮根農桿菌A4菌株或15834菌株或根癌農桿菌GV3101菌株後；通過塗布培養的方法，在超淨工作檯中，將轉化後的菌液塗布在攜帶kan抗性的固體LB培養基的培養皿上，將培養皿用封口膜封好，保證無菌條件，將培養皿放在26. 5 0C，黑暗條件下培養1-2天；
(2)、定時觀察塗布培養後培養皿中的菌落生長情況，待轉化後菌落生長到2-3mm時，挑取獨立生長的菌落進行搖瓶培養；
(3)、取50ml的三角燒瓶，加入IOml的LB液體培養基和IOul的kan抗生素，用牙籤挑取I個獨立生長的菌落加入到三角瓶中，在恆溫振蕩搖床中，26. 5°C，160r/min，搖瓶培養過夜；
(4)、取出搖瓶，取用Iml菌液，用分光光度計在波長為600nm時測定菌液的OD值，當菌液的0D600為I. 0-1. 2時，進行重組質粒的提取和鑑定；
(5)、在超淨工作檯中，用移液器取I.5ml菌液加入I. 5ml Eppendoff管中；
(6)、在高速冷凍離心機中，4°C,12000r/min,離心2min ；
(7)、離心之後,將I.5ml Eppendoff管取出，倒去上清液，將I. 5ml Eppendoff管倒扣在無菌濾紙上吸乾I. 5ml Eppendoff管中的殘留液體；
(8)、向1.5ml Eppendoff 管加入 IOul 懸浮液(葡萄糖 50mmol/L ;Tris-Hcl (PH8. 0)25mmol/L; RNaSeA 0. 2mg/ml)用移液器反覆抽吸混勻，並用渦輪混合儀充分混勻；
(9)、向步驟(8)的I.5ml Eppendoff管中加入5ul溶菌酶(5mg/ml),用移液器反覆抽吸混勻；(10)、將步驟(9)的I.5ml Eppendoff管在室溫條件下,放置3min ；
(11)、將步驟(10)的1.5mlEppendoff管放入沸水中2min後取出；
(12)、將步驟(11)的I.5ml Eppendoff管在高速冷凍離心機中，4°C, 12000r/min,離心2min ；
(13)、將離心之後的上清液取出，存於0.2ml的Eppendoff管中；
(14)、利用瓊脂糖凝膠電泳法對重組的髮根農桿菌A4菌株或15834菌株或根癌農桿菌GV3101菌株中的質粒和未經過轉化的原種髮根農桿菌A4菌株或15834菌株或根癌農桿菌GV3101菌株中的質粒進行區分；
(15)、將步驟(14)中鑑定成功的重組髮根農桿菌A4菌株或15834菌株或根癌農桿菌GV3101菌株中的質粒進行PCR檢測，準確地鑑別陽性克隆。所述的材料包括
(1)、菌種髮根農桿菌A4菌株、15834菌株(吉林師範大學遺傳生理研究所實驗室保存)、根癌農桿菌GV3101菌株(吉林師範大學遺傳生理研究所實驗室保存)；
(2)、質粒pCAMBIA1302(kan抗性)(購自澳大利亞pCAMBIA公司)。本發明克服了現有技術的不足，結合溶菌酶和煮沸法提取的優點，簡化操作流程和嚴格反應環境條件，使農桿菌質粒DNA的提取量及純度得到了大幅度提高，縮短操作時間，並且由於操作過程中避免使用酚、氯仿等對人體有害的試劑，使實驗本身對操作者的危害得以降低。
具體實施例方式本發明方法所採用的材料包括
(1)、菌種髮根農桿菌A4菌株、15834菌株(吉林師範大學遺傳生理研究所實驗室保存)、根癌農桿菌GV3101菌株(吉林師範大學遺傳生理研究所實驗室保存)；
(2)、質粒pCAMBIA1302(kan抗性)(購自澳大利亞pCAMBIA公司)。該重組農桿菌質粒快速鑑定方法包括以下步驟
(1)、將質粒PCAMBIA1302轉化進入髮根農桿菌A4菌株或15834菌株或根癌農桿菌GV3101菌株後；通過塗布培養的方法，在超淨工作檯中，將轉化後的菌液塗布在攜帶kan抗性的固體LB培養基的培養皿上，將培養皿用封口膜封好，保證無菌條件，將培養皿放在26. 5 0C，黑暗條件下培養1-2天；
(2)、定時觀察塗布培養後培養皿中的菌落生長情況，待轉化後菌落生長到2-3mm時，挑取獨立生長的菌落進行搖瓶培養；
(3)、取50ml的三角燒瓶，加入IOml的LB液體培養基和IOul的kan抗生素，用牙籤挑取I個獨立生長的菌落加入到三角瓶中，在恆溫振蕩搖床中，26. 5°C，160r/min，搖瓶培養過夜；
(4)、取出搖瓶，取用Iml菌液，用分光光度計在波長為600nm時測定菌液的OD值，當菌液的0D600為I. 0-1. 2時，進行重組質粒的提取和鑑定；
(5)、在超淨工作檯中，用移液器取I.5ml菌液加入I. 5ml Eppendoff管中；
(6)、在高速冷凍離心機中，4°C,12000r/min,離心2min ；
(7)、離心之後,將I.5ml Eppendoff管取出，倒去上清液，將I. 5ml Eppendoff管倒扣在無菌濾紙上吸乾I. 5ml Eppendoff管中的殘留液體；
(8)、向1.5ml Eppendoff 管加入 IOul 懸浮液(葡萄糖 50mmol/L ;Tris-Hcl (PH8. 0)25mmol/L; RNaSeA 0. 2mg/ml)用移液器反覆抽吸混勻，並用渦輪混合儀充分混勻；
(9)、向步驟(8)的I.5ml Eppendoff管中加入5ul溶菌酶(5mg/ml),用移液器反覆抽吸混勻；
(10)、將步驟(9)的1.5mlEppendoff管在室溫條件下,放置3min ；
(11)、將步驟(10)的1.5mlEppendoff管放入沸水中2min後取出；
(12)、將步驟(11)的I.5ml Eppendoff管在高速冷凍離心機中，4°C, 12000r/min,離心2min ；
(13)、將離心之後的上清液取出，存於0.2ml的Eppendoff管中；
(14)、利用瓊脂糖凝膠電泳法對重組的髮根農桿菌A4菌株或15834菌株或根癌農桿菌GV3101菌株中的質粒和未經過轉化的原種髮根農桿菌A4菌株或15834菌株或根癌農桿菌GV3101菌株中的質粒進行區分；
(15)、將步驟(14)中鑑定成功的重組髮根農桿菌A4菌株或15834菌株或根癌農桿菌GV3101菌株中的質粒進行PCR檢測，準確地鑑別陽性克隆。
權利要求
1.一種重組農桿菌質粒快速鑑定方法，其特徵在於該重組農桿菌質粒快速鑑定方法包括以下步驟 (1)、將質粒PCAMBIA1302轉化進入髮根農桿菌A4菌株或15834菌株或根癌農桿菌GV3101菌株後；通過塗布培養的方法，在超淨工作檯中，將轉化後的菌液塗布在攜帶kan抗性的固體LB培養基的培養皿上，將培養皿用封口膜封好，保證無菌條件，將培養皿放在.26. 5 0C，黑暗條件下培養1-2天； (2)、定時觀察塗布培養後培養皿中的菌落生長情況，待轉化後菌落生長到2-3mm時，挑取獨立生長的菌落進行搖瓶培養； (3)、取50ml的三角燒瓶，加入IOml的LB液體培養基和IOul的kan抗生素，用牙籤挑取I個獨立生長的菌落加入到三角瓶中，在恆溫振蕩搖床中，26. 5°C，160r/min，搖瓶培養過夜； (4)、取出搖瓶，取用Iml菌液，用分光光度計在波長為600nm時測定菌液的OD值，當菌液的0D600為I. 0-1. 2時，進行重組質粒的提取和鑑定； (5)、在超淨工作檯中，用移液器取I.5ml菌液加入I. 5ml Eppendoff管中； (6)、在高速冷凍離心機中，4°C,12000r/min,離心2min ； (7)、離心之後,將I.5ml Eppendoff管取出，倒去上清液，將I. 5ml Eppendoff管倒扣在無菌濾紙上吸乾I. 5ml Eppendoff管中的殘留液體； (8)、向1.5ml Eppendoff 管加入 IOul 懸浮液(葡萄糖 50mmol/L ;Tris-Hcl (PH8. 0)25mmol/L; RNaSeA 0. 2mg/ml)用移液器反覆抽吸混勻，並用渦輪混合儀充分混勻； (9)、向步驟(8)的I.5ml Eppendoff管中加入5ul溶菌酶(5mg/ml),用移液器反覆抽吸混勻； (10)、將步驟(9)的I.5ml Eppendoff管在室溫條件下,放置3min ； (11)、將步驟(10)的1.5mlEppendoff管放入沸水中2min後取出； (12)、將步驟(11)的I.5ml Eppendoff管在高速冷凍離心機中，4°C, 12000r/min,離心.2min ； (13)、將離心之後的上清液取出，存於0.2ml的Eppendoff管中； (14)、利用瓊脂糖凝膠電泳法對重組的髮根農桿菌A4菌株或15834菌株或根癌農桿菌GV3101菌株中的質粒和未經過轉化的原種髮根農桿菌A4菌株或15834菌株或根癌農桿菌GV3101菌株中的質粒進行區分； (15)、將步驟(14)中鑑定成功的重組髮根農桿菌A4菌株或15834菌株或根癌農桿菌GV3101菌株中的質粒進行PCR檢測，準確地鑑別陽性克隆。
2.根據權利要求I所述的一種重組農桿菌質粒快速鑑定方法，其特徵在於所述的材料包括 (1)、菌種髮根農桿菌A4菌株、15834菌株(吉林師範大學遺傳生理研究所實驗室保存)、根癌農桿菌GV3101菌株(吉林師範大學遺傳生理研究所實驗室保存)； (2)、質粒pCAMBIA1302(kan抗性)(購自澳大利亞pCAMBIA公司)。
全文摘要
本發明涉及一種農桿菌的鑑定方法，具體的說是一種重組農桿菌質粒快速鑑定方法，可以直接應用於科學研究領域。該鑑定方法包括以下步驟將質粒通過熱激法或電擊轉化法轉入農桿菌，經過攜帶抗生素的固體培養基的塗布培養得到單菌落，挑取單菌落，搖瓶培養，至OD600=1.0-1.2之間，離心，收集菌體，加懸浮液，混勻，加溶菌酶，煮沸1-3min,離心，瓊脂糖凝膠電泳法對重組質粒和空載進行區分，PCR檢測，鑑別陽性克隆。
文檔編號C12Q1/68GK102732604SQ20111009463
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月15日 優先權日2011年4月15日
發明者勾暢, 周曉馥, 未曉巍 申請人:吉林師範大學