一類半程電荷匹配兩親性自組裝短肽及其用作納米止血材料及疏水性藥物載體的製作方法

2023-05-01 11:05:21 1

專利名稱：一類半程電荷匹配兩親性自組裝短肽及其用作納米止血材料及疏水性藥物載體的製作方法
技術領域：
本發明屬於納米醫學材料領域，具體涉及一類半程電荷匹配兩親性自組裝短肽及其在作為疏水性藥物載體和止血材料方面的應用。
背景技術：
肽分子自組裝技術是當今生物納米技術當中的一朵奇葩，它已成為分子生物學、 化學、醫學、材料學和工程技術等學科的交匯點，是創造新物質和產生新功能的重要手段。 短肽自組裝後的納米尺寸材料在生產生活中具有廣泛的潛在用途，並已成功應用於納米生物領域特別是細胞工程、組織工程、藥物控釋、再生藥物、膜蛋白及能源工程等。臨床上有很多療效雖好但因溶解度的問題而受到使用限制的藥物，兩親性自組裝短肽材料可以通過與疏水性藥物相互作用提高藥物的水溶性，有望成為一種新型的疏水性藥物載體材料。手術中常見的實質性臟器出血是臨床上面臨的一大難題，如果用常用止血材料按照常用止血方式有時對出血情況很難控制，而且有的止血藥物需要較高的操作技術，止血時間較長，存在不良反應或者併發症，甚至威脅至生命。國內外已有短肽材料與出血點處的血液相互作用快速自組裝成納米纖維水凝膠而起到止血作用的報導，但目前現有技術公開的能自組裝形成納米級水凝膠支架材料的自組裝短肽在結構上多具有全程電荷匹配的特點，即使是近兩年報導出現了半程電荷匹配的兩親性短肽，但也是僅限於有限的一兩條肽序列，本發明設計出了一類半程電荷匹配兩親性短肽，它們的肽鏈結構與已報導的半程電荷匹配兩親性短肽不同(Ruan LP, Zhang HY, Luo HL, et al. Proc Natl Acad Sci U SA. 2009,106(13) 5105-5110;趙曉軍，阮麗萍，張航與，羅涵琳.一種半程電荷匹配九肽及其應用.專利號 CN 100543033C)。

發明內容
本發明的目的在於提供一類半程電荷匹配兩親性自組裝短肽，該類短肽自組裝後形成納米纖維網狀分枝結構，以增加胺基酸構建的自組裝短肽種類，促進自組裝短肽的應用。本發明的目的通過以下技術方案實現一類半程電荷匹配兩親性自組裝短肽，其胺基酸序列的通式如下Ac-Pro-X1-Phe-X2-Phe-X3-Phe-Glu-Pro-NH2Ac為乙醯化N端，NH2*氨基化C端，其中Xp &為極性不帶電荷胺基酸，X3為帶正電荷的胺基酸，Xp X2 J3全為L型胺基酸，X1J2為相同或不同胺基酸均可。優選地，所述極性不帶電荷胺基酸為Thr、Ser, Cys或Asn。優選地，所述帶正電荷的胺基酸為Arg或His。其自組裝原理是短肽分子間通過非共價鍵相互作用自發組合形成一種結構明確、 構造穩定、具有某種理化性能的分子聚集體或超分子結構，帶電荷胺基酸的引入是為了產生電荷匹配形成反平行纏繞。本發明所述的短肽可採用固相多肽合成方法進行合成和生產以Fmoc保護的胺基酸為原料，Rink Amide-MBHA Resin (瑞克醯胺-MBHA樹脂)為載體，20%哌啶/DMF溶液為脫保護劑，HBTU為肽鍵縮合劑，50%醋酐/吡啶(V V)溶液為氨基末端的乙醯化溶劑， 按已知序列從C端到N端的順序依次偶聯合成，氨基末端乙醯化。合成結束取下反應瓶，用甲醇衝洗樹脂8次，除去DMF。氮氣吹乾後用TFA強酸裂解液將合成多肽從樹脂上裂解下來，同時脫去所有保護基團。反應結束後收集溶有合成肽的裂解液，然後減壓過濾，收集濾液，用冷乙醚沉澱溶解在濾液中的多肽，即得合成肽的粗品。合成肽粗品經高壓液相反相層析柱分離純化，收集主峰，冷凍乾燥後，得到目標合成短肽。本發明所述的半程電荷匹配兩親性自組裝短肽應用於疏水性藥物載體材料和納米止血材料中。短肽自組裝過程中與疏水性物質相互作用，可提高疏水性物質的水溶性，從而能夠成為一種新型的疏水性藥物載體。實驗還表明將兩親性短肽的凍乾粉末或不同質量體積比的肽水溶液作用於受損傷動物軟組織切面後，立即形成為水凝膠，封閉出血口，起到快速止血和傷口護理的效果，而且短肽組成為天然胺基酸，在體內易於降解，產物無免疫原性，組織相容性好，因此通過添加藥學上可接受的穩定劑或賦形劑可將短肽材料製備成一種適於臨床上使用的納米止血藥物。本發明具有以下有益之處1、提供了一類結構新穎的半程電荷匹配兩親性短肽，豐富了自組裝短肽納米材料的種類，所述的兩親性短肽既可作為疏水性藥物的載體材料而提高其水溶性，又可通過自組裝形成納米級纖維屏障，作為出血創面的納米止血材料，能起到快速止血和傷口護理的效果。2、本發明所述的兩親性自組裝短肽材料生產工藝簡單可行、成本相對較低，其應用不僅能豐富現有的納米醫藥材料種類，而且對人類生命健康具有重要意義。


圖1是本發明所述的半程電荷匹配兩親性短肽①樣品的高效液相(HPLC)色譜圖， 結果顯示它的純度>95%。圖2是本發明所述的半程電荷匹配兩親性短肽①樣品的質譜(MS)圖，結果顯示它的分子量為1195. 7，這與它的理論值(1195. 3)非常相近。圖3是本發明所述的半程電荷匹配兩親性短肽①樣品的三維分子結構模型示意圖，採用的是MDL ISIS Draw 2. 5軟體基於能量最低原則繪製。圖4是本發明所述的半程電荷匹配兩親性短肽①樣品在25°C下的圓二色(⑶)光譜圖。圖5是本發明所述的半程電荷匹配兩親性短肽①樣品經過超聲後25°C下的圓二色光譜圖。圖6是本發明所述的半程電荷匹配兩親性短肽①樣品超純水溶液在原子力顯微鏡下的形貌圖。圖7是本發明所述的半程電荷匹配兩親性短肽①樣品與疏水性藥物模型芘超聲後在原子力顯微鏡下的形貌圖。
圖8是本發明所述的半程電荷匹配兩親性短肽①樣品超純水溶液的透射電鏡圖。 用超純水將其配製成為0. 3mg/ml，採用磷鎢酸負染法製備樣品，圖中顯示的形貌與原子力顯微鏡下所觀察到的形態結構相吻合。圖9是0. 4mg/ml的芘水溶液於磁力攪拌器上攪拌三天後在原子力顯微鏡下觀看到的形貌圖。圖10是本發明所述的半程電荷匹配兩親性短肽①樣品用於SD大鼠肝切面的止血實驗圖。將1 % (w/v)肽水液注入傷口表面，立即形成一透明的凝膠狀物質，封閉出血口，達到迅速止血的目的。
具體實施例方式為了更好的理解本發明，下面結合實施例對本發明作進一步說明，實施例是對本發明的更進一步的解釋，但本發明要求保護的範圍並不局限於實施例表示的範圍。實施例1當&為Thr，X2為Asn，X3為Arg時，序列如下① CH3CO-Pro-Thr-Phe-Asn-Phe-Arg-Phe-Glu-Pro-NH2自組裝短肽①的合成1、材料Fmoc-Pro-OH (N-芴甲氧羰基-脯氨酸)、Fmoc-Thr (tBu) -0H (芴甲氧羰基 _0_ 叔丁基-蘇氨酸)、Fmoc-Phe-OH (N-芴甲氧羰基-苯丙氨酸)、Fmoc-Asn (Trt) -OH (芴甲氧羰基-N-三苯甲基-天冬醯胺)、Fmoc-Glu (OtBu) -OH(芴甲氧羰基_0_叔丁基-穀氨酸)、 Fmoc-Arg (pbf) -OH (N-芴甲氧羰醯基-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯並呋喃-5-磺醯-精氨酸)、Rink Amide-MBHA Resin (樹脂)、HBTU(0-苯並三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT(1-羥基苯並三氮唑)購自上海吉爾生化有限公司。哌啶、醋酸酐、DMF(N、 N- 二甲基甲醯胺)、TFA(三氟乙酸)、NMM(N-甲基嗎啉)、乙醚、甲醇和DCM( 二氯甲烷)購自天津市富宇精細化工有限公司。2、製備方法採用Fmoc (芴甲氧羰基)保護的固相合成法，其工藝步驟如下(1)稱取 20g 0. 5mmol/g 的 Rink Amide-MBHA Resin 於肽合成器皿中，取 200ml DMF溶漲樹脂30min，然後抽濾，再取用300ml DMF洗滌樹脂，分三次進行，每次的洗滌時間為anin，抽濾乾洗滌液後向肽合成器中加入100ml20%哌啶/DMF(V V)震蕩反應30min， 反應結束後，再抽濾出反應液，再用400ml DMF分四次洗滌樹脂，洗畢後取少量樹脂做茚三酮檢測試驗，樹脂呈陽性，向肽合成器皿中加入以下原料
Fmoc -Pro-OH
13.49g 15.16g 5.40g 4.39ml 160ml
HBTU
HOBT
NMM
DMF
上所述原料加完後，震蕩反應30min，反應結束後，用300ml DMF分四次洗滌樹脂， 每次洗滌時間2分鐘，取少許樹脂做茚三酮試驗檢測，樹脂呈陰性。(2)向肽合成器皿中加入5ml 20%哌啶/DMF (V V)震蕩反應30min，反應結束後抽濾出反應液，再用40ml DMF分四次洗滌樹脂，洗畢取少許樹脂做茚三酮試驗檢測，結果樹脂呈陽性，向反應器皿中加入以下原料
權利要求
1.一類半程電荷匹配兩親性自組裝短肽，其特徵在於，其胺基酸序列的通式如下 Ac-Pro-X1-Phe-X2-Phe-X3-Phe-Glu-Pro-NH2其中W為極性不帶電荷胺基酸，&為帶正電荷的胺基酸，X1^2J3全為L型胺基酸。
2.根據權利要求1所述短肽，其特徵在於，所述極性不帶電荷胺基酸為Thr、Ser,Cys 或 Asn0
3.根據權利要求1或2所述短肽，其特徵在於，所述帶正電荷的胺基酸為Arg或His。
4.權利要求1 3任意一項中所述短肽在作為疏水性藥物載體材料中的應用。
5.權利要求1 3任意一項中所述短肽在作為納米止血材料中的應用。
全文摘要
本發明公開了一類半程電荷匹配兩親性自組裝短肽，其特徵在於，其胺基酸序列的通式如下Ac-Pro-X1-Phe-X2-Phe-X3-Phe-Glu-Pro-NH2，其中X1、X2為極性不帶電荷胺基酸，X3為帶正電荷的胺基酸，X1、X2、X3全為L型胺基酸。本發明所述的半程電荷匹配兩親性短肽既可作為疏水性藥物的載體材料而提高其水溶性，又可通過自組裝形成納米級纖維屏障，作為出血創面的納米止血材料。本發明所述的一類半程電荷匹配兩親性自組裝短肽納米材料生產工藝簡單可行、成本相對較低，其應用不僅能豐富現有的納米醫藥材料種類，而且對人類生命健康具有重要的現實意義。
文檔編號C07K7/06GK102199195SQ20111005306
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月7日 優先權日2011年3月7日
發明者何道航, 唐麗麗 申請人:華南理工大學