一種生物標記物、採樣方法、建模方法及其用途與流程

2023-11-10 09:35:47 2

本發明屬於生物檢測技術領域，具體涉及生物標誌物、採樣方法、建模方法及其用途。

背景技術：

肺癌是目前中國發病率最高的惡性腫瘤之一，其死亡率也居高不下。據中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所陳萬青等發表在國際權威醫學期刊雜誌《ca-cancerjclin》的《2015年中國癌症統計》，2015年中國約有429.2萬癌症新發病例，281.4萬癌症死亡病例。其中，肺癌以新發病例73.3萬例(佔整體17.1％)、死亡病例61萬例(佔整體21.1％)，成為中國人罹癌或因癌致死的最大威脅。

在臨床實踐中，肺癌早期診斷一直是難點，癌症的早期發現對癌症患者的有效治療是非常重要的。肺癌生存率高度依賴於診斷發現的階段，早期診斷從而可以早期治療，將可大大提高5年生存率。目前對於癌症的診斷主要依據臨床症狀、影像學檢測和組織病理學檢查等，但有許多癌症的臨床症狀出現較晚，並且活體取樣檢測也困難，嚴重影響了癌症的早期診斷和病人的預後。相對於組織活檢，血漿、痰液、肺泡灌洗液等標本容易獲得，且對病人也沒有創傷。目前，在外周循環血中，特定蛋白的表達異常、特定基因異常dna甲基化、某些mirna異常表達等等都可能是由癌症導致的。因此對這些特殊因素的分析和檢測也為肺癌的早期診斷提供了幫助。

外周血是機體絕大多數蛋白、因子等的終末匯集處，機體的任何一種損傷或者應激都有可能導致許多蛋白、因子表達不穩定，因此單一檢測外周血中某一種因子對肺癌的診斷的靈敏度和特異性均差強人意。目前臨床上以大分子癌症標記物的單一或聯合使用作為癌症診斷手段的研究較多，而對小分子類癌症標記物缺乏系統深入的探討。

sftpb(surfactantproteinb)的前體pro-sftpb,是由2型肺泡壁細胞和非纖毛細支氣管細胞合成一個親水性的42kd蛋白。合成過程中，pro-sftpb在內質網中迅速被半胱氨酸蛋白酶溶蛋白性裂解，得到一個分泌型的9kd非膠原區疏水性sftpb，這是sftpb的成熟有功能的形式。肺癌細胞，尤其是肺腺癌，通常伴有sftpb合成調節異常，前體轉變為有成熟的疏水形式蛋白的過程減緩，導致pro-sftpb的過表達。研究證實在非小細胞肺癌患者中檢測到循環成熟的sftpb水平高於正常人。sftpb、pro-sftpb可以作為檢測非小細胞肺癌的診斷靶標。

代謝組學是系統生物學中的一個重要組成部分，研究對象是機體內的終端小分子代謝物(通常指分子量小於1000da)的變化規律的科學。其從整體上對某一生物體組分或細胞在一特定生理時期或條件下所有代謝產物同時進行定性和定量分析，儀尋找出目標差異代謝物。可用於疾病早期診斷、藥物靶點發現、疾病機理研究及疾病診斷等。代謝組學分析的樣本主要是尿液和血液，其採集過程對人體無傷害。多胺類化合物是小的陽離子分子，通常認為是與正常細胞和癌細胞調節關鍵代謝酶相關。多胺類小分子包括1,3-丙二胺、腐胺、屍胺、精胺、醯化精胺、精脒、醯化精脒等。在正常的哺乳動物細胞內這類小分子物質是必不可少的，且其含量由一系列複雜的網絡調控，包括合成、降解、和運輸。在上皮性腫瘤中多胺類化合物也收原癌基因和腫瘤抑制基因的調節。目前尚未能有充分證據證實何種多胺為癌症的生物標記物，也無肺癌特異性標記物，這大大影響了肺癌輔助診斷、預後和療效評估指標等。

目前尚未能有充分證據證實sftpb、pro-sftpb和n1，n12-二乙醯精胺在癌症預測中的意義，僅有單個生物標記物對癌症檢測的研究，而其靈敏度和特異性都不高。本發明的這個組合結合了生物標記物的特性，優化組合，從而為癌症預測提供了幫助。

目前僅有對sftpb、pro-sftpb和n1，n12-二乙醯精胺其中某一種生物標記物進行檢測的研究，各指標的檢測手法單一，不能滿足多種樣本類型的需求，且其結果對癌症的預測的靈敏度和特異性均不佳。

技術實現要素：

本發明的目的在於解決現有肺癌診斷標記物單一，靈敏度和特異性均不佳的現狀，提供新型生物標記物、採樣方法、建模方法及其用途。

一種生物標記物，所述標記物為sftpb(surfactantproteinb，表面蛋白b)、pro-sftpb(pro-surfactantproteinb，表面蛋白b前體)、n1，n12-二乙醯精胺(n1，n12-diacetylspermine)的任一種或其組合。

進一步說，當標記物為sftpb和/或pro-sftpb時，採用elisa法、化學發光法、蛋白晶片法、免疫比濁法或免疫層析法進行血漿內含量水平的檢測。

進一步說，當標記物為n1，n12-二乙醯精胺(n1，n12-diacetylspermine)時，採用uhplc-ms/ms、elisa和化學發光法、晶片法、免疫比濁法或免疫層析法進行血漿內含量水平的檢測。

進一步說，使用數學模型來確定所述血漿生物標記物的組合。該數學模型為：

p＝p(e)＝eb0+b1x1+b2x2+b2x3+…+bkxk/(1+eb0+b1x1+b2x2+b2x3+…+bkxk)

＝1/(1+e(b0+b1x1+b2x2+b2x3+…+bkxk))

其中，p為概率。e為分析的個體。p(e)為分析個體發生陽性概率。e為自然數，約等於2.718281828459。b0為回歸係數。bk為第k個因子的係數。k的取值範圍為1至n的整數。

進一步說，使用生物標記物構建肺癌評估模型，其步驟包括：

步驟(1)：收集待檢對象的血漿樣本。

步驟(2)：分別檢測血漿樣本中sftpb、pro-sftpb、n1，n12-二乙醯精胺的含量。

步驟(3)：用步驟(2)測得的數據進行數學模型建立，確定血漿生物標記物組合。其中，數學模型為p＝＝1/(1+e(b0+b1x1+b2x2+b2x3+…+bkxk))。

進一步說，數學模型為生物標記物的組合水平變化，組合後的p值可以提高靈敏度(70-90％)和準確性(70-90％)。

進一步說，本檢測方法及數學模型可用於肺癌的檢測與評估。

進一步說,本發明的目的在於根據現有肺癌診斷技術中存在的創傷大、發現病情晚的問題，提供一種新型肺癌輔助診斷的方法。

本發明技術方案帶來的有益效果

發明解決了現有肺癌診斷是採用的標記物單一而導致的靈敏度和特異性均不佳的現狀。本發明不但提供了一組新型肺癌特異性標記物組合，且該產品的靈敏度和準確性均顯著提高(70-90％)。

進一步說，本發明公開的是一組新型生物標記物，並在此基礎上建立了標記物組合，為臨床醫生對肺癌的診斷提供高精確度的判斷數據。

本發明通過一組生物標記物的檢測和組合為判斷受檢人的患病狀態提供方法，改進了現有肺癌早期篩查精確度低、方法複雜、檢驗周期長等問題。

本發明採用的血漿樣本，取材簡單，克服了傳統檢測方法組織活檢創傷大的問題，同時也消除了由於腫瘤異質性容易產生假陰性結果的弊端。

生物標記物的檢測和組合模型可以提高肺癌診斷的準確性和時效性，為臨床醫生確定病情和開展治療提供科學依據。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明，但本發明的實施方式不限於此。

一種血漿生物標記物，所述標記物為sftpb、pro-sftpb、n1，n12-二乙醯精胺的任一種或其組合。

進一步說，sftpb的示意圖為：

進一步說，sftpb的片段可以是seqid1，seqid2，seqid3，seqid4，seqid5，seqid6，seqid7或seqid8：

seqid1：lseqqfpiplpycwlcralikriqa。

seqid2：pkgalavavaqvcrvvplvaggicqclaerysvilldt。

seqid3：lgrmlpqlvcrlvlrc。

seqid4：rdsechlcmsvt。

seqid5：eqaipqamlqacvgs。

seqid6：kckqfveqhtpqlltlvpr。

seqid7：ahttcqalgvcgt。

seqid8：ssplqci。

進一步說，pro-sftpb的片段為seqid9,seqid10，seqid11,seqid12，seqid13或seqid14：

seqid9：aeshllqwlllllptlcgp。

seqid10：ttsslacaq。

seqid11：pefwcqsleqalqcralghclqevwghvgaddlcqecedivhil。

seqid12：leqecnvlplkllmpqcnqvlddyfplvidy。

seqid13：gicmhlglcks。

seqid14：dplpkplrdplpdplldklvlpvlpgalqar。

血漿生物標記物的採樣方法，當標記物為sftpb和/或pro-sftpb時，採用elisa法、化學發光法、蛋白晶片法、免疫比濁法或免疫層析法進行血漿內含量水平的檢測。

血漿生物標記物的採樣方法，當標記物為n1，n12-二乙醯精胺(n1，n12-diacetylspermine)時，採用uhplc-ms/ms、elisa和化學發光法、晶片法、免疫比濁法或免疫層析法進行血漿內含量水平的檢測。

所述的採樣方法的建模方法，使用數學模型來確定所述血漿生物標記物的組合。該數學模型為：

p＝p(e)＝eb0+b1x1+b2x2+b2x3+…+bkxk/(1+eb0+b1x1+b2x2+b2x3+…+bkxk)

＝1/(1+e(b0+b1x1+b2x2+b2x3+…+bkxk))

其中，p為概率。e為分析的個體。p(e)為分析個體發生陽性概率。e為自

然數，約等於2.718281828459。b0為回歸係數。bk為第k個因子的係數。k的

取值範圍為1至n的整數。

所述的建模方法的用途，使用血漿生物標記物構建肺癌評估模型，其步驟包括：

步驟(1)：收集待檢對象的血漿樣本。

步驟(2)：分別檢測血漿樣本中sftpb、pro-sftpb、n1，n12-二乙醯精胺的含量。

步驟(3)：用步驟(2)測得的數據進行數學模型建立，確定血漿生物標記物組合。其中，數學模型為p＝＝1/(1+e(b0+b1x1+b2x2+b2x3+…+bkxk))。

建模方法的用途，數學模型為生物標記物的組合水平變化，組合後的p值靈敏度提高70-90％，準確性提高70-90％。

建模方法的用途，本檢測方法及數學模型可用於肺癌的檢測與評估。

實施例

受試人樣本中的生物標記物的檢測

步驟1：肺癌與健康人血漿樣本收集方法

收集經病理細胞學證實為肺癌患者55例，其中男性30例，女性25例，年齡28-76歲，平均年齡52歲。對照組55例，均為健康成年人，採用血常規、尿常規等常規檢驗證實，其中男性30例，女性25例，年齡27-66歲，平均51歲。採集8ml肺癌患者及健康人靜脈血於edta抗凝管中，立即於1500rcf離心12min。從離心機中取出採血管，使用一次性移液管將血漿轉移到一個15ml離心管中，儘量多的轉移血漿但不要碰觸到細胞層。離心15ml離心管，1500rcf離心12min。從離心機中取出15ml離心管，使用一次性移液管將3.5ml血漿轉移到一個新的15ml離心管中。

步驟2：肺癌與健康人血漿中n1，n12-二乙醯精胺檢測方法

對步驟1中收集得到的血漿進行n1，n12-二乙醯精胺免疫比濁法分析，檢測方法如下：

(1)r1試劑為n1，n12-二乙醯精胺抗體偶聯在納米顆粒上後添加保護液的試劑。r2試劑為n1，n12-二乙醯精胺通過偶聯試劑偶聯在載體蛋白上後的試劑。

(2)準備50mmph6.0的mes緩衝液，終濃度為1％w/v活化納米顆粒，得到納米顆粒懸液。

(3)每毫升納米顆粒懸液計入20mg的edc，室溫孵育20min。

(4)12000rpm離心30min，用等體積的包被緩衝液(100mmhepesph7.0含n1，n12-二乙醯精胺抗體100μg/ml)懸浮，室溫孵育2-4小時。每毫升反應溶液中加入2.5μl乙醇胺，室溫攪拌孵育10min。

(5)12000rpm離心30min，去上清後用保護液懸浮。

(6)標準品為用水稀釋的n1，n12-二乙醯精胺，濃度梯度依次為0nm、250nm、500nm、750nm和1000nm5個濃度。

(7)將r1、r2試劑和n1，n12-二乙醯精胺標準品放置在生化分析儀相應位置，製作標準曲線。

(8)用全自動生化分析儀檢測步驟1中製得的血漿樣本5μl，加入r1試劑150μl，r2試劑40μl，以第22點作為第一點檢測，第45點為第二檢測，以兩點差值為檢測值，通過標準曲線得出樣本中n1，n12-二乙醯精胺濃度。

以所建立的方法測定55例肺癌患者和55例健康人血漿中n1，n12-二乙醯精胺的含量，每一樣品測試一次。根據標準曲線，計算血漿樣品中n1，n12-二乙醯精胺濃度。

樣本中蛋白質含量檢測方法可以是elisa法、化學發光法、蛋白晶片法、免疫比濁法或免疫層析法。

步驟4：樣本中sftpb含量檢測

以全自動化學發光免疫分析儀(新產業生物，maglumi2000plus)為檢測工具，方法學模式為雙抗體夾心法，即儀器依次加入50μl的樣品、50μl的sftpb單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒以及50μl的sftpb包被的吖啶酯，反應20min後，進行磁分離，儀器將反應混合物送入暗室，依次加入發光底物a液(h2o2)及b液(naoh)進行發光反應，最後記錄發光值。根據標準品得出標準曲線，計算樣本中sftpb含量。

步驟5：樣本中pro-sftpb含量檢測

以全自動化學發光免疫分析儀(新產業生物，maglumi2000plus)為檢測工具，方法學模式為雙抗體夾心法，即儀器依次加入50μl的樣品、50μl的pro-sftpb單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒以及50μl的pro-sftpb包被的吖啶酯，反應20min後，進行磁分離，儀器將反應混合物送入暗室，依次加入發光底物a液(h2o2)及b液(naoh)進行發光反應，最後記錄發光值。根據標準品得出標準曲線，計算樣本中pro-sftpb含量。

對上述因子進行組合

本研究採用受試者工作特徵(receiveroperatorcharacteristic，roc)曲線進行評價。roc曲線是用以評價標誌物的一種重要工具。可以得到的兩個主要指標包括：靈敏度(sensitivity)即真陽性率，評價其在選擇特定疾病病人中的表現，一般要求有高靈敏度以排除沒有疾病的人。特異性(specifictiy)即真陰險率，指示其在正確選擇沒有疾病的人的能力。在診斷中一般要求有高特異性以獲得較低的假陽性率。對這些因子分別進行roc曲線分析，其中縱坐標為靈敏度，橫坐標為1-特異性。

利用數學模型p＝p(e)＝eb0+b1x1+b2x2+b2x3+…+bkxk/(1+eb0+b1x1+b2x2+b2x3+…+bkxk)＝1/(1+e(b0+b1x1+b2x2+b2x3+…+bkxk))對上述因子進行組合計算。

醫生可利用組合得出的數據，結合臨床其他診斷方法，綜合判斷受試者的患病狀況。