基於金納米糰簇的脲酶活性螢光測定方法
2023-04-30 19:00:41 2
基於金納米糰簇的脲酶活性螢光測定方法
【專利摘要】本發明公開一種基於金納米糰簇的脲酶活性螢光測定方法，其特徵是利用脲酶特異性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高體系的pH值，使N-乙醯-L-半胱氨酸保護的金納米糰簇的螢光發生猝滅，從而表現出螢光發射光譜特徵的變化，可以用於脲酶活性的測定。在2.2~44U/L範圍內F65。與脲酶濃度呈線性關係，檢測限為0.55U/L。本發明靈敏度高，重現性好，可用於幽門螺旋桿菌的測定。
【專利說明】基於金納米糰簇的脲酶活性螢光測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及以N-乙醯-L-半胱氨酸保護的金納米糰簇為螢光探針的脲酶活性測 定方法，屬於分析化學及納米【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 脲酶（urease)是一種含鎳的寡聚酶，它能高效、特異性催化尿素水解生成二氧化 碳和氨。醫學上，細菌脲酶是一種不容忽視的致病因素，它可誘發許多疾病，如腎盂腎炎、肝 昏迷、消化性潰瘍和感染性尿路結石等。農業上，當土壤脲酶的活性過高時，化肥中的尿素 被迅速分解生成氨，排放到大氣中，造成經濟損失及環境汙染。另外，豆類製品如豆奶、代乳 粉等，如含有脲酶對人體有害，會引起腹瀉等症狀，故在製造工藝中，要除去脲酶。由上可 見，脲酶活性的測定在醫學、農業和食品等領域具有重要的意義。
[0003] 金納米糰簇（gold nanoclusters, Au NCs)是一種新型的突光納米材料，由幾個 到幾百個原子組成，尺寸接近於電子的費米波長(約0.7 nm)。由於量子尺寸效應，金納米 團簇顯示出獨特的光學特性。螢光金納米糰簇具有尺寸小、無毒、水溶性好、光穩定性好、 Stokes位移大、比表面積大、製備條件溫和、表面易於修飾以及螢光性質隨尺寸可調等突出 優點，是近年來的研究熱點，其已被廣泛應用於催化、傳感檢測、納米標記、醫學成像和光電 子學等領域。
[0004] 本發明以N-乙醯-L-半胱氨酸保護的金納米糰簇作為螢光探針，提供了一種簡 便、靈敏的脲酶檢測新方法。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種以N-乙醯-L-半胱氨酸保護的金納米糰簇為螢光pH探 針的脲酶活性測定方法。
[0006] 為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案： 本發明所述的基於金納米糰簇的脲酶活性螢光測定方法，其特徵是利用脲酶特異性催 化尿素生成氨和二氧化碳的體系，新生成的氨能提高所述體系的pH值，使N-乙醯-L-半胱 氨酸保護的金納米糰簇的螢光發生猝滅，從而表現出螢光發射光譜特徵的變化，能用於脲 酶活性的測定。
[0007] 所使用的N-乙醯-L-半胱氨酸保護的金納米糰簇採用N-乙醯-L-半胱氨酸還 原氯金酸的方法製備：將濃度為〇. 02~0. 18 mol/L的N-乙醯-L-半胱氨酸溶液和濃度為 0. 1~0. 8 mol/L的氫氧化鈉溶液加入到濃度為0. 01~0. 1 g/L的氯金酸溶液中，混勻，置於 2(T70° C水浴恆溫反應(Γ3. 5小時，反應結束後用截留分子量為3500的透析袋對反應液 進行透析純化處理，得到Ν-乙醯-L-半胱氨酸-金納米糰簇螢光材料水溶液。
[0008] 所使用的Ν-乙醯-L-半胱氨酸保護的金納米糰簇採用Ν-乙醯-L-半胱氨酸還原 氯金酸的方法製備：將0.6 mL濃度為0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0.4 mL濃度為0.02 g/ L的氯金酸溶液加入到4 mL濃度為0. 08 mol/L的N-乙醯-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置 於37° C恆溫水浴槽中反應2.5 h，反應液由淺黃色變為無色，反應結束後用截留分子量為 3500的透析袋對反應液進行純化處理，純化後的金納米糰簇溶液放置於4° C冰箱避光保 存。
[0009] 利用N-乙醯-L-半胱氨酸保護的金納米糰簇在650 nm處的發射光強度值（F65Q) 以判斷脲酶含量，所使用的激發波長為355 nm。
[0010] 將不同濃度ρΗ=6· 0的脲酶溶液加入到(Γ2· 5 mol/L、ρΗ=6· 0的尿素溶液中，混 合均勻後在25° C的恆溫水浴槽中反應(Γ50 min，測定發射光強度值F65(l，在脲酶濃度為 2. 2~44 U/L的範圍內其發射光強度值F65(l與脲酶濃度呈線性關係，檢測限為0. 55 U/L。
[0011] 所述尿素的濃度優選為1 mol/L，反應時間優選為40 min。
[0012] 金納米糰簇溶液，脲酶溶液和尿素溶液按體積比為4 :1 :4混合，反應總體積為 0· 45 mL〇
[0013] 本發明所述的基於金納米糰簇的脲酶活性螢光測定方法，包括如下步驟：取適量 人胃組織，加入2 mL濃度為1 mol/L、pH=6. 0的尿素溶液中，混合均勻後在25° C的恆溫 水浴槽中反應40 min，取0.25 mL上述反應液，加入0.2 mL N-乙醯-L-半胱氨酸保護的金 納米糰簇溶液，在25° C的恆溫水浴槽中反應3 min，測定發射光強度值F65(l以定性判斷胃 組織是否存在幽門螺旋桿菌。
[0014] 所使用的N-乙醯-L-半胱氨酸保護的金納米糰簇採用N-乙醯-L-半胱氨酸還原 氯金酸的方法製備：將0.6 mL濃度為0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0.4 mL濃度為0.02 g/ L的氯金酸溶液加入到4 mL濃度為0. 08 mol/L的N-乙醯-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置 於37° C恆溫水浴槽中反應2.5 h，反應液由淺黃色變為無色，反應結束後用截留分子量為 3500的透析袋對反應液進行純化處理，純化後的金納米糰簇溶液放置於4° C冰箱避光保 存。
[0015] 具體地說，本發明採用的技術方案為： (一）金納米糰簇螢光材料的製備 以下過程中使用的所有玻璃器皿均經過王水浸泡，並用雙蒸水徹底清洗，晾乾。金納米 團簇螢光材料的製備方法如下：將0. 6 mL濃度為0. 5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0. 4 mL濃 度為0. 02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL濃度為0. 08 mol/L的N-乙醯-L-半胱氨酸溶液 中，混勻，置於37° C恆溫水浴槽中反應2. 5小時，反應液由淺黃色變為無色。反應結束後 用分子量為3500的透析袋對反應液進行純化處理，純化後的金納米糰簇溶液放置於4° C 冰箱避光保存。
[0016](二）脲酶活性的測定： 脲酶活性的測定分兩步進行：（一）將〇. 05 mL脲酶樣品溶液（pH=6. 0緩衝液溶解）加 入到0. 2 mL濃度為1 Μ的尿素溶液（pH=6. 0)中，混合均勻後在25 ° C的恆溫水浴槽中反 應40 min;(二）將0.2 mL的金納米糰簇溶液加入到第一步反應後的溶液中，在25° C的 恆溫水浴槽中反應3 min,在355nm激發波長下測定650 nm處的突光強度值（F65CI)，通過標 準曲線進行脲酶活性的測定。
[0017] 本發明的優點： (1)本發明基於脲酶特異性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高體系的pH 值，使N-乙醯-L-半胱氨酸保護的金納米糰簇的螢光發生猝滅，從而表現出螢光發射光譜 特徵的變化，可以用於脲酶活性的檢測。
[0018] (2)本發明所使用的金納米糰簇直接由N-乙醯-L-半胱氨酸還原氯金酸得到，無 需進行進一步的修飾，製備過程簡單快速。
[0019] (3)本發明的檢測靈敏度高，螢光分光光度計測定的檢測限為0. 55 U/L。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1為金納米糰簇溶液在紫外燈下的外觀圖。圖中：（A)空白對照組；（B)脲酶組 (脲酶濃度為22 U/L)。
[0021] 圖2為金納米糰簇溶液的發射光譜圖。圖中：（A)空白對照組，為上方的曲線；（B) 脲酶組(脲酶濃度為22 U/L)，為下方的曲線。
[0022] 圖3為不同濃度尿素條件下金納米糰簇溶液與脲酶催化反應液(脲酶濃度為22 U/L)作用後發射光強度（F65CI)變化值（AF65(I)關係圖。
[0023] 圖4為在金納米糰簇溶液中加入脲酶和尿素後，螢光發射光強度隨時間的變化 圖。
[0024] 圖5為金納米糰簇溶液與脲酶催化反應液(含不同濃度脲酶)作用後的螢光發射光 譜圖。
[0025] 圖6為金納米糰簇溶液的發射光強度值（F65CI)與脲酶濃度之間的關係圖。
[0026] 圖7為金納米糰簇溶液的發射光強度值（F65CI)與脲酶濃度之間的線性關係圖。圖 8為金納米糰簇溶液用於胃組織幽門螺旋桿菌測定結果圖。
【具體實施方式】
[0027] 實例 1 : 將0. 6 mL濃度為0. 5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0. 4 mL濃度為0. 02 g/L的氯金酸溶 液加入到4 mL濃度為0. 08 mol/L的N-乙醯-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置於37° C恆溫 水浴槽中反應2.5 h。反應結束後用截留分子量為3500的透析袋對反應液進行純化處理。 所得到的金納米糰簇溶液可見光下為無色，紫外燈照射下產生強烈的紅色螢光。4° C暗處 保存，能保持至少一個月的相對穩定。
[0028] 實例 2 : 將0. 05 mL濃度為22 U/L的脲酶溶液（pH=6. 0)加入到0. 2 mL濃度為1 mol/L的尿 素溶液（pH=6. 0)中，混合均勻後在25° C的恆溫水浴槽中反應40 min。將0. 2 mL的實例 1製備的金納米糰簇溶液加入到上述溶液中，在25° C的恆溫水浴槽中反應3 min。設置一 組無脲酶的空白對照組。反應結束後，在紫外燈下觀察，空白對照組顯現紅色螢光（圖1中 的A)，而加入22 U/L的脲酶的金納米糰簇的紅色螢光發生猝滅（圖1中的B)。圖2為空白 對照組和脲酶組金納米糰簇溶液的螢光發射光譜圖。
[0029] 實例 3 : 將0.05 mL濃度為22 U/L的脲酶溶液（pH=6.0)加入到0. 2 mL不同濃度的尿素溶液 (pH=6. 0)中，混合均勻後在25° C的恆溫水浴槽中反應40 min。將0. 2 mL的實例1所制 得的金納米糰簇溶液加入到上述溶液中，在25° C的恆溫水浴槽中反應3 min，測定發射光 強度值F65(l。由圖3可知，當尿素濃度為lmol/L時，螢光猝滅值AF65(I達到最大。
[0030] 實例 4 : 將0. 05 mL濃度為22 U/L的脲酶溶液（pH=6. 0)加入到0. 2 mL濃度為1 mol/L的尿 素溶液（pH=6. 0)中，混合均勻後在25° C的恆溫水浴槽中反應(Γ50 min。將0. 2 mL的實 例1所製得的金納米糰簇溶液加入到上述溶液中，在25° C的恆溫水浴槽中反應3 min，測 定發射光強度值F65(l。由圖4可知，F65(l在40 min後達到穩定。
[0031] 實例 5: 將0. 05 mL不同濃度的脲酶溶液（pH=6. 0)加入到0. 2 mL濃度為1 mol/L的尿素溶液 (pH=6. 0)中，混合均勻後在25° C的恆溫水浴槽中反應40 min。將0. 2 mL的實例1所制 得的金納米糰簇溶液加入到上述溶液中，在25° C的恆溫水浴槽中反應3 min，測定發射光 強度值F65(l。由圖5可知，隨著脲酶濃度的增大，金納米糰簇的螢光逐漸受到抑制，F 65(l逐漸 減小(見圖6)。如圖7所示，在2.2~44 U/L範圍內^5(|與脲酶濃度呈線性關係，檢測限為 0·55 U/L。
[0032] 實例 6 : 將0. 05 mL濃度為11 U/L的脲酶溶液（pH=6. 0)加入到0. 2 mL濃度為1 mol/L的尿 素溶液（pH=6. 0)中，混合均勻後在25° C的恆溫水浴槽中反應40 min。將0. 2 mL的實例 1所製得的金納米糰簇溶液加入到上述溶液中，在25° C的恆溫水浴槽中反應3 min，測定 發射光強度值F65Q。重複上述實驗12次，得相對標準偏差（RSD)為3. 2%，表明本方法重現性 良好。
[0033] 實例 7 : 取10 mg人胃組織，加入2 mL濃度為1 mol/L的尿素溶液（pH=6.0)中，混合均勻後在 25° C的恆溫水浴槽中反應40 min。取0. 25 mL上述反應液，加入0. 2 mL實例1製得的金 納米糰簇溶液，在25 ° C的恆溫水浴槽中反應3 min，測定發射光強度值F65(l。實驗結果如 圖8,由圖可知，本方法可用於人胃組織幽門螺旋桿菌的測定。
【權利要求】
1. 一種基於金納米糰簇的脲酶活性螢光測定方法，其特徵是利用脲酶特異性催化尿素 生成氨和二氧化碳的體系，新生成的氨能提高所述體系的pH值，使N-乙醯-L-半胱氨酸保 護的金納米糰簇的螢光發生猝滅，從而表現出螢光發射光譜特徵的變化，能用於脲酶活性 的測定。
2. 根據權利要求1所述的基於螢光金納米糰簇的脲酶抑制劑測定方法，其特徵是所使 用的N-乙醯-L-半胱氨酸保護的金納米糰簇採用N-乙醯-L-半胱氨酸還原氯金酸的方法 製備 ：將濃度為0.02、.18 111〇1/1的^乙醯-1^-半胱氨酸溶液和濃度為0.廣0.8 111〇1/1的 氫氧化鈉溶液加入到濃度為〇. 〇l~〇. 1 g/L的氯金酸溶液中，混勻，置於2(T70° C水浴恆溫 反應(Γ3. 5小時，反應結束後用截留分子量為3500的透析袋對反應液進行透析純化處理， 得到Ν-乙醯-L-半胱氨酸-金納米糰簇螢光材料水溶液。
3. 根據權利要求2所述的基於金納米糰簇的脲酶活性螢光測定方法，其特徵是所使用 的Ν-乙醯-L-半胱氨酸保護的金納米糰簇採用Ν-乙醯-L-半胱氨酸還原氯金酸的方法制 備：將0. 6 mL濃度為0. 5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0. 4 mL濃度為0. 02 g/L的氯金酸溶液 加入到4 mL濃度為0. 08 mol/L的N-乙醯-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置於37° C恆溫水 浴槽中反應2. 5 h，反應液由淺黃色變為無色，反應結束後用截留分子量為3500的透析袋 對反應液進行純化處理，純化後的金納米糰簇溶液放置於4° C冰箱避光保存。
4. 根據權利要求2或3所述的基於金納米糰簇的脲酶活性螢光測定方法，其特徵是利 用N-乙醯-L-半胱氨酸保護的金納米糰簇在650 nm處的發射光強度值（F65CI)以判斷脲酶 含量，所使用的激發波長為355 nm。
5. 根據權利要求4所述的基於金納米糰簇的脲酶活性螢光測定方法，其特徵是將不同 濃度pH=6. 0的脲酶溶液加入到(Γ2. 5 mol/L、pH=6. 0的尿素溶液中，混合均勻後在25° C 的恆溫水浴槽中反應(Γ50 min，測定發射光強度值F65(l，在脲酶濃度為2. 2~44 U/L的範圍 內其發射光強度值F65(l與脲酶濃度呈線性關係，檢測限為0. 55 U/L。
6. 根據權利要求4所述的基於金納米糰簇的脲酶活性螢光測定方法，其特徵是尿素的 濃度優選為1 mol/L，反應時間優選為40 min。
7. 根據權利要求4所述的基於金納米糰簇的脲酶活性螢光測定方法，其特徵是金納米 團簇溶液，脲酶溶液和尿素溶液按體積比為4 :1 :4混合，反應總體積為0. 45 mL。
8. -種基於金納米糰簇的脲酶活性螢光測定方法，包括如下步驟：取適量人胃組織， 加入2 mL濃度為1 mol/L、pH=6. 0的尿素溶液中，混合均勻後在25° C的恆溫水浴槽中反 應40 min，取0.25 mL上述反應液，加入0.2 mL N-乙醯-L-半胱氨酸保護的金納米糰簇溶 液，在25° C的恆溫水浴槽中反應3 min，測定發射光強度值F65(l以定性判斷胃組織是否存 在幽門螺旋桿菌。
9. 根據權利要求8所述的基於金納米糰簇的脲酶活性螢光測定方法，其特徵是所使用 的N-乙醯-L-半胱氨酸保護的金納米糰簇採用N-乙醯-L-半胱氨酸還原氯金酸的方法制 備：將0. 6 mL濃度為0. 5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0. 4 mL濃度為0. 02 g/L的氯金酸溶液 加入到4 mL濃度為0. 08 mol/L的N-乙醯-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置於37° C恆溫水 浴槽中反應2. 5 h，反應液由淺黃色變為無色，反應結束後用截留分子量為3500的透析袋 對反應液進行純化處理，純化後的金納米糰簇溶液放置於4° C冰箱避光保存。
【文檔編號】G01N21/64GK104215617SQ201410466703
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月13日 優先權日:2014年9月13日
【發明者】陳偉, 鄧豪華, 吳鋼偉, 劉銀環, 彭花萍 申請人:福建醫科大學