一種楊樹膠中特有成分的分離純化方法及應用的製作方法

2023-11-10 00:40:22 1

一種楊樹膠中特有成分的分離純化方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種楊樹膠中特有成分的分離純化方法，其分子式是C6H6O2，通過乙醇超聲提取，去除乙醇，水溶液經石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，減壓蒸出乙酸乙酯，將得到的固體提取物超純水中；將水溶液上樣羥丙基葡聚糖凝膠樹脂柱洗脫，收集洗脫液，蒸乾，再用液相色譜分離純化獲得。本發明的方法可在楊樹膠與蜂膠的真假鑑別中應用。通過與鄰苯二酚標準品對照，根據是否檢測到鄰苯二酚，確定是否含有楊樹膠，從而鑑別蜂膠和楊樹膠，實現蜂膠質量的控制。
【專利說明】一種楊樹膠中特有成分的分離純化方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於蜂膠質量控制方法，涉及一種楊樹膠中特有成分的分離純化方法，並將其應用到蜂膠與楊樹膠的鑑別。
【背景技術】
[0002]蜂膠是工蜂採集植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的一種粘稠物質。從基本組成的角度來看，蜂膠中主要包括大約50%的樹酯和樹香、30%的蜂蠟、10%的芳香揮髮油、5%的花粉以及5%的雜質。其化學成分及其複雜，目前已從蜂膠中分離出包括類黃酮類、萜烯類、酚酸類等化合物600多種。研究表明，蜂膠的化學成分與其地理來源、植物來源、採集蜂種、採膠季節以及採膠方式都有著密切的關係。根據蜂膠的植物來源，已發現的蜂膠主要可以分為五種類型:楊屬型、酒神菊屬型、克魯西屬型、血桐屬型和地中海東部地區型。
[0003]近年來隨著其廣泛的生物活性不斷地被證實，蜂膠也被開發成各種保健藥品用來預防和治療類風溼、關節炎、心臟病、糖尿病以及口腔疾病等，受到了廣大消費者的親睞，也被譽為「紫色黃金」的美稱。然而，蜂膠的生產受到蜂種、採膠方式以及膠源等多個因素的影響，其產量相對較低，一直處於供不應求的狀況。在我國，一些不法商販為了獲取高額的利潤，利用楊樹芽提取物與楊樹型蜂膠提取物在成分、顏色、氣味上及其相似的特點，在蜂膠中摻入不同程度的楊樹膠(楊樹芽提取物)，已達到以次充好的目的，從而嚴重的損害了廣大消費者的權益，極大地擾亂了社會主義市場的經濟秩序。現行蜂膠國家標準，主要應用類黃酮和酚酸兩大類類化合物含量作為評價蜂膠質量好壞的標準，而這兩類分化學成分同時存在於楊樹芽提取物和 楊樹型蜂膠中，使得蜂膠的真假鑑別變得相當困難。本實驗室前期開發的利用HPLC技術測定楊樹芽中標記性成分-水楊苷來判斷蜂膠的真假的方法，由於不法商販利用不同的化學手段，將易被水解的水楊苷成分破壞，從而使得該方法失去了原有的效價。根據近期檢測結果表明，利用該方法對市場上的蜂膠進行檢測，其陽性率顯著下降。因此，急需篩選一種新的標誌成分用來區分蜂膠與楊樹膠。
[0004]通過楊樹膠和大量不同地理來源的楊屬型蜂膠的化學組成進行檢測分析，我們發現楊樹膠中存在蜂膠中不含有的特徵峰，對其進行分離純化，鑑定該峰為鄰苯二酚化合物，其分子式是c6h602。鄰苯二酚也稱兒茶酚是苯的兩個鄰位氫被取代後形成的化合物，在所研究的楊屬植物的芽、葉、花、皮中均有分布。其物理性質極其穩定，可在甲醇、酸性、鹼性以及中性介質中均能穩定存在。在存在多酚氧化酶的條件下，可被氧化為1，2-苯醌，但其所需的氧化酶應具有較強的特異性，即可以氧化具有鄰位二羥基的多酚類化合物。根據相關研究表明，蜜蜂中存在可以氧化鄰苯二酚化合物的多酚類氧化酶，因此我們推測蜜蜂在採集蜂膠以及蜂巢內傳遞蜂膠的過程中，蜜蜂自身腺體分泌的多酚氧化酶將鄰苯二酚大量氧化，從使其在蜂膠中消失；此外，該酶還大量存在於植物組織中，在蜜蜂咀嚼加工蜂膠的過程中能將細胞壁破壞，從而釋放多酚氧化酶，將領苯二酚物質酶解。而且鄰苯二酚標準品易得，價格便宜。因此，本發明選取鄰苯二酚為標誌成分用於區分蜂膠與楊樹膠。[0005]鄰苯二酚的化學結構式:
【權利要求】
1.一種楊樹膠中鄰苯二酚的分離純化方法，鄰苯二酚分子式是C6H6O2，其特徵在於，通過以下步驟實現: Cl)粗提物準備:取楊樹芽，加入100%的乙醇，料液比1: 10，超聲提取30min，提取兩次，過濾合併濾液，向濾液中加入體積比為1:3的超純水，過濾，旋轉蒸發去除乙醇，僅留水溶液； (2)石油醚萃取:將步驟(1)得到的粗提水溶液經過石油醚等體積萃取兩次，上相合併後再經超純水等體積萃取一次後，合併下相溶液； (3)氯仿萃取:將步驟(2)得到的提取液經氯仿溶液等體積萃取兩次，下相合併後再經超純水等體積萃取一次後，合併上相溶液； (4)乙酸乙酯萃取:將步驟(3)得到的提取液經乙酸乙酯溶液等體積萃取兩次，下相合併後再經乙酸乙酯等體積萃取一次後，合併上相溶液； (5)將步驟(4)得到的提取液35°C減壓蒸出溶液中的乙酸乙酯，將得到的固體提取物溶於超純水中，料液比1:10 ; (6)將步驟(5)得到的水溶液上樣羥丙基葡聚糖凝膠樹脂柱，上樣後的羥丙基葡聚糖凝膠樹脂用100%乙醇IOBV洗脫，流速3ml/min，將洗脫液分管收集，每管0.5BV,共收集20管，分別進行未知峰檢測，將富含有未知峰的溶液合併，在旋轉蒸發儀上45°C蒸乾得物質A粗提物；未知峰的出峰時間為12.5min左右； (7)將步驟(6)得到的物質A粗提物溶於超純水中，料液比1:3，採用流動相比例為乙腈:水=5:95等度洗脫的方式，在流速為8.0mL/min，檢測波長為213nm，進樣量為ΙΟμ?，色譜柱為Shrmpack 0DS-C18，色譜條件:20 X 250mm，10Mm，採用半製備型HPLC進行物質A的進一步分 離純化；將純化得到的物質A溶液合併，在旋轉蒸發儀上45°C蒸乾得物質A ； (8)將步驟(7)所得的物質A經過核磁共振、質譜鑑定化學結構以及通高效液相色譜對其進行驗證，與文獻報導進行核實，物質A為鄰苯二酚。
2.根據權利要求1所述的一種楊樹膠中鄰苯二酚的分離純化方法在楊樹膠與蜂膠的真假鑑別中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述鑑別是通過與鄰苯二酚標準品對照，如果在蜂膠樣品中檢測到鄰苯二酚，則表明為楊樹膠或者是摻有楊樹膠的蜂膠，如果沒有檢測到鄰苯二酚，則為蜂膠。
【文檔編號】C07C37/68GK103709013SQ201310721079
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】胡福良, 黃帥, 張翠平, 王凱, 甘禮社 申請人:浙江大學